Методическая статья

Выделение Рибосома связанных стадии становления Полипептиды

DOI:

10.3791/4026

⸱

6 июля 2012 г.

 , 
1Center for Gene Regulation in Health and Disease, Department of Biological, Geological and Environmental Sciences, Cleveland State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Техника для определения поступательного сайтов паузу на мРНК описано. Эта процедура основана на выделении зарождающейся полипептидов накопления на рибосомы в процессе искусственного перевода целевой мРНК, а затем размер анализ зарождающейся цепи использованием денатурирующих гель-электрофореза.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Скорость трансляционной элонгации неоднородна. Вторичная структура мРНК, использование кодонов и ассоциированные с мРНК белки могут изменять перемещение рибосомы по матрицедля обзора см. 1. Однако в настоящее время общепризнано, что основным фактором неоднородности скорости трансляционной элонгации является использование синонимичных кодонов1. Синонимичные кодоны используются с разной частотой. Существует систематическое предпочтение определенных синонимичных кодонов, при этом некоторые из них используются чаще других2. Кодонный перекос специфичен как для конкретного организма, так и для конкретной ткани2,3. Более того, частота использования кодонов прямо пропорциональна концентрации соответствующих им когнатных тРНК4. Таким образом, часто используемый кодон будет иметь большее количество соответствующих тРНК, что означает, что часто встречающийся кодон будет транслироваться быстрее, чем редко встречающийся. Следовательно, участки мРНК, обогащенные редкими кодонами (потенциальные сайты паузы), как правило, замедляют движение рибосомы по матрице и вызывают накопление нативных пептидов соответствующих размеров5-8. Эти сайты паузы могут оказывать функциональное влияние на экспрессию белка, стабильность мРНК и фолдинг белкадля обзора см. 9. Действительно, было показано, что устранение таких сайтов паузы может изменить движение рибосомы по мРНК и, следовательно, повлиять на эффективность котрансляционного (in vivo) фолдинга белка1,7,10,11. Чтобы понять процесс фолдинга белка in vivo в клетке, который в конечном счете сопряжен с процессом синтеза белка, крайне важно получить исчерпывающее представление о влиянии использования кодонов/состава тРНК на движение рибосом вдоль мРНК во время трансляционной элонгации.

Здесь мы описываем простой метод, который можно использовать для определения основных сайтов паузы трансляции для конкретной мРНК, транслируемой в различных бесклеточных системах6-8. Данная процедура основана на выделении растущих полипептидов, накапливающихся на рибосомах в ходе трансляции целевой мРНК in vitro. Обоснование заключается в том, что на кодонах с низкой частотой встречаемости увеличение времени пребывания рибосом приводит к накоплению большего количества растущих пептидов соответствующего размера. Для реакций трансляции in vitro используется мРНК, синтезированная in vitro, в присутствии радиоактивно меченных аминокислот, что позволяет детектировать растущие цепи. Для выделения связанных с рибосомами комплексов растущих полипептидов реакционную смесь наслаивают на 30% раствор глицерина с последующим центрифугированием. Растущие полипептиды в полисомальном осадке затем обрабатывают рибонуклеазой А и разделяют с помощью SDS-PAGE. Этот метод потенциально может быть применен к любому белку и позволяет анализировать движение рибосом по мРНК и определять основные сайты паузы. Кроме того, данный протокол может быть адаптирован для изучения факторов и условий, которые могут изменять движение рибосом и, следовательно, потенциально влиять на функцию или конформацию белка.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка шаблона ДНК и транскрипции в пробирке

  1. Гена, клонируют в Т7 и / или, например, SP6 транскрипционный промотор.
  2. Ибо в пробирке транскрипции ДНК-матрицы линеаризуется с соответствующим ферментом ограничение резки ниже по течению от кодона ORF остановки и / или мРНК 3 'конца. Надо проверить полную линеаризации плазмиды ДНК, запустив продукт рестрикцией на геле агарозы.
  3. Линеаризованной плазмиды используются для реакции в пробирке транскрипции. Различные концентрации ДНК-матрицы могут быть проверены, чтобы определить оптимальную концентрацию ДНК, необходимые для транскрипции в пробирке. Как правило, с высокой MEGAscript Ambion в транскрипции выход Kit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 мкг линеаризованной ДНК дает 40-60 мкг мРНК. В пробирке транскрипции осуществляется после инструкции производителя (Ambion / Life Technologies, Grand Islanг, Нью-Йорк).
  4. После транскрипции в пробирке мРНК очищают осаждения лития хлорид в соответствии с инструкцией завода-изготовителя (MEGAscript высокой Ambion в транскрипции выход Kit).
  5. мРНК целостность далее проверена с помощью электрофореза на агарозном акриламида или гели.

2. В пробирке Сотовые Переводчик

Для перевода в пробирке с помощью R abbit R eticulocyte лизата, РРЛ (Promega, Madison, WI) выполните следующие действия:

  1. Подготовить 100 мкл в инструкции пробирке перевод реакции следующих производителей. Короче говоря, в нуклеазы свободной воды добавить 2 мкл смеси аминокислот минус метионин (1 мм), 10 единиц ингибитора РНКазы (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 мкКи радиоактивных [35 S]-метионина (MP Biomedicals, Солон, Огайо), 70 мкл лизата ретикулоцитов кролика (Promega, Madison, WI).
  2. Инкубируйте йэлектронная реакции при 30 ° С в течение 5 минут предварительно теплой перевод реакции. Добавить 2 мкг мРНК реакции переводе и инкубировать при температуре 30 ° С в течение 5 мин.
  3. Остановить реакцию путем размещения перевод реакции на льду.

3. Выделение стадии становления полипептидов из реакции в пробирке перевода

  1. Чтобы изолировать рождающегося полипептида связан с рибосомами (polysome), перевод реакции на верхнем уровне 4,5 мл 30% глицерина в 10 мМ Трис-HCl буфере рН 7,6, содержащего 100 мМ KCl, 10 мМ MgCI 2, и центрифугировали при 100000 X г в TLA-110 ротора (Beckman Coulter, Inc, Brea, Калифорния) в течение 1 часа при температуре 4 ° C.
  2. Супернатант далее тщательно удалены.
  3. Polysomal гранул содержащих зарождающейся полипептидов ресуспендируют в небольшом объеме (10-15 мкл) 1 мМ Трис-HCl буфере рН 7,6, содержащий 0,5 мг / мл рибонуклеазы (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), и инкубировали в течение 30 мин при 37 ° C. В порядкедля повышения гидролиза пептидил-тРНК эфирную связь, NaOH добавляют до конечной концентрации 10 мМ и инкубацию продолжали еще 30 мин.

В пробирке перевод реакцию собравшихся без мРНК и осуществляется на тех же условиях (с последующим выделением зарождающейся пептидов, как было описано) будет выступать в качестве основного контроля. Лечение перевод реакции (ы) с пуромицином до подвергая экстракт центрифугирования в градиенте плотности может служить в качестве дополнительного контроля.

4. Решение рождающегося полипептида на Трис-tricine SDS PAGE

  1. Изолированной зарождающейся полипептиды решены и проанализированы на Трис-tricine SDS-PAGE. Пожалуйста, обратите внимание, что количество материала загружается на гель будет зависеть от эффективности белка маркировки, эффективность перевода на белки и многие другие параметры. Количество загруженного материала должна быть скорректирована эмпирически, чтобы бест визуализации и разделения отдельных зарождающейся полипептидной цепи.
  2. После электрофореза гель фиксированы, сушат вакуум гель красильщика и подвергали авторадиографии. Распределение зарождающейся полипептиды, наблюдаемые с помощью phosphoimaging.

5. Представитель Результаты

Говядина Гамма-B кристаллина был переведен в лизата ретикулоцитов кролика, а также в E. палочки S30 экстракт системы (Promega, Madison, WI) с последующим выделением зарождающейся полипептидной цепи. На рисунке 1 показаны этапы выделения рибосом связанных зарождающейся цепи. В настоящем исследовании цель состояла в том, чтобы проверить, при изменении окружающей среды, т.е. перевод репертуар тРНК (как известно, существенно отличается у млекопитающих (РРЛ) и прокариотических (E.coli), системы связи с различиями в кодон смещения между организмами) может изменить рибосомы движение вдоль мРНК и влиять на распределение участков перевод паузы.Измененные рибосомы движение должно привести к изменениям в распределении размеров зарождающихся полипептидов накапливается в процессе перевода, а также их относительные интенсивности. Относительные интенсивности полос отражает длительность паузы. Зарождающегося полипептиды были выделены и решены на 16,5%, T, C 6% Трис-tricine SDS (Рис. 2). Гамма-B кристаллина в 20 кДа белок. Наблюдение зарождающейся полипептидов неодинаковой длины и интенсивности в РРЛ и Е. кишечной системы показывает, что движение рибосомы вдоль мРНК в этих двух системах следует различных кинетики перевода. Например, мы наблюдали видные группы 17,7 кДа в E. палочки лизат, а не в РРЛ системы, что свидетельствует о наличии дополнительного поступательного сайт паузу в 3'-концевой области мРНК (кодирование C-концевой области гамма-B кристаллина), когда он переводится в E. кишечной системы. Отметим, что гамма-B кристаллина гавани тандем Arg кодона (AGG 153 и AGA 154), которые часто встречаются в млекопитающих, но, как известно, крайне редко и медленно переводится в E. палочка. зарождающегося романа пептид накапливается в E. кишечной системы (~ 17,7 кДа рис. 2.2), скорее всего, вызвано рибосомы останавливаясь на этих тандем редких кодонов. Обратите внимание, что нет полосы можно наблюдать в отсутствие мРНК (рис. 2.3), и что пуромицин обработка удаляет большую часть зарождающейся цепи с полисом (рис. 2.3). Длительное лечение пуромицин (> 15 мин) удаляет все зарождающейся сети (данные не представлены). Это подтверждает, что наблюдаемые полипептидные продукты рибосомы связанный зарождающийся цепи, а не mRNPs cosedimenting с полисом.

Как упоминалось выше, кодон смещения организма, а также ткани конкретно. Представитель пример, описанный здесь, ясно указывает, что изменение окружающей среды перевода, т.е. репертуара тРНК / кодонсмещение может привести к изменено движение рибосомы вдоль мРНК. Очевидно, что этот простой метод не только позволяет идентифицировать поступательного сайтов паузу вдоль мРНК, но и позволяет быстро сравнение перевод сайтов паузы между различными системами.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Схематическое объяснение шагов выделить рибосомы связанных зарождающейся полипептидов. Говядине Гамма-B кристаллина ORF последовательность (528 пар оснований) был клонирован вниз по течению от промоутера T7 в pBSKS +. Ибо в пробирке транскрипции шаблона ДНК линеаризовать, рассматривая его с EcoRI. Линеаризованные шаблон был использован в пробирке транскрипции. Т7 промотора в матричной ДНК признается Т7 РНК-полимеразы, что транскрипция вниз гамма-B кристаллина ген. мРНК очищают, используя хлорид лития осадков методом. Очищенные РНК используется для перевода в пробирке. Послеинкубации, перевод реакции на верхнем уровне 30% глицерин и центрифугировали в течение 1 часа при температуре 4 ° С на 100 000 Х г выделить рибосомы связанных зарождающейся полипептидов.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Изоляция рогатого Гамма-B кристаллина зарождающейся полипептидов переведены на кролика ретикулоцитов лизата (РРЛ) и Е. палочки лизата. 2 мкг мРНК смешиваются в 100 мкл реакции содержащие РРЛ или E. палочки S30 экстракт системы (Promega, Madison, WI) в соответствии с инструкцией производителя с 20 мкКи [35 S]-метионина и инкубировали при 30 ° C в течение 5 мин. После инкубации перевод реакции на верхнем уровне 4,5 мл 30% глицерина в 10 мМ Трис-HCl буфере рН 7,6, содержащего 100 мМ KCl, 10 мМ MgCI 2, и центрифугировали в течение 1 часа при температуре 4 ° C и 100,000 г Х в TLA-110 ротора (Beckman Coulter, Inc, Brea, Калифорния). Изолированной polyribosome осадок гезиspended в 20 мкл 1 мМ Трис-HCl, рН 7,6, содержащий 0,5 мг / мл рибонуклеазы (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY) с последующей обработкой NaOH (как описано в протоколе раздел). Находятся в стадии становления полипептиды были решены на 16,5%, T, C 6% Трис-Tricine SDS геле. Гель сушили и подвергаются за авторадиографии. После воздействия геля отсканированный с помощью сканера изображений Тайфун GE Healthcare в. Рисунок 2.1 показывает, гель с зарождающейся полипептидов изолированы и решил после перевода реакции сделано в двух разных систем (РРЛ и кишечная палочка). Рисунок 2.2 геле проанализированы изображения Квант TL ., v2005 программного обеспечения и используется здесь в качестве примера, чтобы показать, что молекулярный вес и интенсивность накопления зарождающегося полипептидов в двух системах можно легко проанализировать и сравнить Рисунок 2.3 показывает два набора элементов управления: зарождающийся полипептидов изолированы и решаться на SDS PAGE после перевода реакции были собраныбез мРНК и / или после перевода реакции лечили пуромицин (5 мин, конечная конц. 1 мм) до реакции был подвергнут центрифугирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для воспроизводимости результатов, качества и концентрации компонентов, используемых для транскрипции в пробирке и перевод реакции являются критическими. В настоящем исследовании мы использовали коммерчески доступных наборов и экстракты, которые обеспечивают высокую воспроизводимые данные, если осторожно. Тем не менее, перевод, компетентные экстракты могут быть получены из клетки по своему выбору, если это необходимо. Качество мРНК может повлиять на перевод, так что имеет огромное значение для проверки целостно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась по программе по науке пограничной грант RGP0024.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента / Kit Компания Номер по каталогу
MEGAscript T7 Высокая доходность Kit Транскрипция Ambion AM1333
Ингибитор рибонуклеазы Invitrogen 15518012
Транс [35 S]-Label MP Biomedicals 0151006
Рибонуклеазы- Invitrogen 12091
Кролик ретикулоцитов лизата система, нуклеазы Обработанные Promega L4960
Кишечная палочка S30 экстракт системы линейных шаблонов Promega L1030
Центрифугирование Beckman Coulter Optima TLX ультрацентрифуге
Хранение фосфор авторадиограммау GE Healthcare Тайфун 9410 изображений в режиме переменной
Программное обеспечение для рождающегося полипептида анализ GE Healthcare Изображение Квант TL, v2005

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
  2. Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity. Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).
  3. Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2, e221(2006).
  4. Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).
  5. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).
  6. Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model. J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).
  7. Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).
  8. Komar, A. A., Jaenicke, R. Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding. FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).
  9. Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).
  10. Thanaraj, T. A., Argos, P. Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).
  11. Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  12. Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
  13. Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses. J. Vis. Exp. (48), e2498(2011).
  14. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitroSDS

Похожие статьи