Выделение пупочной вены человека эндотелиальных клеток и их использование в изучении нейтрофилов Переселение в проточных условиях

Краткое содержание

Эта статья впервые была описана процедура выделения человеческих эндотелиальных клеток из пуповинной вены, а затем показывает, как использовать эти клетки для изучения нейтрофилов переселение в проточных условиях. При использовании низкого объемного расхода камеры изготовлен из полимера с оптических характеристик стекла, живая клетка флуоресцентных изображений редких клеточных популяций также возможно.

Аннотация

Нейтрофилы являются наиболее многочисленным типом лейкоцитов. Они составляют важнейшую часть врожденной иммунной системы¹. При остром воспалении нейтрофилы первыми из воспалительных клеток мигрируют к месту повреждения. Рекрутирование нейтрофилов в очаг повреждения представляет собой поэтапный процесс, который включает: во-первых, расширение кровеносных сосудов для увеличения кровотока; во-вторых, структурные изменения микрососудов и выход белков плазмы из кровотока; в-третьих, перекатывание, адгезию и трансмиграцию нейтрофила через эндотелий; и, в-четвертых, накопление нейтрофилов в месте повреждения^2,3. Для изучения этих процессов был разработан широкий спектр методов in vivo и in vitro⁴. Данный метод сфокусирован на трансмиграции нейтрофилов через эндотелиальные клетки человека.

Один из популярных методов изучения молекулярных процессов, участвующих в трансмиграции нейтрофилов, основан на взаимодействии нейтрофилов человека с первичными эндотелиальными клетками пуповины человека (HUVEC)⁵. Процедура выделения нейтрофилов была визуально описана в другом источнике⁶; поэтому в данной статье будет представлен метод выделения HUVEC. После выделения и достижения конфлюэнтности эндотелиальные клетки активируются, что приводит к повышению экспрессии молекул адгезии и активации. Например, активация эндотелиальных клеток такими цитокинами, как TNF-α, приводит к усилении экспрессии E-селектина и IL-8⁷. E-селектин опосредует захват и роллинг нейтрофилов, а IL-8 — их активацию и прочную адгезию. После адгезии нейтрофилы трансмигрируют. Трансмиграция может происходить парацеллюлярно (через межклеточные контакты эндотелиальных клеток) или трансклеллюлярно (через тело самой эндотелиальной клетки). В большинстве случаев эти взаимодействия происходят в условиях кровотока, характерных для сосудистой системы^7,8.

Камера с параллельными пластинами — это широко используемая система, которая имитирует гидродинамические напряжения сдвига, возникающие in vivo, и позволяет изучать рекрутирование нейтрофилов в условиях потока in vitro^9,10. Несколько компаний производят камеры с параллельными пластинами, и каждая из них имеет свои преимущества и недостатки. Если требуется флуоресцентная визуализация, необходимо использовать стекло или оптически схожий полимер. Эндотелиальные клетки плохо растут на стекле.

В данной работе мы представляем простой и быстрый метод фазово-контрастной, дифференциально-интерференционной (DIC) и флуоресцентной визуализации трансмиграции нейтрофилов с использованием малообъемного канала ibidi. Слайд изготовлен из полимера, который поддерживает быструю адгезию и рост эндотелиальных клеток человека и обладает оптическими свойствами, сопоставимыми со стеклом. В данном методе эндотелиальные клетки выращивали и стимулировали в μslide ibidi. Нейтрофилы вводили в условиях потока, после чего оценивали трансмиграцию. Флуоресцентная визуализация контактов позволила в режиме реального времени определить степень парацеллюлярной и трансцеллюлярной трансмиграции.

Протокол

1. Выделение и обеспечение прав сосудистых эндотелиальных клеток

1. 2-го уровня биологической безопасности процедуры должны быть использованы при работе с человеческой кровью и тканями. Используя ножницы перерезали шнур из плаценты, а затем внимательно изучить шнур для сгустков крови и повреждения, вызванные пережатие пуповины во время родов. Вырезать и выбросить эти части мозга.
2. Подготовить свежий раствор коллагеназы в дозе 1 мг / мл при заливке 50 мл теплой буфер шнур в трубку, которая содержит 50 мг коллагеназы.
3. Изменения в стерильных перчатках и открыть лоток автоклавного документ, содержащий стерилизовать тупой канюли, шнур зажимы, ножницы, трехходовой стоп-краны и марли в ламинарном боксе.
4. Определить две артерии и одна вена в настоящий мозг. Артерии имеют меньшие размеры и, как правило, плотно суженные, в то время жила большая и легко вводить иглу. Чтобы очистить кровь из вены, аккуратно канюля с двусторонним кран прилагается к нему яНТО один конец вены и местом зажима вокруг канюли, чтобы держать это твердо в позиции. Заливать шнур буфера через вену. Повторяйте, пока поток через ясна, а затем зажать конец шнура.
5. Заливать коллагеназы в вену, закройте кран, поставить шнур в стакан с теплой буфер мозга и инкубировать в течение 10 минут. Через 10 минут, снимите шнур и осторожно массировать шнур, чтобы ослабить эндотелиальных клеток из просвета вены. Слейте раствор в пробирку, содержащую клетки эндотелия СМИ (ECM). Промыть шнур буфера в два раза, чтобы удалить оставшиеся клетки. Слейте раствор в этой же трубы.
6. Центрифуга клеток в 350 мкг в течение 10 минут в гранулах эндотелиальных клеток.
7. Удалить супернатант и добавить 10 мл ECM в осадок. Осторожно ресуспендирования клеток в ECM, а затем перенести клетки T75 колбу предварительно покрытого 0,2% желатина. Предварительное покрытие с желатина было сделано, по крайней мере 1 час при 37 ° C. Рост клеток при 37 ° С и 5% CO _2.
8. На следующий день, встряхните колбу выбить любые красные кровяные клетки удалите супернатант и промыть сбалансированный солевой раствор теплой Хэнка (HBSS). Удалить HBSS и кормить клеток по 10 мл теплой ECM. Изучить клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что красные кровяные клетки были удалены. Оцените степень слияния и морфологии клеток эндотелия. Эндотелиальных клеток на данном этапе должна быть вытянута без признаков вакуоли.
9. Продолжайте менять средства массовой информации каждые три дня, пока клетки достигают слияния, а затем разделить клетки, используя 0.08% раствор трипсина содержащего 1 мМ ЭДТА. Пластина эндотелиальных клеток в нужном блюда предварительно покрытого 0,2% желатина. Клетки должны достичь слияния в 3-6 дней.
10. При использовании ibidi камеры предварительного нанесения каждой камеры с 0,2% желатина. Удалите излишки желатина и фибронектина, а затем добавить 1,5 х 10 ⁶ / мл эндотелиальных клеток, взвешенных в ECM в камеру. Изменение средств массовой информации каждый день, пока вonfluent. Клетки должны быть вырожденной в течение 2-3 дней в зависимости от питания.

2. Подготовка Нейтрофилы

1. Нейтрофилы выделяли из периферической крови здорового человека добровольцев использованием плотности центрифугирования. Подробный протокол с наглядной демонстрацией выделения нейтрофилов может быть найдено в предыдущем номере журнала ^6. После изолированные, нейтрофилы ресуспендируют в концентрации 1х10 ⁶ / мл в HBSS, содержащего 0,5% альбумина человека.

3. Настройка Ibidi палаты

1. Рост клеток эндотелия в желатин покрытием камеры ibidi. Проверьте их каждый день, используя микроскопии фазового контраста, пока они не стали сильно вырожденным.
2. Стимулирование эндотелиальных клеток увеличить экспрессию адгезии и активации молекул. Для целей настоящего Протокола, эндотелиальные клетки стимулировали 10 нг / мл рекомбинантного ФНО-α в течение четырех часов при температуре 37 ° С и 5% CO _{2 до настройки камеры ibidi для работы с изображениями в условиях кровотока.}
3. Подготовьте микроскоп, и шприцевой насос, как визуально описывается Визе и его коллеги ^{11 с} использованием пустой камере ibidi.
4. Основные различия между этим протоколом и Визе процедура включает предварительное заполнение трубы, чтобы предотвратить воздействие на эндотелиальные клетки в воздухе, сохраняя буфера при 37 ° C с помощью водяной бани, используя Pharmed трубку держать буфер от потери температуры и с использованием различных Цели на микроскопе в зависимости от изображения с фазового контраста и флуоресценции.
5. После того, микроскоп устанавливается и трубки заполнена HBSS, закройте все краны и удалить пустые камеры ibidi.
6. Подключите камеру ibidi содержащих TNF-α стимулировали эндотелиальных клеток в трубки.

4. Нейтрофилов найма и переселение

1. Визуализируйте эндотелиальных монослоя клетки в microscОПЕ помощью 10x цель фазового контраста.
2. Установить шприцевой насос снять и начать поток HBSS в желаемом напряжении сдвига (обычно от 0,5 до 2 дин / см ^2).
3. Со стороны входа, переход от HBSS в изолированных нейтрофилов (1х10 ⁶ / мл) путем включения трехходового стоп-кран.
4. Начало записи с помощью ПЗС-камеры подключены либо к записи DVD или подключается непосредственно к компьютеру. Запустите таймер, когда нейтрофилы войти в камеру. Заливать нейтрофилов в течение четырех минут. В общей сложности 3 мл нейтрофилов подвески достаточно для одного эксперимента.
5. Через четыре минуты, вернуться к HBSS, чтобы предотвратить присоединение новых нейтрофилов. Если данные для общего взаимодействия, прокат и фирмы сцепление желательны, Изображение 6 случайных полей за 10 секунд, каждый из которых использует 10x цель фазового контраста между минуты 4 и 5.
6. Переключитесь на 40x цель и записать одно поле зрения от 5 до 10 минут. На 10 минут, собратьмежду 5 и 10 случайных полей зрения.
7. Остановить поток и перейти к следующей камере.

5. Флуоресцентные изображения в условиях кровотока Использование Ibidi палаты

1. Этикетка как эндотелиальные клетки или нейтрофилов с флуоресцентный зонд интерес. Например, анти-VE-кадгерина антитела, конъюгированные с Alexa-[547] может быть использована для визуализации эндотелиальные клетки узлов.
2. Соберите ibidi камеру на микроскопе с дифференциальными интерференционного контраста (DIC) и флуоресцентной возможности. Мы используем FluoView 1000 конфокальной (Olympus) с экологической палаты. Фокус использование цель предназначена для ДВС и люминесцентные работы.
3. Получить одновременное ДВС и флуоресцентные изображения с помощью программного обеспечения, поставляемого продавцом в то время как в соответствии с временем Конечно, описанных в разделе 4.

6. Анализ нейтрофилов набор

1. Анализ подвижного и взаимодействующих клеток описывается Визе и др. ^11.
2. Чтобы измерить процент нейтрофилов прокатки на эндотелиальных монослоя подсчета количества нейтрофилов, которые переехали более одной ячейки диаметром в течение 5 секунд. Разделите это число на общее число лейкоцитов в поле, чтобы определить процент подвижного клеток. В более широком смысле, остальные клетки считаются твердо приверженцем.
3. Измерить скорость качения нейтрофилов путем вычисления расстояния нейтрофилов ездил в определенный период времени, а затем разделив его к тому времени в секундах.
4. Переселение определяется путем подсчета количества нейтрофилов, которые изменили форму и мигрировали под монослой ^10. Эти нейтрофилы определяются тем, что они меняются от того этапа, когда ярко поверх монослоя к тому, фаза темно, когда под монослой ^10. Число клеток переселился может быть выражена в процентах от общего числа клеток в поле зрения или в качестве сырья онемениеэ переселился из клеток на единицу площади. В этой модели система, как правило, 50% нейтрофилов переселиться после 10 минут.

7. Представитель Результаты

Нестимулированных эндотелиальные клетки не поддерживают нейтрофилов найма. В отличие от этого, стимулируя эндотелиальные клетки с TNF-α приводит к нейтрофилов прокат, сцепление фирмы и переселение. Пример этих данных показано на рисунках 1 и 2. Рисунок 1А показывает нейтрофилов взаимодействия с TNF-α-стимулированных эндотелиальных клеток. Эти взаимодействия могут быть определены количественно, выявление общего числа нейтрофилов взаимодействия с эндотелиальных клеток, а также числа нейтрофилов прокат, твердо сторонником или переселены (рис. 2). Нейтрофилов переселение может произойти в клетке узлов или через эндотелиальные клетки сами. Чтобы различать эти два условия, эндотелиальные клетки помечены анти-VE-с adherin антител и переселение оценивается как происходящие paracellularly или transcellularly (рис. 1B и C). В этой модели, практически все это переселение трансклеточной ^7.

Рисунок 1. Одновременное DIC и флуоресценции в проточных условиях использования камеры ibidi. (A) DIC изображение свежевыделенных нейтрофилов человека мигрирующих через пупочной вены человека эндотелиальных клеток. Желтая стрелка показывает сторонник нейтрофилов, белая стрелка показывает, переселяющимся нейтрофилов. (B) эндотелиальных переходы клетки окрашивали анти-VE-кадгерина антитела, конъюгированные с Alexa-[547] и образ. (C) показывает наложение каналов А и В, показывая, что практически все, переселяющимся в этой модели трансклеточной. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

_content ">
Рисунок 2. Эндотелиальные клетки остались нестимулированных или стимулировали 10 нг / мл TNF-α. Через 4 часа, параллельно камере поток пластина была собрана и нейтрофилов перфузии по состоянию на 1 дин / см ^2. (A) нейтрофилов взаимодействия были рассмотрены и измеряется с помощью программного обеспечения ImageJ от НИЗ. Общая клетки взаимодействующих были охарактеризованы как (B) прокат, твердо сторонником или (C) переселяющимся. Данные представляют собой средние + SEM от 3 до 5 экспериментов. Разница между контролем и TNF в панелях и C была значимой (р <0,001).

Обсуждение

Исследователи обычно используют эндотелиальных клеток из различных сосудистых кровати для изучения нейтрофилов найма и переселение. Примеры включают, но не ограничиваясь, кожных клеток эндотелия микрососудов ^12, печени синусоидальных эндотелиальных клеток ¹³ и эндотелиальных клеток из пупочной вены человека ^10. Среди них HUVEC приобрела широкую популярность из-за своей относительной простоты и доступности изоляции. HUVEC являются мощным в пробирке модель системы, которая и...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагенты и оборудование	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Коллагеназы тип 1	Уортингтон	4197
Шнур буфер			Состав: 140 мм NaCl 4 мМ KCl 10 мМ D-глюкозы в 1 мМ NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 буфере при рН 7,4
Эндотелиальная СМИ Cell (ECM)			M199 с солями Орел дополнен с 16% сыворотки крови человека, содержащий 100 единиц пенициллина 100 мкг стрептомицина и 0,3 мг L-glutamine/ml
M199	GIBCO	31100-035
Пенициллин Стрептомицин Глутамат (100X)	Invitrogen	10378-016
Ibidi камеры	Ibidi	80606
ФНО-α	Препро Tech	300-01A
Человеческий альбумин 20% раствор	Близнецы биопродуктов	800120050
HBSS без Са 2 + и Mg 2 +	Сигма	H2487-10X
HBSS с Са 2 + и Mg 2 +	Сигма	H1387-10X