Удобный и общее выражение платформы для производства секретируемых белков из клеток человека

Краткое содержание

В пост-человеческой эры геномики, наличие рекомбинантных белков в родной конформации имеет решающее значение для структурных, функциональных и терапевтических исследований и разработок. Здесь мы описываем испытаний и масштабные экспрессии белков системы человеческих эмбриональных почек 293T клетки, которые могут быть использованы для производства различных рекомбинантных белков.

Аннотация

Рекомбинантная экспрессия белка у бактерий, обычно E. coli, была наиболее успешной стратегией для экспрессии миллиграммов белков. Тем не менее, прокариотические хозяева часто не так подходят для экспрессии человеческих, вирусных или эукариотических белков из-за токсичности чужеродной макромолекулы, различий в механизме сворачивания белка или из-за отсутствия специфических ко- или посттрансляционных модификаций у бактерий. Системы экспрессии на ^основе дрожжей (P. pastoris или S. cerevisiae) ^1,2, клеток инфицированного бакуловирусом насекомого (S. frugiperda или T. ni) 3 и бесклеточных трансляционных систем in vitro ^2,4 были успешно использованы для получения белков млекопитающих. Интуитивно понятно, что наилучшим вариантом является использование млекопитающего-хозяина для обеспечения производства рекомбинантных белков, содержащих надлежащие посттрансляционные модификации. Ряд клеточных линий млекопитающих (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin, несущих большой Т-антиген SV40 (COS), яичник китайского хомяка (CHO) и др.) были успешно использованы для сверхэкспрессии миллиграммовых количеств ряда белков человека ^5-9. Тем не менее, преимущества использования клеток млекопитающих часто сводятся на нет более высокими затратами, потребностью в специализированном лабораторном оборудовании, более низким выходом белка и длительным периодом разработки стабильных линий экспрессии клеток. Увеличение выхода и более быстрое производство белков при сохранении низких затрат являются основными факторами для многих академических и коммерческих лабораторий.

Здесь мы описываем экономичную по времени и затратам двухэтапную процедуру экспрессии секретируемых белков человека из адгезивных клеток HEK 293T. Эта система способна производить от микрограмма до миллиграмма функционального белка для структурных, биофизических и биохимических исследований. Во-первых, несколько конструктов интересующего гена производятся параллельно и временно трансфицируются в адгезивные клетки HEK 293T в небольших масштабах. Обнаружение и анализ рекомбинантного белка, секретируемого в среде для культивирования клеток, осуществляется методом вестерн-блоттинга с использованием коммерчески доступных антител, направленных против вектор-кодируемой бирки. Впоследствии подходящие конструкции для крупномасштабного производства белка временно трансфицируются с использованием полиэтиленимина (ПЭИ) в 10-слойных клеточных фабриках. Белки, секретируемые в литровых объемах кондиционированной среды, концентрируют в контролируемых количествах с помощью тангенциальной проточной фильтрации с последующей очисткой с помощью анти-HA аффинной хроматографии. Полезность этой платформы доказана ее способностью экспрессировать миллиграммовые количества цитокинов, цитокиновых рецепторов, рецепторов клеточной поверхности, внутренних факторов рестрикции и вирусных гликопротеинов. Этот метод также был успешно использован при структурном определении тримерного гликопротеина эболавируса ^5,10.

В заключение, эта платформа предлагает простоту использования, скорость и масштабируемость при максимальном качестве белка и функциональности. Более того, не требуется никакого дополнительного оборудования, кроме стандартного увлажнённого инкубатора CO₂. Эта процедура может быть быстро распространена на системы более сложной сложности, такие как совместная экспрессия белковых комплексов, антигенов и антител, производство вирусоподобных частиц для вакцин или производство аденовирусов или лентивирусов для трансдукции сложных клеточных линий.

Протокол

1. Подготовительные работы - Конструкции и клеточных культур

Перед началом протокола гена должны быть кодон оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих, и клонируют в соответствующий вектор экспрессии с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Для того, чтобы обеспечить самые высокие шансы для успешного выражения, несколько вариантов гена должны быть созданы. Многие векторов экспрессии млекопитающих имеются в продаже и имеют различные теги очистки (polyhistidine, гемагглютинин, стрептавидина, HALO-тегов, глутатион S-трансферазы и др.). Мы предпочитаем использовать pDISPLAY вектор, который кодирует сильный человек промоутер цитомегаловирус, Ig κ секреции сигнала, гемагглютинин очистки теги и имеет С-концевой трансмембранный якорь для целевой белок через секреторный путь для отображения на плазматической мембране. Мы обычно вставить стоп-кодон перед вектором в кодировке трансмембранного анчот, чтобы белок, секретируется в кондиционированной среды.

Человеческих эмбриональных почек (НЕК) 293T клеток, широко доступны и легко культивировать и трансфекции. HEK 293T обычно используются для выражения млекопитающих белков, но считаются биологически опасными и должны решаться на уровне биобезопасности 2. Пожалуйста, носите надлежащую индивидуальную защитную одежду, работа должна быть выполнена в утвержденных кабинет биобезопасности использованием асептических условиях. Все отходы и поверхности должны быть продезинфицированы в соответствии с институциональными и государственных принципов. Рекомендуется, что клетки быть проверены на заражение микоплазмой перед использованием. Клетки могут быть обработаны с ципрофлоксацин (10 мкг / мл) в течение десяти дней по искоренению любого источника микоплазмы SPP. загрязнения. Генеральный протоколов для распространения HEK 293T клеток представлены отдельно (вставка 1).

Дополнительная информация для испытаний и масштабные экспрессии белка являются revieweг в ^11-15.

2. Малые испытания Выражение

После конструкций были разработаны и генерируется небольшой трансфекции испытания могут быть выполнены с использованием HEK 293T клеток, схема обобщения процесс представлен ниже (рис. 1).

1. Используйте T75 см ² и T225 см ² клеточной культуры фляги (в зависимости от количества испытаний выражения должны быть выполнены) для выращивания клеток HEK 293T и разделить клетки каждые 2-3 дня, когда клетки на 100% сливной (вставка 1).
2. Семенной 2,5 х 10 ⁵ HEK 293T клеток на лунку в 6-луночного планшета и добавить 2 мл DMEM с 1X ручка / стрептококк и 10% (объем / объем) FBS, вращать пластину осторожно, чтобы обеспечить даже клетка разгона в каждую лунку, и инкубировать в течение ночи при 37 ° С в 5% CO ₂ влажной камере.
3. Когда HEK 293T клеток до 40% слияния, отказаться от средств массовой информации и добавить свежие 2 мл DMEM с 1X ручка / стрептококк и 10% (объем / объем) FBS в скважинах. Выполнятьтрансфекции анализов.
4. Алиготе 90 мкл бессывороточной DMEM в стерильный 1,5 трубки микроцентрифужных мл. Внесите 3 мкл GeneJuice в бессывороточной DMEM и аккуратно перемешать трубу (палец вихря). Выдержите в течение 5 минут при комнатной температуре.
5. Добавить 1 мкг MiniPrep очищенной ДНК плазмиды (ДНК акции = 100 нг / мкл) в DMEM-GeneJuice смеси, палец вихрь, и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
6. Пипеткой по каплям трансфекции смесь на HEK 293T клеток, и вихрь 6-луночного планшета мягко, чтобы равномерное распределение трансфекции смеси. Инкубируйте 6-луночного планшета при 37 ° С в 5% CO ₂ влажной камере.
7. Добавить 1 мл свежей DMEM с 1X ручка / стрептококк и 10% (объем / объем) FBS в каждую лунку 24 часа после трансфекции и инкубировать в течение еще 48 часов (всего 72 часов).
8. Урожай 1 мл супернатанта из каждой лунки по три дня после трансфекции и микроцентрифужных образцов при 16000 г в течение 10 минут при комнатной температуре. Провести Уэсакрачка блот анализ, как описано во врезке 2. Образцы могут храниться при температуре 4 ° C. Срок хранения при 4 ° С белок зависимым.

3. Крупномасштабные испытания выражения и очистка

После того, как конструкция была определена миллиграмм выражение количества рекомбинантного белка достигается PEI трансфекции сторонник HEK 293T клеток с использованием 10-клеточного слоя заводов (рис. 2, 6360 см ² площади поверхности). Для получения дополнительной поисковых исследований, меньше ячейка завода или Т-колбы (табл. 1) могут быть использованы.

1. Очистите 1 мг ДНК трансфекции с использованием MaxiPrep плазмиды комплект очистки. 500 мл ночной культуры в XL-1 Blue клетки должны производить не менее 1 мг чистого ДНК. Проверьте чистоту ДНК путем измерения _260/280 соотношение, должна быть выше 1,8.
2. Масштабирование HEK 293T клеток до 2,0 х 10 ⁸ клеток. Каждый T225 см ² колбы выросли на 100% слияния сотрудничестваntains и среднем ~ 2,25 х 10 ⁷ клеток.
3. Добавить 1,2 л DMEM с 5% (объем / объем) FBS к 10-клеточного слоя завода. Добавить 2,0 х 10 ⁸ HEK 293T клетки к клетке завода и распространять клетки равномерно на все слои сосуда. Очень трудно представить себе слияния клеток в клетки завода. В качестве альтернативы созданию T75 см ² колбы с соответствующим числом клеток, используя тот же номер мобильного на поверхность соотношение области, проводится с 10-слоя судна. Мониторинг этой колбы для роста. См. связанный видео инструкции по обращению с фабрики ячеек. Выдержите в течение ночи при 37 ° C с 5% CO _2, чтобы для прикрепления клеток и роста.
4. Выполните крупномасштабных трансфекции, когда сторонник HEK 293T клеток на 70% вырожденная. Подготовка PEI-ДНК трансфекции смесь (3:1 / в PEI в отношении ДНК) в кабинете биологической безопасности с использованием стерильного T75 см ² колбы. Смешать 0,84 мг ДНК с 84 мл стерильного 1X PBS, затем добавьте 2,5 мл PEI (2.5 мг общего PEI). Инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Решение должно стать мутной.
5. Вылейте PEI-ДНК трансфекции смесь медленно в клетки завода и тщательно распределять по всем слоям судна. Дополнительно: для повышения урожайности выражения, добавьте вальпроевая кислота (4 мм конечная концентрация). Инкубировать при температуре 37 ° C с 5% CO ₂ в течение четырех дней.
6. Урожай супернатант четыре дня после трансфекции. Центрифуга кондиционированной среде при 6000 х г в течение 30 минут при 4 ° C. Дальнейшая фильтрация супернатант использованием 0,22 мкм Stericup вакуумный фильтр аппарата. 10-клеточного слоя завода можно использовать повторно, см. вставку 3 для очистки инструкции. Это ключ, очистка начинается сразу же после сбора урожая супернатант, не позволяют клеткам сухой на поверхности сосуда.
7. Концентрат супернатант до 75 мл, используя Centramate тангенциальной системой фильтрации потока.
8. Добавить 500 мл PBS и вновь сосредоточиться на 75 мл. Повторить три допРациональная раз, чтобы полностью буфер обмена образца.
9. Уравновешиваются 1 мл анти-HA аффинной колонке с 1X PBS и применять концентрированные образцы самотеком в размере <1 мл / мин.
10. Промойте колонку с 30 мл 1X PBS-Tween20.
11. Растворите HA пептида в 1X PBS (1,0 мг / мл) и инкубировать при температуре 37 ° C.
12. Применяют по 1 мл пептида га анти-ГА и колонки позволяют пептид поступать в смоле. Соберите потока через. Остановить поток, когда пептид решение достигает высоты кровати.
13. Выдержите все анти-HA колонки при 37 ° С в течение 15 минут.
14. Повторите Шаг 12 два раза.
15. Применяют по 1 мл PBS 1X к анти-HA колонки и впадают в смолу, пока не достигнет высоты кровати. Соберите потока через.
16. Восстановить анти-HA колонку с 10 мл 0,1 М глицина рН 2.2. Промыть 10 мл PBS и близость магазина колонке при 4 ° С в PBS с 0,02% (вес / объем) NaN _3.
17. Выполните SDS-PAGE анализа и бассейн еractions соответственно. Примечание: пептид HA будет мешать измерения концентрации белка на ₂₈₀ или Брэдфорда. Чтобы оценить количество белка настоящее время нагрузка 5, 10, 15, 25 мкг BSA на SDS-PAGE гель в качестве стандарта и сравнить интенсивности полос.

Шаги 9-17 можно повторять, чтобы захватить дополнительный белок из кондиционированной среды.

4. Представитель Результаты

В этой статье мы описываем и продемонстрировать удобную платформу для выражения миллиграмм-серийное производство белков человека, которые могут быть впоследствии использованы для структурных и функциональных исследований. Скрининг человеческого белка конструкций использованием HEK 293T клеток в 6-луночных является эффективным и действенным в определении конструкции поддаются больших масштабах производства. Коммерческая векторов выражение может быть эффективной трансфекции в клетки HEK 293T с использованием различных реагентов трансфекции, таких как GeneJuice, FuGene HD или PE I. Мы рекомендуем использовать коммерческие реагенты трансфекции, таких как GeneJuice или FuGene HD, для тестирования выражений, так как эти реагенты являются более эффективными для бедных выражения белков (рис. 3). Конструкции выбраны для увеличения масштаба выражение должно характеризоваться единой сильной интенсивности полос, соответствующих надлежащей молекулярного веса на западной пятном (рис. 3). Гликопротеины могут мигрировать в широком группу из-за неоднородности в гликозилирования. Мы показали, что различные макромолекулы, начиная от вирусных гликопротеинов, цитокины, рецепторы цитокинов и других белков поверхности, может быть выражена и очищается для получения millgram количества белка с помощью этой общей платформе выражении (рис. 4).

Рисунок 1. Workflow схема мелких трансфекции.tp_upload/4041/4041fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить цифру.

Рисунок 2. Corning 10 CellSTACK слой для увеличения масштаба экспрессии белка. Каждый слой содержит 636 см ² площади поверхности для мобильного приложения. Стандартных лабораторных CO ₂ инкубатор (6,0 куб. Футов) будет комфортно провести четыре 10-слой заводов клетки.

. Рисунок 3. Малые выражения различных секретируемых белков Мы провели ряд мелких тест выражений с помощью обычных реагентов трансфекции. GeneJuice, FuGene HD и PEI (а) Западной скрининг пятно отдельных человеческих клеточных белков (tetherin), рецепторы (IL-2R субъединицы β) и цитокинов (IL-2). Tetherin является человеком гликопротеина мембраны, которая ограничивает выпускзарождающегося ВИЧ-1 вирионов ^16. Внеклеточного домена tetherin существует в виде гликозилированного, дисульфид-связанных димер ~ 36 кДа. В восстановительных условиях, как показано здесь, tetherin мигрирует в виде мономера с кажущейся молекулярной массой ~ 22 кДа. Интерлейкина-2 (IL-2) является цитокинов (~ 17 кДа), участвующих в пролиферации лимфоцитов ^17. Он взаимодействует с ИЛ-2 рецепторного комплекса, в том числе IL-2R βsubunit (~ 26 кДа) является одним из компонентов ^18. CD21 является мембранный белок, участвующий в активации и созревания В-клеток системы комплемента, а также является рецептором для вируса Эпштейна-Барра. Гликозилированного внеклеточный домен CD21 мигрирует в виде мономера с кажущейся молекулярной массой ~ 20 кДа. (Б) Вестерн блот проверки выбранных поверхности вирусных гликопротеинов (XMRV Env и ebolavirus GP). XMRV и ebolavirus гликопротеинов (трансмембранный якорь удален) существуют в вирусной мембране тримерной шипы и участвуют в принимающих вложений клеткии синтеза. Эктодомена из XMRV Env и EBOV GP сильно украшены N-связанных гликанов и мигрируют в кажущейся молекулярной массой 70 кДа и 75 кДа соответственно.

Рисунок 4. Очищенная человека клеточных белков от крупных HEK 293T культур. Все белки были выражены с использованием 10-клеточного слоя завода и концентрировали и очищали с помощью анти-HA хроматографии. Как показали Кумасси окрашенных SDS-PAGE анализа внеклеточной области рецептора интерлейкина-2 (IL-2R) α и γ подразделения мигрировать в молекулярной массой 40 кДа и 46 кДа соответственно. Внеклеточного домена tetherin мигрирует в виде димера, при невосстанавливающих условиях, кажущийся молекулярный вес 36 кДа. Обратите внимание, что некоторые BSA загрязнения, которое появляется на кажущийся молекулярный вес 60 кДа. Кроме того, неоднородность N-связанных гликанов представить на tetherin,IL-2R α и ИЛ-2R γ причин уширение полосы на SDS-PAGE гель. Эти сложные типа N-связанных гликанов можно удалить с помощью пептида N-гликозидазы F.

Судно	Площадь
6-луночного планшета	9,5 см 2 (каждую лунку)
100 мм блюда	55 см 2
245 мм блюда	500 см 2
T75 см 2 колбы	75 см 2
T175 см 2 колбы	175 см 2
T225 см 2 колбы	225 см 2
Роликовые бутылки регулярное	850 см 2
Роликовые бутылки расширенной поверхностью	1700 см 2
1-слой CellSTACK	636 см 2
2-слойная CellSTACK	1272 см 2
5-слойная CellSTACK	3180 см 2
10-слойный CellSTACK	6360 см 2
40-слой CellSTACK	25440 см 2

Таблица 1. Сравнение культуры клеток суда, используемые для экспрессии белков.

Список реагентов Рецепты

100X ципрофлоксацин в течение 10 мл раствора, добавляют 10 мл дистиллированной воды до 10 мг ципрофлоксацина. Добавить 10 мкл 6N HCl до полного растворения ципрофлоксацина.

PEI (1 мг / мл) 100 мл раствора, растворите 100 мг 25 кДа линейной PEI в деионизированной воды и тепла до 80 ° C. Холодный раствор до комнатной температуры, регулировать рН до 7,2, 0,22 мкм фильтр стерилизуют, Алиготе и замораживают при температуре -20 ° С для LONг-срок хранения.

1X PBS за 1 л водного раствора: 8,0 г NaCl, 0,2 г хлорида калия, 1,4 г Na ₂ HPO ₄ (безводный), 0,24 г KH ₂ PO _4. Отрегулируйте рН раствора до 7,4 и заполнить до 1,0 L.

1X PBS-Tween-20 на 1 л водного раствора: 8,0 г NaCl, 0,2 г хлорида калия, 1,4 г Na ₂ HPO ₄ (безводный), 0,24 г KH ₂ PO _4, 1 мл Твин-20. Отрегулируйте рН раствора до 7,4 и заполнить до 1,0 L.

1X буфера передачи на 1 л водного раствора: 3,0 г Трис базы, 14,4 г глицина, 150 мл метанола.

1X SDS-PAGE работает буфер на 1 л водного раствора: 3,0 г Трис базы, глицин 14,4 г, 1,0 г SDS.

SDS-PAGE сокращение буфера образца в течение 10 мл раствора: 0,6 г SDS, 3 мл глицерина, 1,8 мл 1,0 Трис-HCl, рН 6,8, 1 мг бромфенола синий, 5% (объем / объем) 2-меркаптоэтанола.

Вставка 1. Генеральный протоколов для мобильных распространения

1. Рост HEK 293T клеток в средней Дульбеко изменения Орла (DMEM) с добавлением 10% (объем / объем) эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 1X ручка / стрептококк при 37 ° С в 5% CO _{2-влажной} атмосфере.
2. Соблюдайте клетки под инвертированным микроскопом. Когда клетки на 100% слияния, удалить и уничтожить питательную среду.
3. Промойте клетки с 5 мл стерильной 1X PBS для удаления следов сыворотки. Откажитесь от мытья PBS.
4. Добавить 2 мл 0,05% (вес / объем) трипсин-EDTA решение T225 см ² колбы (или 1 мл 0,05% (вес / объем) трипсин-ЭДТА для T75 см ² колбы) и выдержите при комнатной температуре до клетки отделяются от поверхности. Кроме того, можно использовать стерильный 1X PBS-EDTA отделить HEK 293T клеток.
5. Добавить 13 мл DMEM с 10% (объем / объем) FBS для T225 см ² колбы (или 9 мл DMEM с 10% (объем / объем) FBS для T75 см ² колбы) для подавления реакции трипсин.
6. Разделить слоктя 1:5. Для T225 см ² колбу, добавьте 3 мл клеточной суспензии до 27 мл свежей DMEM с 1X ручка / стрептококк и 10% (объем / объем) FBS в новом судне культуры. Для T75 см ² колбы, добавляют 2 мл клеточной суспензии до 8 мл свежей питательной среды. Инкубируйте культур при 37 ° С в 5% CO _{2-влажной} атмосфере. Клетки должны вырасти на 100% слияния в течение двух дней.

Вставка 2. Вестерн-блот анализа

1. Добавить 10 мкл SDS-PAGE снижения образец буфера 30 мкл клеточной культуры супернатант. Загрузка образцов и prestained маркеры молекулярного веса на полиакриламидном геле и electrophorese использования 1X SDS-PAGE работает буфер на 175 В в течение 1 часа или пока маркеров молекулярной массы хорошо решены.
2. Замочите PVDF Immobilon-P мембраны в 100% метанола в течение 1 минуты для активации.
3. Соберите западных аппарат пятна. Убедитесь, что мембраны PVDF сталкивается с положительным электродом и сохранить все компоненты мокрым 1X передачи буфера. АвоID пузырьков между полиакриламидном геле и мембраны.
4. Полностью заполнить электрофорез камеры 1X буфер передачи и передачи в течение 1 часа при 100 В.
5. Блок мембраны с 5% (вес / объем) обезжиренного молока в 1X PBS-Tween20 в течение 1 часа при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
6. Инкубируйте с помощью моноклональных антител первичной (то есть разведение 1:1000 анти-ГА МКА или другого соответствующего антитела) растворяют в 5% (вес / объем) обезжиренного молока в 1X PBS-Tween20 в течение 1 часа при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
7. Вымойте мембран в 1X PBS-Tween20 течение 10 минут. Повторите два дополнительных раза.
8. Инкубируйте с моноклональных антител вторичного сопряженного с щелочной фосфатазы (1:1000 разведения в 5% (вес / объем) обезжиренного молока в 1X PBS-Tween20) в течение 1 часа при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
9. Вымойте мембран в 1X PBS-Tween20 течение 10 минут. Повторите два дополнительных раза.
10. Поместите мембрану в небольшую емкость, добавить 5 мл щелочной фосфатазы substraТе (BCIP / NBT) решение. Цвет развитие должно происходить в течение 1-5 минут. Как только нужный диапазон интенсивности достигается, промыть дистиллированной водой и воздухом. Цвет может исчезать с течением времени, сканирование электронных оболочек после высыхания.

Таблица 3. Очистка и утилизация судов культуре клеток

В то время как клетки заводы предназначены для одноразового использования, эти суда могут быть переработаны для дополнительных крупномасштабных трансфекции, используя следующий протокол уборка:

1. Сразу же после декантации супернатант из 10-клеточного слоя завода, добавить 20% (объем / объем) отбеливателя и энергично встряхивают, чтобы отделить клетки. Инкубируйте при комнатной температуре в течение трех часов.
2. Очистка сосудов и добавить свежих 20% (объем / объем) отбеливателя и инкубировать при комнатной температуре в течение ночи.
3. Очистить и вымыть судно с 1,5 л дистиллированной воды. Повторите три раза.
4. Вылейте 10-клеточного слоя завод и добавить 0,5 л стерильной 1X PBS с добавлением 10X антибиотикам / противогрибковым раствором. Хранить сосуд при комнатной температуре и заменить вентиляционные заглушки для заполнения порта (стандартный 33 мм с резьбой крышки) до следующего использования. Примечание: Все слои должны быть совершенно ясно, после очистки, если нет, не пользоваться и распоряжаться клетки заводе в соответствии с ведомственным руководящим принципам.

Обсуждение

10-слойный заводов клетки являются эффективным судно для производства миллиграмм количества белка. Основное преимущество использования ячейки завода по сравнению с другими традиционными судами, такими как ролик бутылки, дрожание колбы или счетчика колбы, в том, что они не требуют приобретения дополнительного оборудования лаборатории. Стандартный CO ₂ инкубатор (~ 6.0 куб. Футов) будет легко разместить четыре 10-клеточного слоя заводов (рис. 2). Кроме того, эти суда требуют меньше рабочей силы...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Щелочной фосфатазы (BCIP / НБТ) жидкий раствор субстрата	Сигма	B6404
Антибиотикам / противогрибковым, 100X	Invitrogen	15240062
Anti-HA близость матрицы, клон 3F10	Roche	1815016
Anti-HA мышиных МКА, клон 16B12	Covance	MMS-101P
Колба клеточной культуры, T75 см 2 ткани культуры рассматривается	Гранулирование	430641
Колба клеточной культуры, T225 см 2 ткани культуры рассматривается	Гранулирование	431082
Пластин клеточной культуры, 6-а культуры тканей лечение	Гранулирование	3516
Сотовые завод, 10-слой CellSTACK	Гранулирование	3312
Centramate Омега 5K кассеты	Надоедать	OS005C12
Centramate Омега 30К кассеты	Надоедать	OS030C12
Хроматографии стеклянную колонку, 1.0x10 см	Kontes	4204001010
Ципрофлоксацин	Сигма	17850
CO 2
Дульбекко изменения Орла СМИ (DMEM)	Сигма	D5796
Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), тепло инактивированная	Invitrogen	12484-028
FuGENE HD трансфекции реагент	Promega	4709691001
GeneJuice трансфекции реагент	EMD / Merck	70967-6
Глицин	Сигма	G8898
Антимышиного IgG F (аb ') 2 щелочные	Thermo Scientific	31324
фосфатазы, конъюгированных антител
Гемагглютинина (HA) пептид, 100 мг	Genscript	синтез новых
(Последовательность: YPYDVPDYA, 95% чистоты)
HEK 293T клеток	ATCC	CRL-11268
Householг хлорной извести (4% вес / объем гипохлорита натрия)	различных марок доступны
Immobilon-P PVDF мембраны	Millipore	IPVH07850
MiniPrep плазмиды комплект очистки, PureLink быстрого	Invitrogen	K2100-11
MaxiPrep плазмиды комплект очистки, PureLink HiPure	Invitrogen	K2100-07
NaN 3	Сигма	S8032
вектор pDISPLAY выражение	Invitrogen	V660-20
Пенициллина / стрептомицина (ручка / стрептококк), 100X	Invitrogen	15140-122
Фосфат-солевом буфере (PBS), стерильные 1X	Сигма	D8537
Полиэтиленимина (PEI), линейные 25 кДа	Polyscience	23966
Обезжиренное молоко сухой порошок	Гвоздика
Stericup-GP PES блок фильтрации вакуума,	Millipore	SCGPU05RE
0,22 мкм, емкостью 500 мл
Трипановый синий	Invitrogen	15250061
Трипсин-EDTA, 0.05% (вес / объем)	Invitrogen	25300-054
Твин-20	Сигма	P7949
Вальпроевая кислота	Сигма	P4543
Centramate тангенциальных потоков в системе	Надоедать
CO 2 увлажненном инкубаторе, стандартный 6,0 куб. футов	различных марок доступны
Электрофорез и передачи единицы	различных марок доступны
Инкубатор, 37 ° C	различных марок доступны