$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Приготовление гистологических срезов для Неокрашенные Разделы
- Установите водяной бане и микротома как для стандартных приготовление гистологических срезов парафином. Используйте положительно заряженные слайдов и предварительно этикетка с номер дела, поджелудочной железы области (образца) и номер слайда. Место парафиновых блоков в микротома патрон с кассетной этикетке на левой стороне.
- Следуйте обычной процедуры, приготовление гистологических срезов, раздел в блоке, пока ткань равномерно встречаются. Подготовить ленту серийных срезов (4 мкм, 3-6 в зависимости от количества необходимых начальных пятна (см. пример заполненной формы, Приложение 1)). Отдельные разделы в ленте, возьмите каждый по порядку, и место на слайдах с целью пронумерованы карандашом. Обозначим, если раздел не используется по нумерации разделов в точном порядке. Поддерживать ту же ориентацию на слайде, которые содержатся в кассету с этикеткой слайд ориентированные влево. Высушите на ночь при комнатной температуре, после чего приступить к появлению пятен или распределения следователей.
- ResEAL поверхности парафинового блока с тонким слоем парафина, чтобы сохранить ткани и архива при комнатной температуре или при -20 ° C.
- Для последующих приготовление гистологических срезов, поддерживать нумерации серийные срезы на каждом уровне, что и выше. Получите 1 дополнительный слайд и пятно на слайд H & E для каждого ~ 100 мкм уровне в рамках каждого блока.
2. H & E Окрашивание
- Поместите первый серийный секционного слайд из каждого блока в режиме слайд-стойки, то в первом лотке на autostainer.
- Выберите стандартный H & E пятно программу и перейти в обычном режиме.
- По окончании окрашивания, удалить слайды из autostainer и место в капоте для coverslipping.
- Покровное использованием стандартной техники. Высохнуть и этикетки с маркировкой (см. раздел 12).
3. IHC Настройка
- Выберите программу, Dako двойного пятна и ввод номеров слайдов. Подготовить TBST и цитрат буферов, антител и других КГНродителей в соответствии с указанными объемами (табл. 1). Загрузите лоток реагентов и слайды. Вращение чистых и сточных линии программируются в соответствии с рекомендациями производителя.
- При выполнении этих тестов вручную, подготовить около томов. Инкубируйте слайды во влажной камере, чтобы избежать высыхания слайды на любом этапе. Выполните ту же процедуру для каждого реагенты, когда она используется для autostainer.
4. IHC депарафинизации и антигена поиска
- Положите слайды в ксилоле в течение 5 минут. Повторите еще раз. Не допускать понижения высохнуть в любой последующий момент, пока обозначены как это приведет к чрезмерному фон и бедными окрашивания.
- Передача слайдов до 100% этилового спирта в течение 2 минут. Повторите еще раз.
- Положите слайды в свежеприготовленного 3% H 2 O 2 в метаноле в течение 10 минут.
- Dip слайдов в 90% этанола, а затем поместить в 90% этаноле в течение 3 минут.
- Передача слайды70% этанола в течение 1 минуты.
- Промыть слайдов в деионизированной воде.
- Разогреть пароход и цитрат в буфер пароход в течение 5 минут.
- Добавить слайды цитрат буфера в пароход и пара в течение 30 минут.
- Немедленно передать слайды к воде и удерживайте ее, пока скользит остыть до комнатной температуры (~ 20 минут).
- Передача слайдов Dako autostainer стойки в соответствии с последовательностью пятна (рис. 1) и запустить программу двойным окрашиванием. Основные этапы программы autostainer перечислены так, что руководство трассы можно дублировать.
5. Первый первичных антител (Ki-67, CD3, панкреатический полипептид)
- Блок слайды с Снайпер решение в течение 15 минут. Мыть два раза TBST.
- Инкубируйте слайды в первичных антител в течение 30 минут. Мыть два раза TBST.
- Инкубируйте с Mach2 антимышиного (Ki-67) или анти-кролик (CD3, панкреатический полипептид) пероксидазой хрена (HRP) полимера на 30 мinutes. Мыть два раза TBST.
- Применение 3,3-диаминобензидина tetrahydrochloride (DAB) в слайды в течение 4 минут. Мыть два раза водой.
- Слайды инкубировали с панкреатический полипептид проводятся на Dako когда его анализировали одновременно и TBST использоваться для всех последующих шагов в то время как остальные слайды инкубируют со вторым набором первичных антител. Кроме того, для ручного анализы, перейдите к разделу 6.
6. Второй первичных антител (инсулин, глюкагон)
- Инкубируйте слайды в Диб в течение 20 минут. Мыть два раза TBST.
- Блок с 10% нормальной козьей сывороткой в 20% окон в авидин TBST (инсулин) или Снайпер (глюкагон) в TBST в течение 20 минут. Мыть два раза TBST.
- Инкубируйте инсулина или глюкагона первичных антител в течение 15 минут. Мыть два раза TBST.
- Инсулин: Инкубируйте слайды в биотинилированного козьего анти-морских свинок в разведении 1:300 в течение 30 минут. Мыть два раза TBST. Инкубируйте со стандартным веКонструктор по ABC-AP реагента в течение 30 минут. Мыть два раза TBST.
- Глюкагон: Инкубируйте слайды в буфере в течение 30 минут с последующим антимышиного щелочной фосфатазы (AP) полимера в течение 30 минут. Мыть два раза TBST.
- В то время как слайды инкубировали в конъюгатов, согреть буфер LPR до комнатной температуры. Добавьте 1 каплю жидкости постоянный красный (LPR) в 3 мл буфера немедленно перед использованием и места в стойке реагент Dako. Инкубируйте слайды в LPC в течение 4 минут. Мыть два раза водой.
- Инкубируйте слайды в гематоксилин в течение 1 минуты. Промыть два раза водой.
- Инкубируйте слайды в TBS рН 7,6 в течение 1 минуты. Промыть два раза водой.
- Выгрузка слайды из DAKO Autostainer.
- Сразу обезвоживают слайды окрашивали панкреатический полипептид. Для всех слайдов двойного окрашенных, сухих, по крайней мере 1 часа, затем обезвоживают.
7. Обезвоживание
- Место скользит в 80% этаноле в течение 1 минуты.
- Опустите слайдов в 95% этанола. Держите слайдов в 95% этаноле в течение 30 секунд.
- Передача слайдов на 100% этанола и удерживайте нажатой клавишу 1 минуту. Повторите.
- Dip слайдов в ксилол.
- Держите слайды в ксилоле в течение 1 минуты. Повторите.
- Сразу установить покровные на слайды, используя cytoseal.
8. Слайд маркировки
- Введите информацию случае выявления в том числе органов и номер блока, пятна, а также дату и печать. Серийный номер раздела не является обязательным для первых пятен слайд каждого блока. Последующие уровни обозначены нумерации.
- Поместите этикетки на слайдах.
9. Сканирование слайдов
- Поместите окрашенных слайдов в лоток сканера и сканировать по приборов.
- Организация слайдов донора и типа ткани (поджелудочной железы, головы, туловища, хвоста, селезенка).
- Архив окрашенных слайды при комнатной температуре и оставшиеся неокрашенными слайды при температуре -20 ° C до использования.
10. RepreseРезультаты ntative
Это окрашивание процедуры были разработаны для сети JDRF для поджелудочной органов доноров с сахарным диабетом (nPOD), чтобы обеспечить базовые характеристики парафина и свежезамороженной блоков. Каждый донор имеет базовые характеристики осуществляется в составе окрашивание в 2 кварталах от каждой области поджелудочной железы (голова, тело и хвост) и селезенки (рис. 1, см. также случай отправки формы, Приложение 1). H & E окрашивание проводится с использованием autostainer запрограммированы как на медицинское учреждение с клиническими класса решений, используемых во всем. В качестве дополнительных блоков доноры подразделяются, у каждого есть слайд приняты для H & E, чтобы показать ткани морфологии. Когда блоки подразделяются вновь, как и для распространения среди исследователей, более глубоких уровнях будут также приняты на слайдах представитель H & E слайды документировать ткани морфология весь блок, а также нумерация серийных срезов на каждом уровне. Витражи слайды помеченыслучае идентификации, поджелудочной железы региона, номер блока, пятна и даты (рис. 2) и сканирования в онлайн патологии системы управления информацией. Представитель изображения с контролем доноров показано на рисунке 3 при низких и высоких увеличениях, чтобы показать ожидаемые результаты после этой процедуры. Слайд окрашенных панкреатический полипептид (D, H) была проверена на другой день с анализа выполняется вручную и показывает уменьшить интенсивность окрашивания гематоксилин контрастирующая окраска. Различия в интенсивности окрашивания первичных антител или контрастирующая окраска между анализов следует избегать, особенно если, используя анализ изображения в противном случае скользит, требуют индивидуальной коррекции цвета для достижения тех же областях ячейки или на счету.
Каждая лаборатория должна рассчитывать на оптимизацию концентрации антител, как много к много вариаций и других реагентов и условия могут повлиять на интенсивность окраски и специфичностью. С приобретением новых REAгоспода, окрашивание процедуры проверки с известными положительные и отрицательные контрольные образцы для достижения той же степени интенсивности окраски, как и бывший реагентов. Дополнительная антител оптимизированы основные nPOD патологии приведены в таблице 2 в качестве справочного источника и были использованы для multilabeling иммунофлюоресценции анализы для конфокальной микроскопии.
Рисунок 1. Dako окрашивания сетки. Эта схема изображена рутинного анализа с nPOD поджелудочной железы донора осуществляется на autostainer Dako. NPOD доноров кодируются с 4-значный идентификационный номер. Два лотка слайде показаны слайды с организованной пятно. Альтернативная конфигурация слайд ожидается в зависимости от количества доноров слайдов. Положительный контроль включает включение известного положительного донора для двух двойных пятен и селезенки донора для Ki-67 и CD3. Отрицательные элементы управления в два раза и включает два SLIде от одного донора поджелудочной железы блок инкубировали с иммуноглобулинов (Ig) от принимающей видов первичных антител и двух слайдов доноров селезенки для инсулина и глюкагона.
Рисунок 2. Представитель двойные окрашенные слайдов. Типичный слайд готовой показан слайд с параметрами маркировки и тканей размещение до цифрового сканирования выполняется.
Рисунок 3. Представитель H & E и IHC пятна в поджелудочной разделов. Разделы из поджелудочной железы взрослой женщины донорского органа (6096-04 Panhead) были окрашены и цифровое сканирование проводили, как описано в протоколе. Изображения были получены с использованием ImageScope программой просмотра всего раздела (AD) и от одного островка (ГБ). Ожидается островок пятна интенсивности на инсулин, глюкагон, панкреатический полипептид и являютсянаблюдается на участках, как BD разделе разъясняются D, что этот блок головки поджелудочной железы содержит небольшую часть крючковатыми региона или вентральной доли поджелудочной железы, как и все островки содержат в основном панкреатический полипептид-положительных клеток. Обратите внимание, что гематоксилин контрастирующая окраска в панели D слишком светлое время гематоксилин контрастирующая окраска интенсивности в В и С являются оптимальными. Панели EH показать островок из спинной доли с ожидаемым распределением β-клеток и α-клеток. Несколько панкреатический полипептид клетки находятся в нижней левой части островка (H). А, Е-Н &E; B, F-Ki67 + инсулин, C, G-CD3 + глюкагон, D, H-панкреатический полипептид. Н.э., 0,2 x, EH-12.8x.