Чик в ово электропорации это техника, которая позволяет генетические манипуляции птичьего эмбриона. Общие применения этого метода относятся функциональный анализ генов и предполагаемых элементов усилителя. Это видео демонстрирует нейронных электропорации трубки в HH 10 куриных эмбрионов. Техника инъекций и надлежащее обращение с яйцом обсуждаются.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В Ovo Electroporations Его Святейшества Стадия 10 эмбрионов куриного
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Большой размер и внешний развития куриного эмбриона уже давно сделали его ценным инструментом в изучении биологии развития. С появлением молекулярно-биологических методов, цыпленок стал полезной системой, в которой для изучения регуляции генов и функции. По electroporating ДНК или РНК конструкции в развивающихся куриных эмбрионов, гены могут быть выражены или сбит с целью анализа в функции гена естественных условиях. Аналогичным образом, репортер конструкций может быть использован для отображения судьбы или для изучения предполагаемых генов регуляторных элементов. По сравнению с аналогичными экспериментами в мыши, птенец электропорации имеет преимущества быть быстрым, простым и недорогим. Это видео демонстрирует первых, как сделать окно в яичной скорлупе манипулировать эмбриона. Затем эмбрион визуализируется с разбавленным раствором тушь вводили ниже эмбриона. Иглой стекло и пипетки используются для введения ДНК и быстрый зеленый краситель в развивающихся нервной трубки, то платиновые электроды расположены параллельно эмбриона и короткие электрические импульсы вводятся с генератора импульсов. Наконец, яйцо запечатанных скотчем и положил обратно в инкубатор для дальнейшего развития. Кроме того, видео показывает правильное хранение и обращение с яйцом и обсуждаются возможные причины эмбриона электропорации следующие потери.
Протокол
Яйцо обработке
- Яйца можно хранить при температуре 13 ° С не более одной недели до инкубации без значительной потери жизнеспособности (небольшой кулер вино идеально подходит для этой цели).
- До инкубации яиц позволяют нагреться до комнатной температуры, затем поместить в увлажненной куриный инкубатор набор до 37,8 ° C (100 ° F).
- Мы обычно electroporate эмбрионов около 48 часов от начала инкубации, когда эмбрион достиг Гамбургер и Гамильтон этапе 10.
- Время инкубации может меняться в зависимости от желаемого Гамбургер и Гамильтон стадии. Температура имеет большое значение и отклонение от оптимальной температуры инкубации изменит вр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол обеспечивает пошаговое руководство для нейронных электропорации трубки HH10 куриных эмбрионов. В дополнение к показу техники, рекомендации по хранению и обработке яиц также предоставляется. Эта методика имеет широкий спектр применения для генетического анализа, а легкость и низкая стоимость экспериментов делает их возможным для многих лабораториях.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Инкубатор для куриных яиц | увлажненный, установлен на 37,80°C (100F). | ||
| Генератор импульсов | Генетроника | BTX T820 | Генератор прямоугольных импульсов или аналог |
| Электроды | Электроды были изготовлены из платиновой проволоки диаметром 0,25 мм; их длина составляла 5 мм, а расстояние между ними — 1 мм. | ||
| Соединительные кабели | |||
| Микроманипулятор | |||
| Диссекционный микроскоп | с большим рабочим расстоянием | ||
| Стеклянные капилляры | и капиллярный вытягиватель или коммерческие стеклянные иглы | ||
| Лейбовиц’среда L-15 | |||
| куриные яйца | оплодотворенный | ||
| Изогнутые ножницы | |||
| шприц объемом 10 мл | |||
| Игла с широким просветом | 16–18G | ||
| Ротный пипеточный метод | |||
| Тушь индийская | |||
| Инсулиновый шприц/шприц | |||
| Плазмидная ДНК | ≥ 1μг/μл в стерильном TE или 1X PBS, содержащем 0,05% красителя Fast Green |
Ссылки
- 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
