Автоматизированная количественная оценка Synaptic флуоресценции в<em&gt; С. Элеганс</em

Краткое содержание

Обилие рецепторов нейромедиатора группируются в синапсах сильно влияет синаптической силы. Этот метод количественной флуоресцентно-меченных рецепторов нейромедиатора в трех измерениях с одного синапса резолюцию С. Элеганс, Что позволило в сотни синапсов, быстро характеризуется в пределах одного образца без искажения, вносимые г-плоскости проекции.

Аннотация

Сила синапса определяется амплитудой постсинаптических ответов на события высвобождения пресинаптического нейромедиатора и оказывает значительное влияние на общее функционирование нейронных цепей. Сила синапса критически зависит от количества нейромедиаторных рецепторов, кластеризованных в синаптических зонах постсинаптической мембраны. Уровни рецепторов устанавливаются в процессе развития и могут изменяться за счет транспорта рецепторов между поверхностными, субсинаптическими и внутриклеточными пулами, что представляет собой важные механизмы синаптической пластичности и нейромодуляции. Строгие методы количественной оценки содержания синаптически локализованных нейромедиаторных рецепторов необходимы для изучения развития и пластичности синапсов. Флуоресцентная микроскопия является оптимальным подходом, поскольку она сохраняет пространственную информацию, позволяя отличать синаптические пулы от несинаптических и дифференцировать популяции рецепторов, локализованные в синапсах разных типов. Генетический модельный организм Caenorhabditis elegans особенно хорошо подходит для таких исследований благодаря малому размеру и относительной простоте его нервной системы, прозрачности, а также наличию мощных генетических методов, позволяющих исследовать нативные синапсы в интактных животных.

В данной работе мы представляем метод количественного определения флуоресцентно-меченных синаптических рецепторов нейромедиаторов у C. elegans. Его ключевой особенностью является автоматизированная идентификация и анализ отдельных синапсов в трех измерениях в выходных файлах многоплоскостного конфокального микроскопа с табулированием положения, объема, интенсивности флуоресценции и общей флуоресценции для каждого синапса. Этот подход имеет два основных преимущества по сравнению с ручным анализом проекций z-плоскостей конфокальных данных. Во-первых, поскольку в анализ включается каждая плоскость набора конфокальных данных, данные не теряются при z-проекции, которая обычно основана на средних значениях или максимумах интенсивности пикселей. Во-вторых, идентификация синапсов автоматизирована, но может контролироваться экспериментатором по мере анализа данных, что позволяет быстро и точно извлекать данные из большого количества синапсов. Таким образом можно легко получить данные о сотнях или тысячах синапсов на образец, создавая большие наборы данных для максимизации статистической мощности. Также обсуждаются аспекты подготовки C. elegans к анализу и проведения конфокальной визуализации для минимизации вариабельности между животными внутри групп обработки. Хотя данный метод был разработан для анализа постсинаптических рецепторов C. elegans, он в целом полезен для любого типа синаптически локализованных белков или, фактически, любого сигнала флуоресценции, локализованного в дискретных кластерах, пунктах или органеллах.

Процедура выполняется в три этапа: 1) подготовка образцов, 2) конфокальная визуализация и 3) анализ изображений. Этапы 1 и 2 специфичны для C. elegans, в то время как этап 3 применим к любому точечному флуоресцентному сигналу на конфокальных микрофотографиях.

Протокол

1. Подготовка червей для работы с изображениями

Этот сегмент протокол основан на опубликованных C. Элеганс культуры методами ^1,2 и изложена на рисунке 1.

1. Рост червей на высоком пептон NGM агаром (10 см) с семенами Na22 E. бактерии кишечной палочки до почти голодали. Если окрашивания, одной пластины надежно производить достаточное количество червей в течение 1 человек пятно, с учетом потерь в пути, и жесткие критерии для выбора червей для работы с изображениями (см. часть 2).
2. Урожай червей, поливая несколько мл DDH ₂ 0 на пластине, циркулируя кратко и заливки жидкости в 15 мл коническую трубку (повторите, если необходимо перевести большую часть червей в пробирку). Гранул в клинической центрифуге в течение 3 мин, 1000x г. Вымойте гранул 1-3x с DDH ₂ O до супернатант ясно, удалить остатки бактерий. Использование пипетки полипропилена передачи удалить супернатантах, как черви придерживаться стекла(От этого шага вперед очень важно, чтобы свести к минимуму время между шаги, чтобы избежать потери жизнеспособности яйца).
3. После последней стирки, Ресуспендируйте червь гранул в 5 мл щелочного раствора гипохлорита лизировать червей и выпуск яиц. Рок мягко, и исследовать трубы под микроскопом рассечения примерно раз в минуту. Когда около 50% червей лизируются (они появятся согнуты и взломан), прекратить лизис путем заполнения трубы сверху яйцом буфера, переворачивая несколько раз, и гранулирования в течение 3 мин, 1000x г. Лизис времени не должна превышать 5 мин.
4. Удалить супернатант с передачей пипетку и промыть гранул 3 раза с яйцом буфера.
5. Чтобы отделить яйца от мусора, они плавали на подушке на 30% сахарозы в DDH ₂ O: после последней промывки с шагом 1.4, осторожно удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл DDH ₂ 0. Добавьте 5 мл стерильного 60% сахарозы в DDH ₂ O, и хорошо перемешать. Спиновая в клинической центрифуге 6 мин, 1000x г. Яйца будут собирать на мениске (они будут Хаве мутный вид), а мусор будет гранул.
6. Использование пластиковой пипетки передачи поглощать яйца в минимальном объеме и передать unseeded пластин агара НГО. Любые яйца придерживаясь стороне трубки можно промыть осторожно и передается, как хорошо. Один 10 см unseeded пластины на штамм проанализированы достаточно.
7. Инкубируйте unseeded пластины с яйцами в течение ночи (~ 16 часов) при 20 ° C. Вентиляционная пластина в течение первых нескольких часов, чтобы высушить его, оставив крышку немного не в течение нескольких часов, но обязательно, чтобы покрыть всю ночь.
8. После вылупления, передает L1 личинок 15 мл коническую трубку в базальных S (добавить в базальной пластинке, вихревые несколько мл S, залить в трубку). Гранул в клинической центрифуге (3 мин, 1000x г), ресуспендируют в минимальном объеме базальной S и передачи до 10 см NGM агаром высевают с Na22 бактерий. Используйте 2 пластины здесь для каждого оригинальную пластинку, начиная с шага 1.1. Инкубировать до черви достигают желаемого возраста.
9. Мониторинг культур один или два раза в день. Если они находятся в опасности ое голодали, передать свежее Na22 пластин. Для дикого типа червей N2, голода предшествует формирование линии или волна червей, который перемещается через пластину, животные мигрируют массово отдельно от пищевых продуктов, обедненных зон. После этого формы, пища будет полностью исчерпана в течение нескольких часов.
10. Черви готовы для окрашивания или живые изображения. Крепление и окрашивание червей подвеска оптимальным, поскольку большое количество интактных черви могут быть отображены легко. Окрашивание процедуры, основанные на Финни и Ruvkun протокол ^3-6 предпочтительнее замораживания взломать процедуры, потому что большое количество червей, необходимых для обработки изображений.

2. Конфокальной микроскопии

1. Установите червей на слайдах для конфокальной микроскопии. Отрегулируйте плотность червей до нескольких сотен на микролитр. Сделать площадку на 2% агарозном в S-базальных окружен тонким кольцом вазелином для предотвращения испарения во время съемки (применяется по 3 мл шприца снабжены отсечки 25 иглы). ПипетироватьНесколько мкл червя подвески на покровное стекло (если использовать обезболивающий изображения живых червей), а также снизить площадку агарозы на покровное стекло, распространение червей равномерно по площадке.
2. Выбор червей для работы с изображениями. Выберите червей, где синапсы интересы ориентированы на объектив с радиального смещения не более чем на ± 45 ° (при 0 ° означает, ориентированных непосредственно на цели). Выполнить эту оценку быстро (несколько секунд), чтобы избежать фотообесцвечивания. Масштабы начальной культур оптимизированы для обеспечения достаточного черви удовлетворить эти геометрические критерии.
3. Заполните конфокальной микроскопии образца. Относительно плоских образцов, которые могут быть включены в около 14 0.4 мкм толстым слоем наилучшие результаты. Высокая скорость, низкое разрешение изображений (512 х 512 пикселей) достаточно для быстрого точного сбора данных. Избегайте насыщения детектора с чрезмерной силы сигнала, так как это приведет к занижению флуоресценциисигналов.

3. Автоматизированная идентификация и анализ отдельных кластеров Synaptic

1. Открыто несколько выходных файлов TIF с использованием конфокальной микроскопии Volocity 4.0 (или выше) программного обеспечения (PerkinElmer).
2. Урожая от областей изображения, которые не содержат структуры интереса (Image -> Расширенные Focus -> Выбрать сферу интересов с помощью "Freehand ROI" инструмент -> Действия -> Crop на выбор; Рисунок 2А). Обратите внимание, расширенный фокус производит г-плоскости проекции на экране компьютера, чтобы помочь Вашим анализом, но не влияет на исходные данные, то же самое относится и к яркости и контрастности, в случае необходимости).
3. Измерьте длину области проанализированы с помощью Line Tool. Длина линии будет рассчитан и добавил к таблице данных (рис. 2В).
4. Выявление объектов с помощью "объектов по интенсивности" фильтр (Измерения режим). Укажите порог, что синаптические кластероввыделены и не-синаптической фон не (рис. 2). Включение независимого синаптических маркером помечены другим цветом может помочь однозначно идентифицировать синапсов. Типичные синапсов варьироваться от нескольких до нескольких сотен вокселей. Установите порог один раз, используя контрольный образец, и использовать его для всех последующих образцах. Выделение каждого образца в отдельности неприемлемо, поскольку оно представляет потенциал для экспериментатора предвзятости. Объекты выбираются таблицы и автоматически (рис. 2D).
5. Организовать и экспорт данных. Ликвидация объектов 2 или меньше вокселей, поскольку они, как правило фоне пятна. Они могут быть устранены путем дальнейшей фильтрации, или во время последующего анализа. Для облегчения удаления вниз по течению, отсортировать файл данных "размер объекта", так они будут все группы вместе. Экспорт данных в CSV формат, который можно открыть с помощью Microsoft Excel или другие программы электронных таблиц. Каждое изображение производит один выходной файл.
6. Если Volocity мягкийПосуда недоступна, альтернативные методы для анализа Z-плоскости проекции конфокальной данные могут быть использованы (например, ссылка ^7, или ручной анализ с использованием ImageJ), хотя в 3-мерном информация теряется (см. Обсуждение).

4. Представитель Результаты

Количественного метода, изложенного должны быть в состоянии различать кластер популяций разных яркости и разных объемов. Представитель изображения и соответствующие количественные данные представлены на рисунке 3 показаны примеры дифференциации на основе этих параметров. Как правило, результаты должны соответствовать тому, что видно на глаз. В случае UNC-49 ГАМК-рецепторов иммунной брюшной нервной С. Элеганс, все животные обычно оказались очень близки по размерам и степени зрелости, а общая синаптических флуоресценции значений для группы из пяти червей (нормированной на длину шнура нерв проанализировал) показали Стандартная ошибка значения около 10% от среднего ^4. Генетические мутации и другие экспериментальные процедуры (например, лекарственного препарата) может изменить не только объем и значение интенсивности и частоты распределения синаптических кластеров, но, возможно, с развитием времени курс и синхронность червей, что приведет к повышению изменчивости. Однако количественные результаты всегда должны отражать то, что можно оценить визуально, и если нет, то проверка образов и объектов, определенных Volocity должны выявить, где произошла ошибка и предложить меры по исправлению положения, такие как повторное порога или удаление артефактного объектов.

Рисунок 1. Подготовка синхронных C. Элеганс культур. синхронных культур получены от этой процедуры, потому что C. Элеганс развития аресты и L1 личиночной стадии при отсутствии пищи, и возобновляется, когда пища вводится.

ove_content ">
Рисунок 2. Количественный синаптических puncta.

1. Посторонние области изображения обрезаются, чтобы уменьшить размеры файлов и увеличения специфичности. Левая панель показывает рукой, начиная изображения, средняя панель показывает выбранный регион, правая панель показывает изображение после обрезки. Красный сигнал UNC-49 ГАМК-рецепторов иммунофлюоресценции, зеленый сигнал synaptobrevin-GFP (пресинаптических маркеров), выраженные в пресинаптических ГАМК-нейронов ^4. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
2. Линия длины отрезка нерва шнур должны быть проанализированы, а его длина автоматически записывается в таблице результатов. Эта информация необходима для нормализации синаптических данных из-за длины шнура анализируемых нерва, которая может изменяться в несколько раз, если черви станут фрагментированными, во время окрашивания.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить цифру.
3. Порог применяется для идентификации отдельных синаптических кластеров. Левая панель показывает изображение до порога, примеры различных уровней порога приведены в отдельной панели (зеленый сигнал опущен). Каждый выявленный объект изображен на картинке, как цветные области. Обратите внимание на соответствие между визуально очевидно синаптических кластеров в самой левой панели и цветных областей на самой правой панели. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
4. Каждый выявленный объект перечислены отдельно в таблице результатов. Отдельные объекты могут быть выбраны и выделены на изображение для проверки, если необходимо. Обратите внимание, что таблица содержит информацию для красного («родамин) и зеленый (« EGFP) каналов; зеленый канал информации может ввести в заблуждение, так как объекты былиопределены на основе строго по красной флуоресценции. Этот анализ также может быть выполнена на одном цветные изображения. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3. Представитель результаты. Представитель микрофотографии от дикого типа C. Элеганс окрашивали для UNC-49 ГАМК-рецепторов до (А) и после (б) лечение мусцимола, ГАМК-агонистов рецепторов, который вызывает рецепторов стать подавленные после длительной экспозиции. Панели показать обрезать изображения до (слева) и после (справа) порога и удаления небольших пятна фона. (C) Земельные участки количественных параметров синаптических образцах показано в (A) и (Б): общая флуоресценции, нормированные на нервы Длина шнура (слева) и кумулятивные гистограммы вероятности отдельного содержания флуоресценции синапс (в центре) и синапсов объема (Рогт), демонстрируя статистически значимое снижение синаптической содержание и объем индуцированных агонистами экспозиции (п = 60 синапсов для необработанной, п = 115 синапсов для мусцимола обработанные, р <0,001, Колмогорова-Смирнова http://www.physics.csbsju .edu / статистика / KS-test.html ).

Обсуждение

Метод, представленная здесь, предназначен для извлечения количественных многопараметрических данных для больших групп населения синапсов в C. Элеганс, при максимальном последовательности в группах. Три особенности способствуют достижению этих целей. Во-первых, окрашивания осуществляется на синхронные популяции червей, чтобы все животные того же возраста. Этот шаг важен, потому что развитие регуляции экспрессии уровней могут скрывать последствия экспериментального лечения (например, UNC-49 ГАМК-рецепторов иммуно...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название программы	Компания		Комментарии (опционально)
Volocity v4.0 или выше	PerkinElmer / Improvision		Проверьте свои местные средства основного изображения для доступа к этим программным обеспечением. Демо-программа доступна на сайте PerkinElmer. Этот метод требует только количественное модуль Volocity.
			Таблица 2. Специальные реагенты и оборудование.
			Яйцо буфер NaCl KCl CaCl 2 MgCl 2 HEPES (Регулировка рН до 7,3) 118 мм 48 мм 2 мМ 2 мМ 24 мм Щелочная гипохлорита (5 мл) Свежий бытового отбеливателя (отказаться от бутылки через 30 дней после открытия) 10 N NaOH DDH 2 O 1,0 мл 0,25 мл 3,75 мл
			Таблица 1. Решения.