Методическая статья

In Vitro Анализ PDZ-зависимый CFTR высокомолекулярных комплексов сигнализации

11K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4091

⸱

13 августа 2012 г.

 ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Wayne State University School of Medicine, 2Cardiovascular Research Institute, Wayne State University School of Medicine, 3Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Муковисцидоз трансмембранной проводимости регулятора (CFTR), эпителиальный канал хлорид, как сообщается, взаимодействуют с различными белками и регулировать важные клеточные процессы, среди которых CFTR PDZ мотив-опосредованного взаимодействия были хорошо документированы. Этот протокол описывает методы, которые мы разработали, чтобы собрать PDZ-зависимый CFTR макромолекулярных сигнализации комплекс В пробирке.

Аннотация

Регулятор трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR), хлоридный канал, расположенный преимущественно на апикальных мембранах эпителиальных клеток, играет ключевую роль в трансепителиальном гомеостазе жидкости1-3. CFTR связан с двумя основными заболеваниями: муковисцидозом (МВ)4 и секреторной диареей5. При МВ синтез или функциональная активность Cl--канала CFTR снижена. Это заболевание встречается примерно у одного из 2 500 представителей европеоидной расы в Соединенных Штатах6. Чрезмерная активность CFTR также наблюдается при случаях токсин-индуцированной секреторной диареи (например, вызванной холерным токсином и термостабильным энтеротоксином E. coli), которая стимулирует выработку cAMP или cGMP в кишечнике7.

Накапливающиеся данные свидетельствуют о существовании физических и функциональных взаимодействий между CFTR и растущим числом других белков, включая транспортеры, ионные каналы, рецепторы, киназы, фосфатазы, сигнальные молекулы и элементы цитоскелета; было показано, что эти взаимодействия между CFTR и его связывающими белками играют критическую роль в регуляции опосредованного CFTR трансэпителиального транспорта ионов in vitro, а также in vivo8-19. В данном протоколе мы фокусируемся исключительно на методах, способствующих изучению взаимодействий между карбоксильным концом CFTR, который обладает белковяжущим мотивом [обозначаемым как мотив PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ)], и группой каркасных белков, содержащих специфический связывающий модуль, называемый PDZ-доменами. На сегодняшний день сообщалось о нескольких различных PDZ-каркасных белках, связывающихся с карбоксильным концом CFTR с разной степенью сродства, таких как NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2 и GRASP20-27. PDZ-мотивом внутри CFTR, который распознается PDZ-каркасными белками, являются четыре последние аминокислоты С-конца (т. е., 1477-DTRL-1480 в человеческом CFTR)20. Примечательно, что CFTR может связываться более чем с одним PDZ-доменом как NHERF, так и PDZK1, хотя и с разным сродством22. Было показано, что такая мультивалентность в отношении связывания с CFTR имеет функциональное значение, что позволяет предположить, что PDZ-каркасные белки могут способствовать формированию макромолекулярных сигнальных комплексов CFTR для специфического/селективного и эффективного сигналинга в клетках16-18.

Для изучения белковых взаимодействий с участием CFTR было разработано множество биохимических методов анализа, таких как коиммунопреципитация, метод пул-даун (pull-down), анализ парного связывания, колориметрический анализ парного связывания и анализ сборки макромолекулярных комплексов16-19,28,29. В данной работе мы подробно рассматриваем процедуры сборки in vitro макромолекулярного комплекса, содержащего CFTR и зависящего от PDZ-мотива, который широко используется в нашей лаборатории для изучения белок-белковых или домен-доменных взаимодействий с участием CFTR16-19,28,29.

Протокол

1. Выражение и очистка рекомбинантных белков слияния меткой у бактерий

  1. Усиление определенных регионах С-хвосты (последние 50-100 аминокислот, содержащих PDZ мотивы в С-конца) для CFTR, 2 МПУ, MRP2, MRP4, β 2 AR, и NHERFs (во всю длину или PDZ1 или PDZ2 области ) на подходе ПЦР.
  2. Клонирование ПЦР-продуктов в pGEX4T-1 вектор GST-синтез белков (например, GST-NHERFs, GST-MRP4 КТ), pMAL-C2 вектор MBP-синтез белков (например, MBP-β 2 AR КТ, MBP-CFTR CT ), а pET30 Его-S-белков слияния (например, его-S-CFTR CT Его-S-PDZK1).
  3. Преобразование в протеазы с дефицитом E. палочки штамма (BL21-DE3), чтобы минимизировать возможные рекомбинантный деградации белков.
  4. Рост культуры в течение ночи при 37 ° C в Лурия-Бертани среды (рН 7,0), содержащий соответствующие антибиотики (например, ампициллин или канамицин). Развести ночной культуры в 1:10 и расти в течение еще 2 ч при 37 ° C. Вдуче с 0,5-1 м М ИПТГ на ближайшие 4 ч при 30 ° C. Гранул клеток путем центрифугирования при 8000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
  5. Лизировать клетки Сахароза буфера (50 м М Трис-HCl, рН 8,0, 1 м М ЭДТА, 1 м M PMSF, и 10% сахарозы), содержащий лизоцим (1 мг / мл), 0,2% Triton X-100, а протеазы ингибиторы. Используйте 20 мл в осадок клеток, происходящих из 1 л культуры.
  6. Смешайте на роторном шейкере в течение 30 мин при 4 ° C.
  7. Спиновая на 20000 х г в течение 30 мин при 4 ° C. Соберите прозрачный супернатант.
  8. В прозрачный супернатант, добавляют 1 мл следующие смолы / агарозных шариков (50% раствор сахарозы в буфер):
    • Глутатион агарозном шарики для белков GST синтеза.
    • Талон бисером Его-S слитых белков.
    • Амилозы смолы для MBP белков слияния.
  9. Смешать в течение 4 ч при температуре 4 ° C на роторном шейкере.
  10. Вымойте бусины суспендирования в 1x PBS (15 мл), смешивание 2 милип, вращается со скоростью 800 × г в течение 2 минут, и отбрасывая супернатант. Повторите этот шаг для шесть раз.
  11. Элюции белка из бисера с использованием соответствующего буфера элюирования (2 мл элюирующего буфера в 1 мл из бисера).
    • Буфер для элюции белков слияния GST: 25 м М Трис-HCl (рН 8,0), 140 м М NaCl и 20 м M восстановленный глутатион.
    • Элюирование буфер для его белков слияния: 20 м М Трис-HCl (рН 8,0), 500 м М NaCl и 200 м М имидазола.
    • Элюции буфера для MBP белков слияния: 20 м М Трис-HCl (рН 8,0), 200 м М NaCl, 1 м М ЭДТА, 1 м M DTT, и 10 м M мальтозы.
  12. Диализировать элюированных белки от 2 л 1x PBS при 4 ° С (чтобы избежать возможной деградации белка). Изменение PBS каждые 4 ч в четыре раза. Концентрат белка помощью Centricon фильтр (10000 МВт среза, Millipore) и хранить в качестве небольшой порции при температуре -80 ° C.
  13. Detгорностай концентрации белка методом Брэдфорд. Оцените качество белка на SDS-страницы с помощью BSA в качестве стандартов. Если целостность белка не является удовлетворительным, вторичные процедуры очистки, такие как гель-фильтрации или ионного обмена могут быть использованы. (Например, мы использовали G-75 сефарозы колонке для дальнейшей очистки GST-синтез белка).

2. Культуры клеток и подготовки Клеточный лизат

  1. Культуры ребенка почек хомяка (ВНК) клеток, что стабильно более-экспресс CFTR-вес и CFTR-his10 или ВНК клетки, которые временно по-экспресс Флаг-LPA 2-вес или флаг-LPA 2-ΔSTL и Мадин-Darby собачьи почки (MDCK ) клеток, что стабильно более-экспресс MRP2 в минимально необходимого среднего орла (MEM), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и пенициллин / стрептомицин в полистирола колбах при температуре 37 ° C с 5% CO 2.
  2. Культуры человеческих эмбриональных почек 293 (HEK293) клеток, что стабильно более-экспресс CFTR-вес и CFTR-his10 в Дульбекко"Среды с изменения Орла (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и пенициллин / стрептомицин в полистирола колбах при температуре 37 ° C с 5% CO 2.
  3. Лизиса клеток в буфере для лизиса (PBS - 0,2% Triton-X-100 дополнена смеси ингибиторов протеаз, содержащей 1 м M phenylmethylsulphonyl фтора, 1 мкг / мл апротинина, 1 мкг / мл leupeptin, 1 мкг / мл пепстатина), использование 500 мкл буфера для лизиса для каждого 60-мм чашки Петри и 1000 мкл буфера для лизиса для каждого 100-мм чашки Петри.
  4. Рок клеточных лизатов в течение 20 мин при 4 ° С, и удалить нерастворимый материал с помощью центрифугирования при 16000 х г в течение 15 мин при 4 ° C. Определение концентрации белка в анализе Брэдфорда.

3. In Vitro Ассамблеи CFTR содержащими высокомолекулярных комплекс (CFTR-PDZK1-MRP4)

  1. В 200 мкл лизирующего буфера (PBS - 0,2% Triton X-100 + ингибиторы протеазы), добавьте 20 мкг очищенного GST-MRP4-C терминал50 а (CT50) гибридный белок.
  2. Добавить различных количествах (0-40 мг) очищенной Его-S-PDZK1 гибридного белка.
  3. Смешайте две белки на роторном смесителе при температуре 22 ° С в течение 1-2 часов.
  4. Добавить 20 мкл бисером глутатион (50% раствор) в белковую смесь, и продолжать смешивать еще 1 час. Этот шаг также называют попарно обязательным.
  5. За это время подготовить HEK293 клеточные лизаты, что гиперэкспрессией Флаг-CFTR (вес), как описано выше в шаге 2).
  6. Вымойте комплекс дважды лизис буфера. Спиновая 800 × г в течение 1 мин для каждого мытья и тщательно аспирации супернатант после каждого мытья. Будьте осторожны, чтобы не сосать у бусин в нижней.
  7. Добавьте выше подготовленные HEK293 лизатов клетки бисером, и осторожно перемешать при температуре 4 ° С в течение 3 часов (или ночь).
  8. Вымойте бисером широко три раза лизис буфера, как описано в шаге 3.6).
  9. Элюции белков с использованием 30 мкл буфера образца (5 ×): 0.6 M Трис-HCl (рН 6,8), 50% глицерина, 2% SDS и 0,1% бромфенола синий, содержащих 5% β-меркаптоэтанола.
  10. Инкубируйте в 37 ° С на водяной бане 10-15 мин, а спина при 5000 х г в течение 30 сек для осаждения бисера.
  11. Загрузите все элюата на 4-15% гель.
  12. Запуск SDS-PAGE около 30-40 мин.
  13. Передача белка полосы на мембрану PVDF, за 1,5 часа.
  14. Блок мембраны в TBS-твин, содержащий 5% без молочного жира.
  15. Инкубировать мембрану с первичными антителами (например, анти-IgG CFTR, R1104) при 4 ° C в течение ночи.
  16. Промойте мембрану с TBS-Tween в течение 5 минут, в шесть раз.
  17. Инкубируйте мембраны с вторичными антителами (например, антимышиного HRP-2 сопряженных антител) в течение 45 мин при 22 ° C.
  18. Промойте мембрану с TBS-Tween в течение 5 минут, в шесть раз.
  19. Визуализация белка полосы с помощью ECL.
  20. Представитель данные представлены на рисунке 1.
jove_title "> 4. Представитель Результаты

Пример CFTR содержащих высокомолекулярные сигнализации комплекса, который был собран в пробирке показано на рисунке 1. Макромолекулярных комплекс был создан между MRP4 С-концевой 50 аминокислот (MRP4-CT50), PDZK1 и полнометражных CFTR (рис. 1, внизу). Образование комплекса увеличена в зависимости от дозы с увеличением количества посредников белка, PDZK1 (рис. 1, внизу) 18.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Наглядное представление анализа сложных высокомолекулярных (сверху). Макромолекулярных комплекс был обнаружен в пробирке с тремя белками (GST-MRP4-CT50 Его-S-PDZK1, и флаг-CFTRwt) в зависимости от дозы (внизу) 18.

CFTR-NHERF1-β 2 AR (см. 14) CFTR-NHERF2-LPA 2 (см. 15) CFTR-PDZ белки-MRP 2 (см. 17) CFTR-PDZK1-MRP4 (см. 16)
Affinity бисера Амилозы смолы S-белка агарозном Амилозы смолы Глутатион агарозном
Очищенный белок-1 MBP-β 2 AR CT Его-S-CFTR CT MBP-CFTR CT GST-MRP4 CT
Очищенный белок-2 GST-NHERF1 GST-NHERF2 GST-PDZ белки Его-S-PDZK1
Очищенный белок-3 (или клеточных лизатов) CFTR-вес или CFTR-his10 (ВНК или лизаты НЕК клетки) ФлагМПУ-2-вес или флаг-LPA 2-ΔSTL (ВНК лизатов клеток) MRP2 (MDCK лизатов клеток) Очищенная Флаг-CFTR-вес или CFTR-his10 (или клеточных лизатов)
Антитело Анти-IgG CFTR Anti-Flag HRP Анти-IgG MRP2 Anti-Flag HRP

Таблица 1. Обзор различных CFTR содержащих высокомолекулярные комплексы собраны в пробирке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе мы показали метод в пробирке сборки и обнаружения CFTR содержащие высокомолекулярные сигнализации комплексного использования очищенных белков (или фрагменты белка) и / или клеточных лизатов, как сообщалось ранее 16-19,29,30. Для достижения наилучших результатов следующих критических точек в процессе подготовки требуют особого внимания:

  • Важно, что рН элюирующего буфера быть скорректирована до 8,0 после добавления восстановленного глутатиона при очистке GST-синтез белка, к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Наша работа была поддержана грантами от Американской ассоциации сердца (Большой Юго-Восточной Партнерская) Начало-грантов в помощь 0765185B, Эльза У. Парди фонда грант, и Wayne State University очной запуске фонда и научно-исследовательского института сердечно-сосудистой Isis инициативы награду. Этот метод экстракорпорального CFTR сборки сложных высокомолекулярных изначально первым доктором AP Naren (Университет Теннесси Научного центра здоровья).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии
pGEX4T-1 вектор GE Healthcare 28-9545-49 ранее Amersham Biosciences
pMAL-C2 вектор Новая Англия BioLabs
pET30 вектор EMD химическими веществами 69077-3 ранее Novagen
Глутатион агарозном бисера BD Biosciences 554780
Амилозы смолы Новая Англия BioLabs E8021S
Талон бисера Clontech 635501
восстановленного глутатиона BD Biosciences 554782
имидазол Рыбак BP305-50
мальтоза Рыбак BP684-500
S-белка агарозном EMD химическими веществами 69704-3 ранее Novagen
Anti-Flag HRP Сигма A8592
Анти-IgG CFTR Изготовленный на заказ R1104 МКА признании CFTR эпитоп в аа 722-734
Анти-IgG MRP2 Международный Chemicon MAB4148 Теперь часть Millipore

Таблица 2. Специальные реагенты и оборудование.

Ссылки

  1. Anderson, M. P. Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity. Science. 253, 202-205 (1991).
  2. Bear, C. E. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR. Cell. 68, 809-818 (1992).
  3. Quinton, P. M. Chloride impermeability in cystic fibrosis. Nature. 301, 421-422 (1983).
  4. Cheng, S. H. Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis. Cell. 63, 827-834 (1990).
  5. Gabriel, S. E., Brigman, K. N., Koller, B. H., Boucher, R. C., Stutts, M. J. Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model. Science. 266, 107-109 (1994).
  6. Li, C., Naren, A. P. CFTR chloride channel in the apical compartments: spatiotemporal coupling to its interacting partners. Integr. Biol (Camb). 2, 161-177 (2010).
  7. Chao, A. C. Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase. Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).
  8. Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship. Nature. 363, 263-268 (1993).
  9. McNicholas, C. M. Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8083-8088 (1996).
  10. Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells. J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).
  11. Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D. 2nd, Soleimani, M. CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF. Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).
  12. Ahn, W. Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct. J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).
  13. Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates. Embo. J. 17, 898-908 (1998).
  14. Naren, A. P. Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms. Nature. 390, 302-305 (1997).
  15. Naren, A. P. Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents. J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).
  16. Naren, A. P. A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).
  17. Li, C. Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions. J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).
  18. Li, C. Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia. Cell. 131, 940-951 (2007).
  19. Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer. Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).
  20. Hall, R. A. A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).
  21. Short, D. B. An apical PDZ protein anchors the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the cytoskeleton. J. Biol. Chem. 273, 19797-19801 (1998).
  22. Wang, S., Yue, H., Derin, R. B., Guggino, W. B., Li, M. Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity. Cell. 103, 169-179 (2000).
  23. Sun, F. E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells. J. Biol. Chem. 275, 29539-29546 (2000).
  24. Cheng, J. A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression. J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).
  25. Scott, R. O., Thelin, W. R., Milgram, S. L. A novel PDZ protein regulates the activity of guanylyl cyclase C, the heat-stable enterotoxin receptor. The Journal of biological chemistry. 277, 22934-22941 (1074).
  26. Lee, J. H. Dynamic regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by competitive interactions of molecular adaptors. The Journal of biological chemistry. 282, 10414-10422 (2007).
  27. Gee, H. Y., Noh, S. H., Tang, B. L., Kim, K. H., Lee, M. G. Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking via a GRASP-dependent unconventional secretion pathway. Cell. 146, 746-760 (2011).
  28. Naren, A. P. Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function. Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).
  29. Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane. The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).
  30. Li, C., Naren, A. P. Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes. Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).
  31. Wu, Y. A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases. J. Biol. Chem. , (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CFTRPDZpull downGSTHis tagHEK 293PDZ

Похожие статьи