В этой статье описывается метод выделения и очистки интактных Legionella Содержащего вакуоли (LCV) от амебы и макрофагов. Двухступенчатый протокол включает в себя LCV обогащения иммуно-магнитной сепарации с использованием антитела против бактериальных маркеров LCV и дальнейшей очистки центрифугирования в градиенте плотности.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Оппортунистический патоген Legionella pneumophila представляет собой амеборезистентную бактерию, которая также реплицируется в альвеолярных макрофагах, вызывая тяжелую форму пневмонии — «болезнь легионелляр»1. В фагоцитах простейших и млекопитающих L. pneumophila использует консервативный механизм для формирования специфического компартмента, допускающего репликацию, — «Legionella-содержащей вакуоли» (LCV). Формирование LCV требует наличия бактериальной системы секреции IV типа (T4SS) Icm/Dot, которая транслоцирует до 275 «эффекторных» белков в клетки хозяина. Эффекторы воздействуют на белки и липиды хозяина, а также взаимодействуют с секреторными, эндосомальными и митохондриальными органеллами2-4.
Формирование LCV представляет собой сложный, стабильный и избыточный процесс, который трудно постичь редукционистским методом. Для всестороннего понимания образования LCV требуется интегративный подход, включающий глобальный анализ взаимодействий факторов патогена и хозяина, а также их временной и пространственной динамики. В качестве первого шага к достижению этой цели проводится очистка интактных LCV с последующим протеомным и липидомным анализом.
Состав и формирование патогенсодержащих вакуолей исследовались с помощью протеомного анализа с использованием жидкостной хроматографии или двухмерного электрофореза в геле в сочетании с масс-спектрометрией. Вакуоли, выделенные из социальной почвенной амебы Dictyostelium discoideum или фагоцитов млекопитающих, содержали Leishmania5, Listeria6, Mycobacterium7, Rhodococcus8, Salmonella9 или виды Legionella spp.10. Однако протоколы очистки, применяемые в этих исследованиях, трудоемки и утомительны, так как они требуют, например, электронной микроскопии для анализа морфологии, целостности и чистоты LCV. Кроме того, в этих протоколах не используются специфические особенности патогенной вакуоли для обогащения.
Представленный здесь метод преодолевает эти ограничения за счет использования D. discoideum, продуцирующих флуоресцентный маркер LCV, и за счет нацеливания на бактериальный эффекторный белок SidC, который селективно закрепляется на мембране LCV, связываясь с фосфатидилинозитол-4-фосфатом (PtdIns(4)P)3,11. LCV обогащают на первом этапе с помощью иммуномагнитного разделения, используя аффинити-очищенные первичные антитела к SidC и вторичные антитела, конъюгированные с магнитными частицами, после чего на втором этапе проводят классическое центрифугирование в градиенте плотности Histodenz12,13 (Рис. 1).
Протеомный анализ изолированных LCV из D. discoideum выявил более 560 белков клетки-хозяина, включая белки, связанные с фагоцитарными везикулами, митохондриями, ЭР и аппаратом Гольджи, а также несколько ГТФаз, которые ранее не были связаны с формированием LCV13. LCV, обогащенные и очищенные с помощью описанного здесь протокола, могут быть далее проанализированы методами микроскопии (иммунофлуоресценция, электронная микроскопия), биохимическими методами (вестерн-блоттинг), а также протеомными или липидомными подходами.
Протокол
1. Подготовка к изоляции LCV
- Подряд из Legionella Pneumophila производства DsRed-Express 13,14 с глицерином акций на CYE пластин агар с 5 мкг / мл хлорамфеникола (Cam) за четыре дня до изоляции LCV. Инкубируйте бактерии при температуре 37 ° C.
- Семенной выход 1 х 10 7 D. discoideum производства GFP-calnexin или RAW264.7 мышиных макрофагов в 75 см 2 ткани культуры колб за день до заражения. Используйте 10 мл HL5 среду с 20 мкг / мл G418 для D. discoideum и инкубировать амеб при 23 ° C. Для RAW264.7 макрофагов использовать 10 мл RPMI 1640 с добавлением 10% FCS (тепло инактивированная) и 1% глютамина, и роста клеток при 37 ° С и 5% CO 2. Используйте по крайней мере три 75 см 2 колбы на инфекции и образец (не менее 6 х 10 7 клеток).
- Инокулировать ночной культуры L. Pneumophila от CYE пластины. Возьмите 15 мл пробирку с 3 мл АЙЕ среднегои 5 мкг / мл Cam. Инокулировать 100 мкл бактериальной суспензии для получения диаметр 600 нм до 0,1. Инкубируйте ночь культуры на накладные расходы вращения колеса при 37 ° С в течение 21-22 часов.
2. LCV изоляции
- Изменение среды D. discoideum клетки, чтобы удалить антибиотик, который будет влиять на следующие инфекции.
- Измерение ОП ночной культуры. Бактерии должны достигли своего пика в инфекционной диаметром 600 нм ≥ 3, что соответствует 2 х 10 9 бактерий / мл.
- Инфицировать клетки, добавив примерно 500 мкл L. Pneumophila ночь культуре клеток, растущих в 10 мл HL5 среды (D. discoideum) или 10 мл RPMI 1640 (макрофагов). Это соответствует множественность заражения (МВД) 50. Затем инфекция синхронизируется путем центрифугирования бактерий на клетках 500 × г в течение 10 мин. Центрифугирования следуетпо инкубации D. discoideum клеток при 25 ° С и RAW264.7 макрофагов при 37 ° С и 5% CO 2, соответственно. Инфекция время 1 час включает в себя центрифугирования шаг.
- После заражения удалить среды и промыть клетки один раз, чтобы удалить внеклеточных бактерий. Используйте ледяной СУРС буфер D. discoideum и ледяным PBS для RAW264.7 макрофагов. Добавьте 3 мл HS буфера, дополненные ингибиторы протеаз (Roche) в каждую колбу и собирает клетки с помощью клетки скребком. Бассейн соответствующие образцы в 15 мл пробирке.
- Для гомогенизации образца использованием 3 мл пластиковых Луер-Лок шприцы и нержавеющей стальной шарик гомогенизатора. Убедитесь, что вы работаете на льду. Перед началом работы мыть шар гомогенизатор с дистиллированной водой, чтобы избежать любых моющих средств загрязнения и промойте его с ледяной буфер HS, чтобы избавиться от пузырьков воздуха. Используйте 8 мкм оформления мяча.
- Заполните первые 3 мл в шприц унд смонтировать его на еэлектронной гомогенизатора. Нажмите образца и обратно девять раз через гомогенизатор. Заменить шприцы впоследствии, чтобы избежать загрязнения с не-гомогенизированный материал. Собрать и объединить усредненного образца в 15 мл пробирке и принимать по 150 мкл образцов для микроскопического анализа. Прежде чем перейти к другой пример разбирать и мыть шар гомогенизатора.
- Блок гомогената с 2% CS и ФТС в течение 30 минут на шейкере со льдом или на накладные расходы, прялка (10-20 мин) при температуре 4 ° C.
- После блокировки использовать аффинно очищенных антител к первичным SIDC (разведение 1:3000) или в отношении любой другой бактериальный маркер исключительно привязка к мембраны легких коммерческих автомобилей. Vortex раствор антител перед добавлением гомогената. Инкубируйте образца в течение 1 часа на качалке на льду или на накладные расходы, прялка (10-20 мин) при температуре 4 ° C.
- В то же время, подготовить градиент Histodenz. Используйте 15 мл пробирке в градиент и три 75 см 2 колбах одного образца. Ельм, добавляют 5,75 мл 35% Histodenz к трубе, а во-вторых, осторожно добавить 5,75 мл 10% Histodenz решением сверху. Затем тщательно заложить трубы горизонтально в течение 1 часа.
- После инкубации гомогената с блокированием реагентов и первичные антитела, центрифуги 600 × г в течение 15 мин при 4 ° С в гранулах образца. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 1,5 мл буфера HS. Передача образцов новой 15 мл пробирки и принять 40 мкл образца для микроскопического анализа в дальнейшем.
- Инкубируйте гранул с вторичными антителами - MACS козьего анти-IgG кролика микро-шарики (разведение 1:25) - в течение 30 минут на шейкере при температуре 4 ° C. В то же время, поставить колонки на MACS магнитный держатель и уравновешивать их с 0,5 мл буфера HS.
- Впоследствии, применяются образцы столбца. Соберите 150 мкл проточной для последующего микроскопического анализа. Промойте колонку в три раза с 0,5 мл буфера HS.
- Удалить столбцы из тОн магнита и элюата легких коммерческих автомобилей с 0,5 мл буфера HS непосредственным впрыскиванием. Возьмите 20 мл образец для микроскопического анализа. Очистка шаг за иммуно-магнитной сепарации ожидается выход в 1 × 10 7 заражены D. discoideum клетки около 1 × 10 6 нетронутыми легких коммерческих автомобилей, которые в семь раз о обогащенный элюата по сравнению с потоком до 13.
- Положите трубки Histodenz градиент обратно в вертикальное положение и аккуратно загружать элюата на вершине. Центрифуга труб в 3350 × г в течение 1 часа при температуре 4 ° C.
- После центрифугирования взять 1,5 мл фракции, начиная с нижней части пробирки, используя длинный стеклянный пипетки Пастера. Всего собрать восемь фракций, каждая из нижней части трубы. Нет видимых слоев наблюдаются в непрерывный градиент Histodenz. Наибольший выход легких коммерческих автомобилей, как правило, ожидается в часть 4 в соотношении ~ 2 × 10 5 нетронутыми легких коммерческих автомобилей на 1 × 10 7инфицированы амеб 13. Незначительные количества легких коммерческих автомобилей также присутствуют в долях 3 и 5, соответственно. Таким образом, общий выход очищенного легких коммерческих автомобилей составляет ~ 1 × 10 6 нетронутыми легких коммерческих автомобилей в 6 × 10 7 заражены D. discoideum клеток 13. Восстановление легких коммерческих автомобилей могут быть выполнены при комнатной температуре (RT) и легких коммерческих автомобилей появится стабильный в течение нескольких часов.
3. Микроскопический анализ проб
- Подготовка 24-и плоским дном культуры тканей пластины с поли-L-лизин покрытием покровные.
- Пипетировать каждого образца, принятых в ходе очистки LCV плюс 150 мкл каждой фракции градиента плотности в 24-луночного планшета. Добавить 0,5 мл HS буфера в каждую лунку, чтобы разбавить высокая концентрация Histodenz. После центрифуги пластины 600 × г в течение 10 мин при 4 ° C. Осторожно удалите супернатант и исправить образцов с 4% параформальдегид (PFA) в течение 20 мин при комнатной температуре. После фиксации мыть образцы в два раза. Намэлектронной СУРС для D. discoideum и PBS для RAW264.7 макрофагов.
- Установить образцы GFP-calnexin выражения D. discoideum, взятые на разных этапах в течение LCV изоляции, прямо на стекло слайдов с использованием, например Vectashield.
- Инкубируйте образцы RAW264.7 макрофагов, взятых на различных этапах в процессе выделения LCV, блокирующим раствором (1% BSA в PBS) в течение 10 мин при комнатной температуре. Использование анти-SIDC первичных антител к пятно легких коммерческих автомобилей и инкубировать в течение 1 ч во влажной камере при комнатной температуре (аффинно очищенных кроличьих анти-SIDC; 1:1000 в блокирующем буфере). Затем вымыть образцов три раза PBS. Инкубируйте с вторичными антителами (например, анти-кролик Cy5, 1:200 в блокирующем растворе) в течение 30 мин во влажной и темной камере при комнатной температуре. Наконец, промойте образцы три раза PBS и смонтировать их на стекло, слайды, используя, например, Vectashield.
- Морфология, целостность и количество легких коммерческих автомобилей изолированы от GFP-calnexin выражения D. расcoideum или RAW264.7 макрофагов анализируются флуоресцентный микроскоп оснащен адекватной фильтров.
4. Представитель Результаты
Качество и выход очистки LCV по иммуно-близость разделение и центрифугирование градиента плотности можно проследить с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 1). Обзор образцов, собранных во время изоляции LCV от D. discoideu м и макрофагов показано на рисунке (рис. 2). Гомогената Л. Pneumophila-инфицированных фагоцитов показывает нетронутыми легких коммерческих автомобилей, а также много обломков клеток и внеклеточных бактерий. После гранулирования образца, изображение похоже на гомогената, иногда немного плотнее. С нетронутыми легких коммерческих автомобилей должны придерживаться колонки, проточные содержит в основном внеклеточной бактерии и клеточные обломки. После элюирования образца из колонки элюата содержится нетронутыми легких коммерческих автомобилей в больших количествах. В наших руках, LCV purificati по-видимому, более эффективны для D. discoideum, чем для макрофагов. В D. discoideum возбудителя вакуоли появляются круглее и выход изолированных легких коммерческих автомобилей более чем в 10 раз выше по сравнению с макрофагами (рис. 3). В интактных макрофагов СНП окрашивали различные антитела появляются более неправильной формы.
Рисунок 1. Схема обзор изоляции LCV. А) выделение легких коммерческих автомобилей на иммуно-магнитной сепарации использованием аффинно очищенные антитела против бактериальных эффекторных SIDC белков, локализации исключительно мембраны легких коммерческих автомобилей. Микро вторичном MACS шарик связью антитела и магнита используется для изоляции легких коммерческих автомобилей с мобильного мусора. Б) После того, как иммуно-магнитного разделения легких коммерческих автомобилей дополнительно очищают Histodenz центрифугирования в градиенте плотности. Легких коммерческих автомобилей обогащены часть 4.
upload/4118/4118fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Проб, взятых во время очистки легких коммерческих автомобилей. Изображения из гомогената, окатышей, проточные и элюата из D. discoideum или макрофагов изображены. Пробы показывают, Л. Pneumophila производства DsRed-Express (красный) в области D. discoideum производства GFP-calnexin сигнала (зеленый, вверху) или в макрофагах окрашенных анти-SIDC антител (голубой, нижняя панель). Бары, 10 мкм.
Рисунок 3. Очищенный от легких коммерческих D. discoideum или макрофагов. Пробы показывают, фракция 4 после Histodenz центрифугирования в градиенте плотности Л. Pneumophila производства DsRed-Express (красный) в (A) D. discoideum производства GFP-calnexin сигнала (зеленый) или (B) в макрофагах окрашенных анти-SIDC антител (голубой). Бары, 10 мкм.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В отличие от ранее опубликованных методов, этот протокол основан на два этапа, первый разделения легких коммерческих автомобилей на иммуно-магнитного подход, а во-вторых, очищение легких коммерческих автомобилей на центрифугирования в градиенте плотности. Изоляция LCV можно легко проследить с помощью флуоресцентной микроскопии, когда либо флуоресцентно меченных бактерий и GFP-продуцирующих клеток или антител окрашивания используется. Протокол, описанный здесь простой, понятный метод, который приводит к обогащению легких...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Исследования в нашей лаборатории было поддержано Макс фон Петтенкофер Института Людвига-Максимилиана университета Мюнхена, Германское научно-исследовательское общество (DFG, HI 1511/3-1) и Bundesministerium für Bildung унд Forschung (BMBF) "Медицинская геномика инфекция" инициативы ( 0315834C).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Ссылки
- Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
- Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS ONE. 6, e17638(2011).
- Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella. Front Microbiol. 2, 91(2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Kima, P. E., Dunn, W. Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles. Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).
- Lührmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).
- Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).
- Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage. Traffic. 6, 635-653 (2005).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).
- Shevchuk, O. Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium. Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).
- Brombacher, E. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila. J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).
- Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3(2010).
- Urwyler, S. Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases. Traffic. 10, 76-87 (2009).
- Mampel, J. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
