Выделение эмбриональных нервного гребня из нервной трубки облегчает использование В пробирке Методы изучения миграции, самообновления и multipotency из нервного гребня.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эмбриональный нервный гребень (NC) представляет собой популяцию мультипотентных клеток-предшественников, которая возникает в дорсальной части нейральной трубки, претерпевает эпителиально-мезенхимальный переход (EMT) и мигрирует по всему эмбриону, давая начало различным типам клеток 1-3. NC также обладает уникальной способностью влиять на дифференцировку и созревание органов-мишеней4-6. При эксплантации in vitro предшественники NC подвергаются самообновлению, мигрируют и дифференцируются в различные типы тканей, включая нейроны, глию, гладкомышечные клетки, хрящ и кость.
Мультипотентность NC была впервые описана на эксплантатах нервной трубки птиц7-9. Изоляция клеток NC in vitro облегчает изучение динамики NC, включая пролиферацию, миграцию и мультипотентность. Дальнейшие исследования на моделях птиц и крыс показали, что эксплантированные клетки NC сохраняют свой потенциал NC при трансплантации обратно в эмбрион10-13. Поскольку эти внутренние клеточные свойства сохраняются в эксплантированных предшественниках NC, анализ эксплантатов нервной трубки представляет собой привлекательный вариант для изучения NC in vitro.
Для более глубокого понимания особенностей нейрального гребня (НГ) млекопитающих было разработано множество методов выделения популяций клеток НГ. Прогениторы, производные от НГ, могут быть культивированы из постмиграционных зон как эмбриона, так и взрослого организма для изучения динамики постмиграционных прогениторов НГ11,14-20, однако выделение прогениторов НГ непосредственно в момент их эмиграции из нейральной трубки обеспечивает оптимальное сохранение потенциала клеток НГ и их миграционных свойств13,21,22. В некоторых протоколах для выделения популяции НГ, обогащенной определенными типами прогениторов, используется метод сортинга клеток с флуоресцентной активацией (FACS)11,13,14,17. Тем не менее, при работе с эмбрионами на ранних стадиях развития с помощью FACS трудно получить количество клеток, достаточное для анализа, что затрудняет выделение ранних популяций НГ из отдельных эмбрионов. В данной работе мы описываем подход, который не зависит от FACS и позволяет получить популяцию НГ с чистотой примерно 96%, что подтверждено с помощью активированного Wnt1-Cre репортера клеточных линий23.
Представленный здесь метод адаптирован на основе протоколов, оптимизированных для культивирования NC крыс11,13. Преимуществами данного протокола по сравнению с предыдущими методами являются следующие: 1) клетки выращиваются без использования фидерного слоя, 2) для получения относительно чистой популяции NC не требуется применение FACS, 3) изолируются NC на премиграционном этапе и 4) результаты легко поддаются количественной оценке. Кроме того, этот протокол может быть использован для изоляции NC из любой мутантной модели мыши, что облегчает изучение характеристик NC при различных генетических манипуляциях. Ограничением данного подхода является то, что NC извлекаются из контекста эмбриона, который, как известно, влияет на выживаемость, миграцию и дифференцировку NC2,24-28.
Протокол
1. Подготовка пластин
- Использование стерильных во все времена.
- Подготовить фибронектин (FN) путем разбавления 100 мкл плазмы человека запас FN в конечном объеме 3,3 мл в PBS Дульбекко (DPBS). Конечная концентрация 30 мкг / мл, и это можно хранить при температуре 4 ° С в течение 1 недели.
- Крышка нижней части каждой скважины стерильной культуры тканей четыре хорошо пластины с решением FN и оставьте на 15 минут. Убедитесь, что вся поверхность покрыта. Сделать средств массовой информации в течение этого времени (шаги 2 и 3).
- Удалить НФ решения и позволяют пластины для просушки. Аккуратно промойте скважин с 500 мкл DMEM, удалить DM....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Особое внимание следует обратить на стадии развития эмбриона, чтобы обеспечить успех этого подхода. Подсчет сомитов ранних эмбрионов мыши имеет решающее значение как для стадии эмбриона в соответствие мусора и правильно определить регионы нервной трубки для изоляции. Изменение одного или двух сомитов между эмбрионов в разумных пределах развивающего времени, в зависимости от разрешения эксперимент. Эмбриона в возрасте от 9 до 9,5 ЦОД будут иметь от 17 до 25 сомитов. Если эмбрион имеет более чем 25 сомитов, НК еще более п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Марка Возняка для видео-помощь. Мы также хотели бы признать, Шон Моррисон в Техасском Университете в оригинальный протокол для культивирования клеток крысы NC. Работа выполнена при поддержке Университета Вандербильта Медицинского центра академической поддержки программ и грантов от NIH (HD36720 и HD036720-11S109) и АНА 11GRNT7690040 в PAL, predoctoral стипендии от AHA (0615209B) и NIH (NS065604), чтобы Движение неприсоединения, а также ERP было поддерживается обучение NIH грант T32HD007502.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагент | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| DMEM (низкий уровень глюкозы) | Гибко / Invitrogen | 11885 | |
| Neurobasal среднего | Гибко | 21103 | |
| BSA | Сигма | A3912-10G | |
| DPBS | Гибко | 14190-144 | |
| IGF1 | BD Biosciences | 354037 | Хранить в 50 мкг / мл аликвоты при -20 ° C. |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | Хранить в 25 мкг / мл аликвоты при -20 ° C. |
| Фибронектин | Гибко | 33016-015 | Хранится в 1mg/mL др.iquots при температуре -20 ° C. |
| Ретиноевой кислоты | Сигма | R2625 | Хранить в 35 мкг / мл порции после воссоздания в этаноле при температуре -20 ° C. |
| 2-меркаптоэтанол | Сигма | D-5637 | |
| N 2 дополнения | Гибко | 17502-048 | |
| B27 добавки | Гибко | 17504-044 | |
| Steriflip 0,22 мкм фильтры | Millipore | SCGP00525 | |
| Пенициллин, стрептомицин | Invitrogen | 15140122 | |
| 0,20 мкм фильтры | Гранулирование | 431219 | |
| Шприцы (для фильтрации) | BD Biosciences | 301604 | |
| Четыре луночных | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| Коллагеназы / Dispase | Roche | 269 638 | Активность меняется в зависимости от партии. Хранить в 100 мг / мл аликвоты при -20 ° C. |
| Инсулин иглы (29 ½ залог) | Becton Диксон | 309306 | |
| Гипоксия палаты | Биллапс-Ротенберг | ||
| Кислородный анализатор | Биллапс-Ротенберг | ||
| Пинцет # 5 | Изобразительных средств наук | Для удаления матки и децидуальной. | |
| Трипсин-EDTA (0,25%) | Гибко | 25200 |
Ссылки
- Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. , 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).
- Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568 (2010).
- Saint-Jeannet, J. -P.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
