Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

17.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4134

⸱

2 июня 2012 г.

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Pharmacology, Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University Medical Center, 3Vanderbilt University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Выделение эмбриональных нервного гребня из нервной трубки облегчает использование В пробирке Методы изучения миграции, самообновления и multipotency из нервного гребня.

Аннотация

Эмбриональный нервный гребень (NC) представляет собой популяцию мультипотентных клеток-предшественников, которая возникает в дорсальной части нейральной трубки, претерпевает эпителиально-мезенхимальный переход (EMT) и мигрирует по всему эмбриону, давая начало различным типам клеток 1-3. NC также обладает уникальной способностью влиять на дифференцировку и созревание органов-мишеней4-6. При эксплантации in vitro предшественники NC подвергаются самообновлению, мигрируют и дифференцируются в различные типы тканей, включая нейроны, глию, гладкомышечные клетки, хрящ и кость.

Мультипотентность NC была впервые описана на эксплантатах нервной трубки птиц7-9. Изоляция клеток NC in vitro облегчает изучение динамики NC, включая пролиферацию, миграцию и мультипотентность. Дальнейшие исследования на моделях птиц и крыс показали, что эксплантированные клетки NC сохраняют свой потенциал NC при трансплантации обратно в эмбрион10-13. Поскольку эти внутренние клеточные свойства сохраняются в эксплантированных предшественниках NC, анализ эксплантатов нервной трубки представляет собой привлекательный вариант для изучения NC in vitro.

Для более глубокого понимания особенностей нейрального гребня (НГ) млекопитающих было разработано множество методов выделения популяций клеток НГ. Прогениторы, производные от НГ, могут быть культивированы из постмиграционных зон как эмбриона, так и взрослого организма для изучения динамики постмиграционных прогениторов НГ11,14-20, однако выделение прогениторов НГ непосредственно в момент их эмиграции из нейральной трубки обеспечивает оптимальное сохранение потенциала клеток НГ и их миграционных свойств13,21,22. В некоторых протоколах для выделения популяции НГ, обогащенной определенными типами прогениторов, используется метод сортинга клеток с флуоресцентной активацией (FACS)11,13,14,17. Тем не менее, при работе с эмбрионами на ранних стадиях развития с помощью FACS трудно получить количество клеток, достаточное для анализа, что затрудняет выделение ранних популяций НГ из отдельных эмбрионов. В данной работе мы описываем подход, который не зависит от FACS и позволяет получить популяцию НГ с чистотой примерно 96%, что подтверждено с помощью активированного Wnt1-Cre репортера клеточных линий23.

Представленный здесь метод адаптирован на основе протоколов, оптимизированных для культивирования NC крыс11,13. Преимуществами данного протокола по сравнению с предыдущими методами являются следующие: 1) клетки выращиваются без использования фидерного слоя, 2) для получения относительно чистой популяции NC не требуется применение FACS, 3) изолируются NC на премиграционном этапе и 4) результаты легко поддаются количественной оценке. Кроме того, этот протокол может быть использован для изоляции NC из любой мутантной модели мыши, что облегчает изучение характеристик NC при различных генетических манипуляциях. Ограничением данного подхода является то, что NC извлекаются из контекста эмбриона, который, как известно, влияет на выживаемость, миграцию и дифференцировку NC2,24-28.

Протокол

1. Подготовка пластин

  1. Использование стерильных во все времена.
  2. Подготовить фибронектин (FN) путем разбавления 100 мкл плазмы человека запас FN в конечном объеме 3,3 мл в PBS Дульбекко (DPBS). Конечная концентрация 30 мкг / мл, и это можно хранить при температуре 4 ° С в течение 1 недели.
  3. Крышка нижней части каждой скважины стерильной культуры тканей четыре хорошо пластины с решением FN и оставьте на 15 минут. Убедитесь, что вся поверхность покрыта. Сделать средств массовой информации в течение этого времени (шаги 2 и 3).
  4. Удалить НФ решения и позволяют пластины для просушки. Аккуратно промойте скважин с 500 мкл DMEM, удалить DMEM, и добавить 500 мкл самообновления (SR) среды (см. ниже). Инкубировать при температуре 37 ° C в увлажненном инкубаторе, содержащем 5 процентов CO 2. Заполните эту примерно за час до вскрытия, так что пластины будет сухой перед использованием.

2. Подготовка SR среднего

  1. Для культуры и блуждающего ствола NCиз десяти эмбрионов (примерно один помет, в зависимости от генетического фона мыши линии), подготовить 25 мл средней SR. Комбинат 12,5 мл DMEM низкий уровень глюкозы, 7,5 мл Neurobasal Средний, 25 мкл ретиноевой кислотой (117 мкМ конечная концентрация) и 25 мкл 2-меркаптоэтанол (50 мМ конечной концентрации). Все хорошо перемешать.
  2. Добавить 3,75 мл куриного эмбриона экстракта, 250 мкл N 2 соль добавки, 500 мкл B27 дополнения и 250 мкл пенициллин-стрептомицина (1% конечной концентрации). Фильтр среду через 0,22 мкм фильтр.
  3. Добавить 10 мкл стерильной IGF1 (20 мкг / мл, конечная концентрация) и 20 мкл стерильной bFGF (20 мкг / мл конечной концентрации). Смешайте обращением. Хранить при температуре 4 ° C.

3. Подготовка Wash среднего

  1. Для примерно 10 эмбрионов подготовить 50 мл промывочного среды. Комбинат 50 мг BSA с 35 мл DMEM низкий уровень глюкозы, 15 мл Neurobasal средних и 500 мкл пенициллин-стрептомицина (1% конечной концентрации). Стерильные фильтры с 0,22мкм.

4. Подготовка коллагеназы / dispase

  1. Добавить 50 мкл 100 мг / мл коллагеназы / dispase до 5 DPBS мл. Все хорошо перемешать.
  2. Шприц с фильтром 0,2 мкм процедить и добавить 1,5 мл в каждом из трех скважин на двенадцать и пластины. Внесите примерно 1 мл мытья среды в оставшиеся лунки. Храните всю пластинку на льду, пока готовы переварить расчлененный ткани.
  3. Отрежьте кончики p20 и P1000 пипетки фильтра кончик стерильным лезвием. Вырезать чуть ниже скошенный край наконечника. Отсечения P1000 будет использоваться для передачи всего эмбриона в то время как p20 будет использоваться для передачи части изолированных тканей.

5. Изоляция блуждающего нерва и магистральные нервной трубки от 9,5 эмбрионов ЦОД

  1. Для приурочен беременности, плотин с вагинальным плагин считается 0,5 ЦОД в полдень утром плагина не наблюдается. Жертва и удаление матки 9,5 DPC.
  2. Удалить децидуальной из матки и аккуратно талить эмбрион от децидуальной оболочки. Как только опыт работы с этим протоколом, изолировать 3-4 9,5 DPC эмбрионов в то время, в стерильных DPBS. Использование стерильных и стерилизовать инструменты вскрытия. Инструменты можно стерилизовать автоклавированием, тепловой стерилизации или инкубации в этаноле.
  3. Для переднего блуждающего NC: с помощью инсулина, иглы, сократить нервной трубки в середине ушной плакоды. Вырезать снова у заднего края 4-й сегмент. Обрежьте ткань брюшной части нервной трубки для удаления глотки арки и сердца.
  4. Для магистральных NC: с помощью инсулина, иглы, удалите часть нервной трубки между сомитов 16-22 (или последний сегмент, если эмбрионы умственно раньше, чем 22 сомитов).
  5. Держите желточного мешка и оставшиеся эмбриональной ткани для генотипирования.

6. Удаление без нейронных эктодермы и мезодермы

  1. Поместите нервной трубки содержащие сегментов в коллагеназа / dispase при комнатной температуре в течение 10 минутс. Немедленно промыть в промывочной среды.
  2. Вернуться к стерильной ткани DPBS. Используя стерильные иглы инсулин, аккуратно удалить не-нейронных эктодермы из ткани и отделить сомитов от нервной трубки. Последние оставшиеся части мезодермы из сомитов тканей можно удалить, слегка растирая помощью урезанной p20 чаевые. Будьте осторожны, чтобы не повредить нервную трубку. Соблюдать это близко во время растирания.
  3. Поместите изолированной нервной трубки через второй и третьей 30-секундный мыть мыть среды.
  4. Мыть раз в средней SR, и поместить изолированной нервной трубки в центре FN-покрытием и которая была подготовлена ​​ранее (шаг 1.3). Увлажняйте гипоксии камеру с блюдом стерильной водой. Поместите блюдо в камере гипоксии и очистить камеру с газовой смеси до 3% O 2 (использовать резервуар, содержащий смесь 1% O 2, 6% CO 2, 93% N 2).
  5. Обращайтесь с камерой очень тщательно, чтобы обеспечить Thaт эксплантов это спокойно и по-прежнему в центре скважины.
  6. Инкубировать при температуре 37 ° C. Резюме шаги 5-6 показано на рисунке 1.

7. Удаление нервной трубки

  1. После 24 часов инкубации удалить нервной трубки, слегка дразнить края нервной трубки от мигрирующих клеток с помощью стерильной иглы инсулин. Удаляют нервной трубки из среды с использованием стерильного сокращение p20, как в пункте 6.2 и замените носитель свежей средой SR (рис. 2). Проще всего это сделать с помощью инвертированного микроскопа.

8. Представитель Результаты

После 24 часов инкубации при 37 ° C в условиях гипоксии, NC клетки мигрировали от нервной трубки в почти чистый населения (рис. 3а). Иногда, далеки от идеальных культур не даст надежные наросты. Например, вполне возможно, что после 24 часов тОн нервная трубка будет свернувшись калачиком на себя и НК не будет мигрировать от нервной трубки (рис. 3б). Иногда нервная трубка не будет привязан к фибронектина покрытие пластин.

По нашему опыту, неоптимальной NC миграции и проблем с приложением нервной трубки могут оказать негативное воздействие на условия или нормоксии концентрации фибронектина, соответственно. Ферментативной активности коллагеназы / dispase немного отличается от партии и время переваривания должна быть скорректирована соответствующим образом, однако, не переваривать ткань дольше, чем пятнадцать минут. Overdigestion нервной трубки, содержащей ткани коллагеназы / dispase также приведет к недостаточной наросты. Если сегмент тканей не так легко удалены из нервной трубки после инкубации в коллагеназа / dispase, нервной трубки можно инкубировать в течение более десяти минут. Иногда нервная трубка не будет прикрепляться к субстрату. Если это так, проверьте fibronecконцентрация олова и условиях гипоксии.

Хотя гипоксическим условиям могут быть использованы для культуры дикого типа NC, условиях гипоксии более тесно имитировать в естественных условиях окружающей среды 29,30. По нашему опыту, условиях гипоксии стала критической, когда культивирование мутант NC. Например, когда Foxd3 мутант NC культивировали в гипоксическим условиям, ствол NC была значительно уменьшена клетки результат по сравнению с контрольной группой. Эта разница в размере результат был удален, когда эксплантаты культивировали в условиях гипоксии (рис. 4). Кроме того, при дикого типа нейронных эксплантов трубки культивировали в нормоксии, количество каспазы-положительных клеток было больше чем у аналогичных эксплантатов культивировались в условиях гипоксии (данные не представлены). Поддерживая все культуры НК в условиях гипоксии, сравнения могут быть более легко между динамикой управления и мутантных культур.

figure-protocol-1
Рисунок 1. В целом схема выделения НК. А) Проанализируйте регионах, представляющих интерес с эмбрионом. B) Дайджест нервной трубки у коллагеназы / dispase в течение десяти минут (не превышает пятнадцати минут). C) Промойте в промывочной среды. D) Проанализируйте от не-нейронных эктодермы и мезодермы. EF) промыть дважды в промывочной среды. G) в себя плиты средней обновления. Инкубировать при температуре 37 ° С в 3% O 2 условиях гипоксии.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Поэтапное удаление нервной трубки из эксплантов. Нервной трубки должны быть удалены после 24-48 часов, чтобы предотвратить загрязнение с не-NC клеток. А) Обратите внимание, что границы между нервной трубки и результат NC (сплошная линия). Б) Разрежьте вдоль края нервной трубки с инсулиновой иглой. C) Откажитесь от нервной трубки и заменить среднего свежей средой обновления себя. Пунктирная линия показывает степень результат. Сокращенное наименование: NT, нервной трубки.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Примеры представитель результаты. А) Типичный результат эксплантов после 24 часов инкубации в себя средние обновления в условиях гипоксии (пунктирная линия показывает степень результат). Б) увеличенное изображение результатом NC после 48 часов в культуре. C) меньше идеального культуры с низкой доходностью результат. И C культивировали при тех же условиях. Изображения демонстрируют естественный ареал культуры надежности. Это может повлиять на эффективность нейронных изоляции труб, концентрации FN, условиях гипоксии, и время в коллагеназа / dispase пищеварения.

figure-protocol-4
Рисунок 4. В лабораторных анализов НК эксплантов культур в нормоксии против гипоксии. Контроль (дикий тип) NC клетки мигрировали из нейронных эксплантов трубку после 48 часов в гипоксическим условиям культуры. В отличие от Foxd3 мутантNC резко снизить клетки выросты в нормоксии (красный контур знака краям выростов NC). При сопоставимых эксплантов были выращены в условиях гипоксии, Foxd3 мутант NC эксплантов выросли сравнительно с контрольной группой, что позволяет последующего анализа. Обратите внимание, что такое поведение хорошо коррелирует с поведением Foxd3 мутант НК в естественных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Особое внимание следует обратить на стадии развития эмбриона, чтобы обеспечить успех этого подхода. Подсчет сомитов ранних эмбрионов мыши имеет решающее значение как для стадии эмбриона в соответствие мусора и правильно определить регионы нервной трубки для изоляции. Изменение одного или двух сомитов между эмбрионов в разумных пределах развивающего времени, в зависимости от разрешения эксперимент. Эмбриона в возрасте от 9 до 9,5 ЦОД будут иметь от 17 до 25 сомитов. Если эмбрион имеет более чем 25 сомитов, НК еще более п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Марка Возняка для видео-помощь. Мы также хотели бы признать, Шон Моррисон в Техасском Университете в оригинальный протокол для культивирования клеток крысы NC. Работа выполнена при поддержке Университета Вандербильта Медицинского центра академической поддержки программ и грантов от NIH (HD36720 и HD036720-11S109) и АНА 11GRNT7690040 в PAL, predoctoral стипендии от AHA (0615209B) и NIH (NS065604), чтобы Движение неприсоединения, а также ERP было поддерживается обучение NIH грант T32HD007502.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реагент Компания Номер по каталогу Комментарии
DMEM (низкий уровень глюкозы) Гибко / Invitrogen 11885
Neurobasal среднего Гибко 21103
BSA Сигма A3912-10G
DPBS Гибко 14190-144
IGF1 BD Biosciences 354037 Хранить в 50 мкг / мл аликвоты при -20 ° C.
bFGF BD Biosciences 354060 Хранить в 25 мкг / мл аликвоты при -20 ° C.
Фибронектин Гибко 33016-015 Хранится в 1mg/mL др.iquots при температуре -20 ° C.
Ретиноевой кислоты Сигма R2625 Хранить в 35 мкг / мл порции после воссоздания в этаноле при температуре -20 ° C.
2-меркаптоэтанол Сигма D-5637
N 2 дополнения Гибко 17502-048
B27 добавки Гибко 17504-044
Steriflip 0,22 мкм фильтры Millipore SCGP00525
Пенициллин, стрептомицин Invitrogen 15140122
0,20 мкм фильтры Гранулирование 431219
Шприцы (для фильтрации) BD Biosciences 301604
Четыре луночных Thermo Fisher Scientific 176740
Коллагеназы / Dispase Roche 269 ​​638 Активность меняется в зависимости от партии. Хранить в 100 мг / мл аликвоты при -20 ° C.
Инсулин иглы
(29 ½ залог) 		Becton Диксон 309306
Гипоксия палаты Биллапс-Ротенберг
Кислородный анализатор Биллапс-Ротенберг
Пинцет # 5 Изобразительных средств наук Для удаления матки и децидуальной.
Трипсин-EDTA (0,25%) Гибко 25200

Ссылки

  1. Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. , 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).
  2. Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568 (2010).
  3. Saint-Jeannet, J. -P. Neural crest induction and differentiation. , Springer Science+Business Media, Landes Bioscience/Eurekah.com. (2006).
  4. Plank, J. L. Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation. Developmental biology. 349, 321-330 (2011).
  5. Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas. Development. 135, 2151-2160 (2008).
  6. Freem, L. J. The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice. J. Anat. 217, 651-664 (2010).
  7. Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. A clonal approach to the problem of neural crest determination. Developmental biology. 46, 262-280 (1975).
  8. Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells. Developmental biology. 80, 96-106 (1980).
  9. Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest. Development. 112, 301-305 (1991).
  10. White, P. M. Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals. Neuron. 29, 57-71 (2001).
  11. Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
  12. Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos. J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).
  13. Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
  14. Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
  15. Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).
  16. Chung, I. H. Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development. Stem Cells. 27, 866-877 (2009).
  17. Biernaskie, J. SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells. Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).
  18. Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors. Development. , 126-3781 (1999).
  19. Heanue, T. A., Pachnis, V. Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2. Stem Cells. 29, 128-140 (2011).
  20. Morrison, S. J. Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells. J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).
  21. Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. In vitro clonal analysis of mouse neural crest development. Developmental biology. 157, 517-525 (1993).
  22. Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).
  23. Mundell, N. A., Labosky, P. A. Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates. Development. 138, 641-652 (2011).
  24. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development. 133, 99-106 (2006).
  25. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).
  26. Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia. Development. 133, 4839-4847 (2006).
  27. Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick. Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).
  28. Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).
  29. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).
  30. Ivanovic, Z. Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эксплантат нейральной трубкинейральная трубка эмбриона мышиизоляция клетоккультура клетокэпителиально-мезенхимальный переходколлагеназный перевариваниегипоксическая камерамиграция клетокмультипотентный предшественник
Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.