Быстрое подход к исследованию взаимодействия и воздействия на молекулярные механизмы, связанные с наличием антител в внутриклеточной среде описывается. Метод включает в себя трансфекцию антител в живой клетки с помощью нековалентных образование комплекса на основе липидного состава. Техника адаптирована к увековечили клеточных линий и первичных клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Антитела Трансфекция в нейроны, как инструмент для изучения патогенеза заболевания
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Антитела позволяют по-новому взглянуть на различные процессы, происходящие в живых системах. Возможность получения высокоспецифичных антител к целевым белкам позволила решать очень точные биологические задачи. Важно отметить, что антитела задействованы в патогенезе ряда заболеваний человека, включая системную красную волчанку (СКВ), ревматоидный артрит (РА), паранеопластические синдромы, рассеянный склероз (РС) и миелопатию/тропический спастический парапарез, ассоциированные с человеческим Т-лимфотропным вирусом 1-го типа (HAM/TSP) 1-9. Механизмы, посредством которых антитела вызывают заболевание, остаются предметом активных исследований; имеющиеся данные свидетельствуют о том, что взаимодействия между антителами и различными внутриклеточными молекулами приводят к воспалению, нарушению клеточной сигнализации и апоптозу 10. Было показано, что пациенты с РС и HAM/TSP вырабатывают аутоантитела к внутриклеточному РНК-связывающему белку — гетерогенному рибонуклеопротеину A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Современные данные указывают на патогенность антител как к внутринейрональным, так и к поверхностным антигенам 3, 5-9, 11. Таким образом, методика, позволяющая изучать внутриклеточные взаимодействия антитела с белком, позволила бы значительно лучше понять патогенез данных заболеваний.
Гены обычно трансфицируют в первичные клетки и клеточные линии в культуре, однако трансфекция антител в клетки была затруднена из-за изменения структуры антител или низкой эффективности трансфекции 12. Другие методы трансфекции включают трансфекцию антител на основе катионных липосом (состоящих из DOTAP/DOPE) и полиэтилениминов (PEI); оба этих метода привели к десятикратному снижению уровня трансфекции антител по сравнению с контролем 12. Метод, примененный в нашем исследовании, аналогичен методам с использованием катионных липидов и использует липидный механизм для формирования нековалентных комплексов с антителами посредством электростатических и гидрофобных взаимодействий 13. Мы использовали реагент Ab-DeliverIN, который представляет собой липидную формуляцию, способную захватывать антитела за счет нековалентных электростатических и гидрофобных взаимодействий и доставлять их внутрь клеток. Таким образом, химическое и генетическое связывание не требуется для доставки функциональных антител в живые клетки. Этот метод позволил нам провести различные эксперименты по отслеживанию антител и локализации белков, а также проанализировать молекулярные последствия внутриклеточных взаимодействий антитело:белок 9.
В данном протоколе мы продемонстрируем, как быстро и воспроизводимо трансфецировать антитела в нейроны с высокой эффективностью трансфекции. В качестве примера мы будем использовать антитела к hnRNP A1 и антитела IgG. Для удобного количественного определения эффективности трансфекции мы использовали антитела к hnRNP A1, меченные Atto-550-NHS, и IgG, меченные FITC. Atto550 NHS — это новый краситель с высоким молекулярным поглощением и квантовым выходом. Источник возбуждения и флуоресцентные фильтры для Atto550 аналогичны Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Кроме того, Atto550 обладает высокой фотостабильностью. Меченные FITC IgG использовались в качестве контроля, чтобы показать универсальность данного метода и его независимость от типа красителя. Этот подход и полученные данные помогут в понимании роли антител к внутриклеточным целевым антигенам в патогенезе заболеваний человека.
Протокол
1. Антитела маркировки (рис. 1)
- Сделайте 0,1 М NaHCO 3 буфера:
- 8,4 г NaHCO 3
- 29,2 г NaCl
- 1 л H 2 O
- Принесите буфера до рН 8,4 с этим решением (10,6 г Na 2 CO 3, 29,2 г NaCl, 1 л H 2 0).
- Добавить 35 мкл Atto550 NHS до 70 мкл анти-hnRNPA1 и 500 мкл буфера NaHCO 3 и вращать в течение 1 часа при комнатной температуре. После часового вращения, вводят смесь в диализатора и диализировать в 2 л PBS в течение ночи.
- На следующий день, сосредоточиться диализованной Atto550 NHS анти-hnRNPA1 использованием спин колонки (Amicon Ультра 0,5).
- После Atto550 NHS меченые анти-hnRNPA1 антитела были сосредоточены, нано-падение образца для определения концентрации.
2. Антитела Трансфекция (рис. 2)
- Семенной 10 5 клеток / лунку в 500 мкл DulbeccО, модифицированная Eagle Medium (DMEM/F12 +10% FBS +1% антибиотик) в 8 хорошо слайд 24 часов до трансфекции. Сотовые слияния должна быть не менее 70%.
- Двадцать четыре часа после посева, добавить 2 мкл Ab-DeliverIN реагента в пробирку Эппендорф.
- Затем добавьте 2 мкг Atto550 NHS меченые анти-hnRNPA1 антител (0,5 мкг / мкл) в той же трубке Эппендорф и инкубировать 10-15 мин при комнатной температуре.
- Во время инкубации, аспирации медиа и добавьте 394 мкл свежей среды DMEM к клеткам.
Примечание: Добавить 500 мкл DMEM в одной палате нетронутыми клетки выступать в качестве контроля.
- После инкубации, добавьте 100 мкл DMEM с антителом смесь, перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, и добавить к клеткам в DMEM при общем объеме 500 мкл.
- Изменение средствах массовой информации после 48 часов антител доставки.
Примечание: Протокол был повторен с FITC меченых Ригг в качестве положительного контроля.
3. Онлайн и фиксированной изображений для определения эффективности
- Изображение клетки живут на 48 часов использования Cy3 фильтр на флуоресцентный микроскоп для получения изображений трансфицированных Atto550 NHS меченых антител.
- После живого изображения была завершена, аспирации средств массовой информации и исправление клеток.
- После аспирационных средств массовой информации, лечить клетками с 0,4% параформальдегид в течение 15 мин при комнатной температуре. Вымойте клетки 4 х 5 мин с PBS. Затем смонтировать клетки с монтажной средах, содержащих DAPI реагентов и исправление покровное. Измерение эффективности трансфекции фиксированных клеток с AxioVision программного обеспечения. Если AxioVision программное обеспечение не на руку, просто считать события из вашего изображения вручную и подключить результатов в расчет в 3,7. Кроме того, ImageJ программное обеспечение может быть использовано для этих расчетов.
- Во-первых, использовать "События" измерения для подсчета общего количества клеток в вашем образе выбор на 20-кратным увеличением.
- Затем с помощью "События" измерения для подсчета клеток, которые не былиУспешно трансфицировали антител в том же 20-кратным увеличением изображения.
- Чтобы получить доступ к измеренным "События" в формате Excel стиля, нажмите на кнопку "Свойства", нажмите кнопку "Измерение" на вкладке и нажмите кнопку, чтобы просмотреть "Как видно из таблицы».
- Наконец, используйте следующие расчеты, чтобы определить вашу эффективность трансфекции путем сравнения двух ранее измеренных событий: ((Всего клетки - клетки нетрансфицированных) / Total Cells) х 100 = эффективность трансфекции.
4. Представитель Результаты
Живые образы нетрансфицированных (рис. 3А) по сравнению с трансфицированных (рис. 3В) нейронов показывают, что маркировка антитела (красным или зеленым в каждом рисунке) отчетливо наблюдается в клетках (рис. 3B, C, D). После аспирации и промывания со средствами массовой информации для удаления антител или между приверженцами поверхности клеток, меченых антител по-прежнему присутствуют в нейронах (рис. 3, D). Для расчета эффективности трансфекции, использовать программное обеспечение AxioVision для расчета общей клетках по сравнению с клетками, которые не были успешно трансфицировали. Эти значения были введены в формулу эффективности трансфекции приобрести эффективности трансфекции в процентах от общего числа клеток (рис. 4).
Рисунок 1. Блок-схема процедуры, используемые для метки антител с Atto 550 NHS эфир следуют шаги, необходимые для концентрации меченых антител. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Блок-схема процедуры, используемые для трансфекции меченых антител в живые клетки в культуре.arge.jpg "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра больших фигура.
Рисунок 3. Прямые изображения трансфецированных нейронов 48 часов после трансфекции.
Рисунок 4. Исправлена и промывать изображения с события учитываются в целях определения эффективности трансфекции.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
С целью проверки гипотезы о конкретных молекул и их выражения, гены и другие векторы, как правило, трансфицировали в клетки. Уникальной особенностью этой процедуры является возможность легко трансфекции антител в клетки-мишени. Мы провели этот метод в пяти отдельных экспериментов каждая в двух экземплярах. Результаты эффективности трансфекции были похожи между всеми экспериментами. Важно отметить, что метод позволяет въезд антител в клетки без изменения структуры антител или функции. Кроме того, с помощью флуоресцентной...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Управления научных исследований и разработок, медицинских исследований службы, Департамента по делам ветеранов. Это исследование было профинансировано VA премии отзыв заслуги (в MCL) и Университета Теннесси Научного центра здоровья Несколько Fund Research склероз.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | |
| Флуоресцентного микроскопа AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| AxioVision версии 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC-меченными анти-Ригга | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS эфир | Сигма | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS +1% антибиотиков | Gibco | 11320-033 | |
| Поли-D-лизин, 8-а Слайды культуры | BD | 354632 | |
| Многоцелевой Rotator | Научно IndustriES Inc | Модель 151 | |
| DAPI Монтаж СМИ | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Диализатор | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ультра-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Параформальдегид (4% раствор) | Электрон наук микроскопии | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
Ссылки
- Burkhardt, H. Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).
- Chester, K. A. Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft. J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).
- Lee, S. M. HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease. Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).
- Reeves, W. H. Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones. Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).
- Levin, M. C. Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease. Nat. Med. 8, 509-513 (2002).
- Lee, S. M. Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease. Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).
- Kalume, F. Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing. J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).
- Levin, M. C. Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry. J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).
- Lee, S. A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease. J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).
- Smeenk, R. J. Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease. Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).
- Lee, S. Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease. J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).
- Reisinger, H. Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection. Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).
- Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells. Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).
- Radic, M. Z. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases. J. Immunol. 176, 68-74 (2006).
- Vincent, A. Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen. Brain. 133, 3164-3165 (2010).
- Vincent, A. Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic. Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).
- Magrys, A. The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy. J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).
- Geis, C. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
