Трехмерные модели культуры клеток для измерения действию тканевой жидкости потока на опухолевой инвазии сотовых

Краткое содержание

Интерстициальный потока жидкости поднимается в твердых опухолях и могут модулировать опухолевой инвазии клеток. Здесь мы опишем технику применить интерстициальный потока жидкости в клетки встроены в матрицу, а затем измерить его воздействие на клетки вторжения. Этот метод может быть легко адаптирована для изучения других систем.

Аннотация

Роста и прогрессирования наиболее солидных опухолей зависит от начальных преобразований раковые клетки и их реакции на строму связанных сигнализации в опухолевых микроокружения ^1. Ранее исследования на опухоль микросреде была сосредоточена главным образом на стромальные опухоли взаимодействий ^1-2. Тем не менее, опухоль микросреде также включает в себя различные биофизические силы, последствия которого остаются плохо. Эти силы биомеханического последствия роста опухоли, что приводит к изменениям в экспрессии генов, клеточного деления, дифференцировки и инвазии ^3. Матрица плотности ^4, жесткость ^{5-6, 6-7} и структуры, интерстициального давления жидкости ^8, интерстициальный потока жидкости ^8, все изменили в прогрессии рака.

Интерстициальный потока жидкости, в частности, выше в опухоли по сравнению с нормальными тканями ^8-10. По оценкам интерстициальной жидкости этой скорости были измерены и признаны в диапазоне 0,1-3 мкм с ^-1, в зависимости от размера опухоли и дифференциации ^{9, 11.} Это связано с повышенным давлением интерстициальной жидкости вызвано опухолью индуцированной ангиогенеза и повышенной проницаемостью сосудов ^12. Интерстициальный потока жидкости было показано, что увеличение проникновение раковых клеток ^13-14, сосудистые фибробластов и гладкомышечных клеток ^15. Это вторжение может быть связано с аутологичной градиент хемотаксиса создали вокруг клетки в 3-D ¹⁶ или увеличение матрицы металлопротеиназы (ММП) выражение ¹⁵ секрецию хемокинов и молекул клеточной адгезии выражение ^17. Тем не менее, механизм, посредством которого клетки чувствуют жидкости не очень хорошо понял. В дополнение к изменению поведения опухоли клетки, интерстициальные поток жидкости изменяет активность других клеток в опухоли микроокружения. Это связано с (а) вождение дифференциации фибробластов в опухоли содействия myofibrобласти ^18, (б) транспортировки антигенов и других растворимых факторов, в лимфатические узлы ^19, и (с) модуляции лимфатические эндотелиальные клетки морфогенеза ^20.

Техники, представленные здесь накладывает интерстициальный потока жидкости на клетки в пробирке и количественно ее влияние на вторжение (рис. 1). Этот метод был опубликован в нескольких исследований для оценки воздействия жидкости на стромальные и вторжение раковых клеток ^{13-15, 17.} При изменении состава матрицы, тип клеток и концентрации клеток, этот метод может быть применен к другим болезням и физиологических систем для изучения последствий внедрения потока на клеточных процессов, таких как вторжение, дифференцировке, пролиферации и экспрессии генов.

Протокол

1. Анализ Настройка

1. Таяние небольшую аликвоту (<500 мкл) Матригель на льду при температуре 4 ° С (около 2 ч).
2. Подготовить гель рецепт (см. например, объемы в таблице ниже): 10x PBS (1x в общем объеме), 1N гидроксида натрия (эквивалентно 0,023 объемы добавил коллагена, или в соответствии с рекомендациями коллагена производителя, в случае необходимости), Матригель и коллагена I типа в концентрации 1 мг / мл и 1,3 мг / мл соответственно (другие формулировки матрицы могут быть использованы в зависимости от типа клеток и эксперимент).

Пример рецепт геля

Компоненты	Со концентрации	Конечная концентрация	Добавить объеме
10х PBS	10X	1X	0,090 мл
Стерильная вода			0,346 мл
1N NaOH			0,008 мл
Матригель	9,90 мг / мл	1 мг / мл	0,101 мл
Крыса хвостом типа я коллагена	3,66 мг / мл	1,3 мг / мл	0,355 мл

3. Смешайте компоненты геля на лед в той же последовательности, как указано выше и инкубировать окончательное решение в течение 1 часа при температуре 4 ° C. По нашему опыту, 1 ч инкубации до посева клетки приводит к более равномерному геля из коллагена. Убедитесь в том, чтобы держать Матригель и коллагена на льду во все времена и работать как можно быстрее, чтобы предотвратить гелеобразование.
4. Место 12 мм диаметром 8 мкм поры клеточной культуре вставляет в 12-луночного планшета использованием стерилизованные щипцы.
5. Граф клеток и ресуспендируют в бессывороточной СМИ на 5 х 10 ⁶ клеток / мл (общий объем не должен превышать 10% геля раствора).
6. Добавить 100 мкл клеточной суspension до 900 мкл геля решение (конечная концентрация ячейки 5 х 10 ⁵ клеток / мл) и тщательно перемешать с помощью пипетки мягко вверх и вниз.
7. Добавить 150 мкл конечной смеси для каждой вставки и передачи 37 ° C, 5% СО ₂ инкубатора в течение 30 минут, пока гель полимеризуется.
8. Использование сыворотки свободных средств массовой информации,

• Добавить 100 мкл в верхней части геля и 1200 мкл при вставке в статичном состоянии. Уровень жидкости внутри вставки и за ее пределами в скважину должны быть примерно равны, в результате чего минимальный перепад давления на геле и не интерстициальный потока.
• Добавить 100 мкл при вставке и 650 мкл выше гель для потока состоянии. Будьте осторожны, чтобы избежать воздушных пузырей под вставку, так как они мешают клеткам мигрировать через мембрану в этих местах. Перепад давления, порожденная этими объемами составляет около 1,3 см Н ₂ О (или 1 мм рт.ст.).

9. Место пластинки в 37° C, 5% СО ₂ инкубатора в течение 24 часов.

2. Сотовые Окрашивание и подсчет

1. Добавить 500 мкл 1X PBS в каждую лунку в новый 24-луночного планшета, это будет использоваться для мытья вставками.
2. Удалите среду, оставшихся в верхней части потока transwells и определить объем. Рассчитать общий объем элюированных, вычитая оставшийся объем от общего объема первоначально добавил, 650 мкл (это будет использоваться для расчета расхода, см. ниже). Используйте ватные тампоны для удаления геля с вставками и протрите верхнюю поверхность мембраны для удаления, не вторглись в клетках. Поместите вставку в 24-луночного планшета содержащих 1X PBS в течение 15 секунд, чтобы вымыть вставками.
3. Удалить PBS и добавьте 500 мкл 4% параформальдегид (PFA) под каждой вставки и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы исправить переселены клеткам.
4. Снимите и промойте PFA раз с 500 мкл 1X PBS для удаления остатков фиксатора.
5. Добавить 500 мкл оF 0.5% Тритон Х-100 решение под вставки и инкубировать 10 минут при комнатной температуре permeabilize клеток.
6. Вырезать из мембран вставки помощью лезвия и место в 100 мкл 2 мкг / мл DAPI в растворе 1х PBS, будьте осторожны, чтобы разместить в нижней части мембраны вниз (переселился клетки вниз).
7. Wrap пластины в алюминиевую фольгу и положите на шейкере со скоростью 150 оборотов в минуту в течение 30 минут при комнатной температуре.
8. Вымойте мембраны в 500 мкл 1X PBS на шейкере (повторяется 3 раза в течение 10 минут каждый), чтобы удалить свободный DAPI.
9. Место мембран на стеклах с переселился клетки вверх, добавьте решение для монтажа и покровным стеклом.

3. Анализ данных

1. Граф DAPI-окрашенных ядер на 5 случайно выбранных мест каждая мембрана (держаться подальше от края и 10X или 20X объектива).
2. Вычислить среднее количество клеток и получения процентов вторжение, используя следующую формулу:
   Процент вторжения = 100% х (в среднем клеток х мембраны площадь) / (площадь поверхности х микроскопе изображение числа клеток семенами)
   Процентов вторжения могут быть нормализованы некоторые контроля состояния (как правило, статическое состояние), чтобы для сравнения независимых экспериментов.
3. Рассчитать среднюю скорость потока: разделить общую элюированных объема потока условие, инкубационный период (например, 24 часов).
4. Рассчитаем среднюю скорость потока: разделите среднюю скорость потока по площади поперечного сечения геля / мембрана (в данном случае 60 мм ^2).

4. Представитель Результаты

Для измерения опухолевой инвазии клеток в интерстициальной поток, мы выполнили наш 3-D поток вторжения методом с использованием MDA-MB-435S клетки метастатической меланомы. Эти клетки, ранее было показано, что вторжение в ответ на интерстициальный потока жидкости ^13-14. Клетки были встроены в матрицу, состоящую из 1,3 мг / мл крысы тайл сухожилия коллагена типа I и 1 мг / мл Матригель базальной мембраны матрицы в конечной концентрации ячейки 5 х 10 ⁵ клеток / мл. Две разные условия по сравнению: (1) средний поток интерстициальной = 0,1 мкм, с ^-1 (2) = статическое состояние не измеримой скоростью потока (рис. 1).

После того, как 24 часа в сутки, клетки, которые вторглись через поры мембраны окрашивали DAPI для облегчения подсчета клеток. На рисунке 2 показан представитель образ вторглись клеток. В светлом, только поры мембраны видны. Использование флуоресценции, DAPI-окрашенных ядер были использованы для подсчета клеток и фаллоидином окрашенных F-актин структуры используются для визуализации тела клетки (опционально). Использование Стьюдента тест предполагая равные дисперсии, мы показали, что интерстициальный поток значительно увеличивает MDA-MB-435S клетки вторжение в 2,3 раза по сравнению статических условиях (р = 0,003) (рис. 3). Это corroboraТЭС аналогичные результаты (но с разными условиями матрицы и, следовательно, скорость потока) с использованием этой клеточной линии ^13-14.

Рисунок 1. Схема 3-D интерстициальный анализа потока жидкости вторжения. Первое решение подготовить гель с использованием соответствующих концентраций и объемов. Затем добавить клеток гель решение и передать вставки культуре клеток. Наконец, добавьте соответствующий объем средства массовой информации для каждого состояния и инкубировать. Интерстициальный потока жидкости обусловлена ​​жидкости напор.

Рисунок 2. Переселился MDA-MB-435S клетки на мембране. Вторглись в клетках были зафиксированы после нашего внедрения анализа потока жидкости вторжения и окрашенных DAPI и Alexa Fluor 488-сопряженных фаллоидином для облегчения подсчета вторглись клеток) Изображение мембраны при ярком поле, б) DAPI станцииINED ядер (в синем), C) Alexa Fluor 488 фаллоидином окрашенных F-актин (зеленого цвета). Шкала бар составляет 50 мкм.

Рисунок 3. Увеличение вторжения MDA-MB-435S клеток в потоке. Сотовые вторжения после 24 часов значительно усиливается поток интерстициальной (р = 0,003). Результаты приведены к среднему статического состояния и значения представляют среднее ± SEM из 6 вставок культуре клеток.

Обсуждение

Здесь мы описали методику количественной оценки эффекта внедрения потока на инвазии опухоли клетки, используя встроенный клетки в 3-D матрица в течение вставки культуре клеток. Этот и подобные методы были использованы для изучения влияния внедрения потока на различные типы клеток, ^{13-15, 17.} Наш подход частично имитирует матрицы микроокружения опухоли с помощью типа я коллагена и Матригель, которые содержат белки в базальной мембране эпителиальных тканей и окружающей строме ^21-22. Эта система относ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Коллаген (Rat Tail)	BD	354236	Держите стерильный
Millicell культуре клеток вставки	Millipore	PI8P01250	8 мкм диаметр пор, поликарбонат мембраны
Матригель	BD	354234	Держите стерильный
PBS	Sigma Aldrich	100М-8202	10x для подготовки гель решение, 1x для промывки
Гидроксид натрия, 1,0 н Решение	Sigma Aldrich	S2770	Держите стерильный
DMEM 1X	CellGro	10-013-CV	Держите стерильный
Эмбриональной телячьей сыворотки	Атланты биологические	511150	Держите стерильный
Пенициллин Стрептомицин	CellGro	30002CI	Держите стерильный
Тритон Х-100	Sigma Aldrich	X100-500 мл	0,5% в PBS
Параформальдегид	Fisher Scientific	04042-500	4% в PBS
Деионизированная вода			Держите стерильный
4 ',6-diaminido-2-фенилиндола (DAPI)	MP Biomedicals	0215757401	1 мг / мл маточного раствора
Монтаж решения	Thermo Scientific	TA-030-FM
Трипсин-EDTA	CellGro	25-052-ДИ	Держите стерильный