On-Chip эндотелиальных Воспалительные фенотипирование

Краткое содержание

Микрофлюидных камеры поток травлению с помощью фотолитографии и изготовлены из PDMS применяется для исследования функциональных исходов, связанных с ЕС дисфункцию и воспаление. В эксперименте представителя, возможность дифференциального напряжения сдвига для модуляции клеточной адгезии моноцитов к цитокина активированных ЕС монослоев показано.

Аннотация

Атерогенез потенцируется метаболических нарушений, которые способствуют повышенному состояние системного воспаления в результате эндотелиальной дисфункции. Однако в начале функциональные изменения эндотелия, которые показывают уровень человека риск напрямую не оценивали клинически, чтобы руководство терапевтической стратегии. Кроме того, регулирование воспаление местных гемодинамики способствует неслучайных пространственного распределения атеросклероза, но механизмы их трудно разграничить в естественных условиях. Мы описываем лаборатории-на-чипе подход к количественной анализа метаболических возмущение воспалительных явлений в человеческих эндотелиальных клеток (ЭК) и моноцитов под конкретные условия потока. Стандартные методы мягкой литографии используется для microfabricate сосудистой миметического микрофлюидных камеры (VMMC), которые связаны непосредственно с культурным монослоев ЕС. ¹ Эти устройства имеют преимущества использования малых объемов реагентов в то время каксоздание платформы для визуализации непосредственно воспалительных явлений в мембране ЕС подвергается четкой сдвига поля. Мы успешно применять эти устройства для исследования цитокинов, ² липидов ^{3, 4} и RAGE-индуцированного воспаления в ⁵ аорты человека ЕС (HAEC). Здесь мы документировать использование VMMC для анализа моноцитарно клетки (THP-1), проката и ареста HAEC монослоев, которые обусловлены по характеристикам дифференциального сдвига и активировать цитокина TNF-α. Исследования, подобные этим, обеспечение механистического понимания atherosusceptibility при метаболических факторов риска.

Протокол

1. Культуры клеток и Подготовка основания

1. Вырезать 3-дюймовый круговой подложки от 100 х 20 мм, культуры тканей блюдо (BD Сокол) с помощью токарного станка. Стерилизовать субстратов погружения в 70% этаноле. Место в чашку Петри и пальто с 4 мл типа я коллагена (100 мкг / мл) в течение 1 часа при комнатной температуре, затем промыть 4 мл 1 х PBS.
2. Приостановить человека аорты эндотелиальных клеток (HAEC, прохождение 4-6) в 6.5x10 ⁵ клеток / мл и семян путем применения 1 мл непосредственно на подложке. Место в 37 ° C, 5% СО ₂ инкубатора и позволяет клеткам присоединиться к подложке в течение 1 часа.
3. Добавить 9 мл среднего роста эндотелия-2 (ВОС-2) с добавлением антибиотиков 1x противогрибковым решение клеток. Изменение среды каждые 2 дня до клеток до 90% слияния.
4. Поддерживать ТНР-1 клеток в RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и 1 противогрибковый антибиотик решение. Прохождение клеток, когда они достигнут плотности 10 ⁶ клеток / мл.

2. Протокол сотового ножницы

Клетки обусловлено в пользовательском конусом и пластиной Сотовые ножницы устройства (CSD). Устройство деталей и технических спецификаций, описаны в таблице 1 и на Рисунке 4.

1. Подготовка по устойчивому развитию. Стерилизовать камеру корпус с этанолом и промыть стерильной PBS. Нагрейте жилья до 37 ° C и уровня для того, чтобы конуса перпендикулярна клеточный монослой. Соберите субстрата с клетками из нижней части корпуса и установка конуса на нужную высоту.
2. Используйте Лейбовиц-15 (L-15) среде с эндотелиальной BulletKit как стрижка средней для поддержания нормальной рН в отсутствие CO _2. Чтобы стимулировать воспаление, добавить фактор некроза опухоли-α (ФНО-α, 0,5 нг / мл), стрижка средней и вводить 6 мл в устройстве с помощью шприца, соединенного с входным отверстием, заботясь, чтобы не ввести воздухпузырьков в камере.
3. Сдвиг клеток с высокой величиной устойчивый напряжения сдвига (HSS, 15 дин / см ²⁾ или колебательного напряжения сдвига (OSS, 0 ± 5 дин / см ^2, 1 Гц) в течение 4 часов. Желаемый SS достигается путем вращения конуса над клетками, которые точно контролируется с микро-шаговый двигатель, как описано выше ⁶ стене СС на поверхности (τ _т) приближается.:
   
   где μ-вязкость среды, ω-угловая скорость конуса, и α есть угол конуса (0,5 °). Конус выравнивания с подложкой регулируется с точностью до 0.05 ° по точности выравнивания и зазора высоты установлен на уровне 20 ± 10 мкм использованием глубины, чтобы минимизировать кольцевых и радиальных изменения τ _ш. Прибор был проверен обеспечить характеристики ламинарного потока. Удалить слоктя от устройства и подготовить для анализа моноцитов адгезии.

3. Изготовление PDMS микрофлюидных палаты

1. Получить мастер формы для желаемого микрофлюидных номер канала и его высота в зависимости от приложения. Характеристики конкретной конструкции, используемые в настоящем протоколе подробно описаны в таблице 1. Метод создания этих уже хорошо описаны в литературе ^1. Короче говоря, сеть каналов разработан с использованием САПР (Autodesk Inventor) и напечатаны в 5000 точек на дюйм на прозрачность. Отрицательные фоторезиста (SU8) вращается на кремниевой пластины толщиной до 100 мкм. Прозрачность накладывается и воздействию ультрафиолетового излучения. Номера для полимеризации фоторезиста удаляют, чтобы создать положительный мастер реплики.
2. Для того, чтобы решение PDMS смесь силиконовой базе силикона отвердителя 10:01 по массе в вес лодки и перемешать с 5 мл серологические пипетки. Будьте осторожны, чтобы не царапать стенына вес лодки, чтобы избежать добавления пластиковые хлопья к решению.
3. Установите мастер пластин в 100x15 мм чашку Петри и залить раствор в PDMS блюдо.
4. Накройте блюдо и поместить его в вакуумный контейнер на 15 минут, чтобы удалить пузырьки. Через 15 минут взять чашку Петри, и удалите остатки пузырьков, мягко поток воздуха над поверхностью.
5. Поместите чашку Петри в духовке в течение 1 часа при температуре 70 ° C. Снимите посуду и вырезать микрофлюидных камеры с помощью острого ножа.

4. Собрание устройств на микроскоп

1. Включите источник света для инвертированного микроскопа и установить нагреватель до 37 ° C. Прикрепите трубку к 10 мл шприц и заполнить дистиллированной водой так, что нет пузырей. Поместите шприц в насос шприца и установленный расход, чтобы побудить стены SS 1 дин / см ^2. Напряжение трения на стенке (τ _ш), порожденная по средней линии канала приближается использованием стандартныхуравнения для плоского потока камеры:
   
   где μ-вязкость среды, Q-объемный расход, ч является каналом высоту и ш ширины канала. Примечание: так как каналы конечной ширины фактического τ _ш будет меняться с т в зависимости от канала пропорции, и измерения избегать 25% ближайших боковых стен. ^1,7
2. Поместите PDMS камеру в воду и используют 100 мкл микропипетки для удаления воздуха из отдельных каналов. Присоединить вакуумный адаптер для камеры убедитесь, что клапан выключен.
3. Поместите чашку Петри с HAEC монослоя на цель. Установите камеру PDMS на чашку Петри и осторожно поставил ее на HAEC монослоя, обеспечивая при этом, что никакие воздушные пузырьки образуют между устройством и монослоя. Поверните клапан, чтобы вакуум в камере и прочно закреплен.
Вырезать 19 игл калибровочных притупить, что есть только 5 мм металла слева. Наполните пластиковую емкость с буфером и введены в PDMS вход камеры. Повторите эти действия для соответствующего количества каналов, которые будут использоваться. Прикрепите трубку от шприцевые насосы для PDMS канал выхода.

5. Моноцитарный Анализ адгезии при сдвиге стресс

1. Приостановить THP-1 клетках 2х10 ^{6 кл} / мл в HBSS + Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} + 0.1% HSA. Активировать ТНР-1 клеток путем инкубации с стромальных полученные фактор-1 (SDF-1, 50 мкг / мл) в течение 15 мин при комнатной температуре.
2. Включите шприцевой насос для создания потока, а затем добавить 50 мкл клеточной суспензии в резервуар, не вводя пузырьков воздуха. Как только поток полностью разработана, начинается сбор данных.
3. Выполнить в течение 5 мин на соответствующих расхода, добавив буфера в резервуар если решение становится низкой. Продолжать текущий буфер в каналы, чтобы смыть любые свободные клетки в потоке.

6. Сбор и анализ данных

1. Получить цифровых последовательностей изображений со скоростью 3 кадра / с в течение 2 минут после полностью развитого течения вдоль продольной оси канала на 3 места в канале, заботясь, чтобы не записывать сразу после входа или перед выходом в порты или 25% ближайших стороны стены.
2. Подсчитайте число арестованных клеток на поле определения их фазы, яркая внешность в той же фокальной плоскости, как монослой.
3. Арест фирма клетки определяется движение <½ клетки диаметром в 10 сек. Средние данные за 3 случайных полей / канал и количественного использования ImageJ программного обеспечения.

7. Представитель Результаты

Несмотря на эндотелий сосудов равномерно подвергаются агонисты, которые способствуют системное воспаление, атеросклероз является координационным болезнь, которая развивается преимущественно в местах нарушения потока в артериях, вовлекая пространственной неоднородности функции эндотелия ^8. 9, 10 TNF-α индуцирует хорошо характеризуется отклик в ЕС, что включает в себя до регулирования молекул клеточной адгезии (CAM , например VCAM-1, ICAM-1, E-селектина) и хемокинов, которые вербуют моноцитов из кровотока, отличительной чертой раннего поражения атеросклеротическим ¹¹ гемодинамики является важным регулятором эндотелиальных воспалительный фенотип ¹² Высокие напряжения сдвига величины (HSS.. например, 15 дин / см ²⁾ или пульсирующего напряжения сдвига (PSS, например, 15 ± 5 дин / см ^2), связанный с сайтов сопротивления атеросклероза в артериях вниз регулировать TNF-α-индуцированных реакций. И наоборот, низкие величины напряжения сдвига (LSS, например, 2 дин / см ²⁾ или колебательного сдвига (OSS, например, 0 ± 5 дин / см ^2), характерный восприимчивых сайтов в естественных условиях, усугубляют cytokiпе-индуцированного воспаления. ^{13, 14} Наша микрожидкостных устройств PDMS обеспечить платформу для проведения исследований механистический для проверки гипотез, связанных с наложением метаболического стресса с гидродинамических факторов в регуляции функции эндотелия и патологии. Полезность и универсальность подхода широко иллюстрируется следующими результатами представителя.

Рисунок 1. Касательное напряжение дифференциально модулирует THP-1 межклеточной адгезии к ФНО-α воспаленной эндотелиальных монослоев. Эти данные были получены с помощью подробных протоколов, описанных выше и задокументированы на видео. HAEC монослоев были подвержены воздействию одновременно низкие дозы цитокина TNF-α (0,5 нг / мл, ~ EC ₅₀ VCAM-1 до-регулирование) и либо HSS (15 дин / см ²⁾ или OSS (0 ± 5 дин / см ^2, 1 Гц) в пользовательской КУР в течение 4 часов, как ОПИСАНИЕкровать в подробный протокол. THP-1 клеточного была количественно при сдвиге потоков в камере поток PDMS. Эта клеточная линия, которая имитирует фенотип человеческих моноцитов была выбрана для его воспроизводимости и простоте использования. HSS ослабление воспалительной реакции по сравнению с OSS, что приводит к снижению THP-1, клетки сердца. Данные были проанализированы с помощью Стьюдента проверки и представлены как среднее ± SEM 3 независимых экспериментов. Адаптировано с разрешения DeVerse и др. ^5.

Следующие данные показывают, универсальность нашего подхода с использованием примеров из опубликованных работ. Отклонения от указанных протоколе указано, где это применимо.

Рисунок 2. Модуляция цитокин-индуцированного VCAM-1 выражение и моноцитов в наборе сдвиг градиент стресса. А) HAEC монослоев стимулировали TNF-α (0,3 нг / мл) в течение 4 часов при флош в VMMC разработан на основе Хил-Шоу течения теории ^15. линейное уменьшение величины SS вдоль осевой линии канала была достигнута путем разработки боковых стенках камеры совпадают с линиями тока в двумерном торможения потока и формирование в конце канала в соответствии с ISO-потенциал линии. Напряжение трения на стенке (τ _ш), порожденная по осевой линии данного канала на осевом расстоянии от входа (х) определяется по формуле:

где μ-вязкость среды, Q-объемный расход, ч является каналом высоту, до ₁ ширина входного канала и L является общей длины канала. Вопрос был выбран для создания градиента по величине из 16 SS дин / см ² на входе 0 в критической точке "а" просто проксимальнее outleт. B)-C) VCAM-1 выражение было измерено на месте с помощью иммунофлуоресценции микроскопии с использованием антител, конъюгированных с квантовыми точками и представлены в процентах средней интенсивности флуоресценции (МФО) в нестимулированных статического контроля. СС не модулировать базального уровня VCAM-1, что является низким в нестимулированных HAEC (серый треугольник). Тем не менее, VCAM-1 выражение увеличился по отношению к ФНО-α в величинах LSS, достигая максимума в ~ 2 дин / см ² и возвращение к ФНО-α базового или ниже величины сдвига при> 5 дин / см ² (черные квадраты). D) Моноциты (10 ⁶ / мл) перфузии в 2 дин / см ² в течение 5 мин в параллельных каналов обтекании монослоев обусловлена, как и в). Моноцитарный набор на эндотелий количественно связана с VCAM-1 выражение в данной величины напряжения сдвига. Примечательно, что возможность проверки VCAM-1 выражение и моноцитов набор с мелкими пространственное разрешение в monolayeГ показало существенные изменения в узком диапазоне по величине СС, которые не будут оценены, применяя лишь несколько дискретных значений сдвига в отдельных экспериментах. Данные были проанализированы с помощью повторных измерений ANOVA и различия оценку Ньюмена-Keuls итогового * P <0,05 с ФНО-α в статических условиях. Данные среднее ± SEM из 3-6 независимых экспериментов. Адаптировано с разрешения Цзоу и др. ^2.

Рисунок 3. Триглицеридов богатых липопротеинов (TGRL) модулировать цитокин-индуцированного воспаления в пропорции к донорам сыворотке крови триглицеридов и VCAM-1 выражение. HAEC монослоев стимулировали TNF-α (0,3 нг / мл) в течение 4 часов одновременно с TGRL (10 мг / дл ApoB), выделенных из человеческих субъектов после еды с высоким содержанием жира в статическом культуры.) VCAM-1 выражение измеряли отдельно в ЕС приостановлен с помощью проточной цитометриии моноцитов адгезии количественно, используя VMMC, как описано в подробный протокол. Данные представлены в виде% по сравнению с ФНО-α. Моноцитарный арест изменяться в прямой зависимости от эндотелия VCAM-1 выражение, которое увеличилось непосредственно с уровнем триглицеридов сыворотки доноров. B) Моноцитарный арест на множество провоспалительных доноров была отменена в присутствии VCAM-1 блокирования антител. Значение определяется парными Стьюдента-тест, значит, ± SEM от 3-5 независимых экспериментов. Адаптировано с разрешения Wang и др. ^4.

Обсуждение

Мы описываем использование микрожидкостных устройств для PDMS на чипе оценки эндотелиальной воспалительной фенотип через реальном времени изображений CAM выражения и моноцитов адгезии. Главное преимущество нашего подхода заключается в способности к количественному результаты, связанные с эндотелиальной дисфункции в клетках, подвергнутых воспалительных медиаторов, таких как пищевые липиды и цитокинов при определенных условиях, которые отражают гидродинамические напряжения сдвига в атерогенных суда. VMMC облегчить использ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пункт	Компания	Номер по каталогу
100 х 20 мм чашки Петри	BD Сокол	353003
Этанол 95%	EMD химическими веществами	EX0290-1
DPBS	CellGro	21-031-CV
Тип I крысы хвост производные коллагена	Гибко	A10483-01
Человека аорты эндотелиальных клеток	Genlantis	PH30405A
Антибиотик-противогрибковым решения	Invitrogen	15240-062
Эндотелиальная BulletKit	Lonza	CC-4176
Эндотелиальной базальной медиа-2	Lonza	CC-3156
10 мл шприцев	BD Сокол	309604
Полиуретановые трубки	Tygon	ABW0001
Лейбовиц-15 СМИ	Гибко	11415-069
Sylgard 184 Силиконовый эластомер базы	Dow Corning	184
Sylgard 184 Силиконовый эластомер отвердителем	Dow Corning	184
SU8 фоторезиста Мастер вафли	UC Davis Пан лаборатории	N / A
Затмение TE200 инвертированный микроскоп	Nikon	Затмение TE200
Шприцевой насос	Гарвардский аппарата	PHD2000
19 калибровочных шприц	Кендалл	8881
THP-1 моноцитов клеточной линии	ATCC	TIB-202
HBSS (Хэнкс буферный солевой раствор) с Са 2 + / Mg 2 +	Gibco	14025-092
Фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α)	R & D Systems	210-TA-010
Стромальные полученных фактор - 1 (SDF-1)	R & D Systems	350-NS-010
RPMI 1640	CellGro	10-040-CV
Сывороточного альбумина человека (HSA)	ZLB Беринг	НДЦ 0053-7680-32