Всеобъемлющее Профилирование Допамин регулирование в черной субстанции и вентральной области покрышки

Summary

Допамин четко регулируется в ядрах мозга, в которых содержатся клетки тела и дендриты нейронов допамина. Здесь мы опишем вскрытия и образец обработки подход для достижения максимальных результатов, и, следовательно, выводы и понимание, на допамин регулирования в мозге зародышей черной субстанции (SN) и вентральной области покрышки (VTA) у грызунов.

Abstract

Допамин является активно изучал нейромедиатор в ЦНС. В самом деле, его участие в двигательной активности и вознаграждение поведения, связанного способствовала пять десятилетий исследования в области молекулярной недостатки, связанные с регулированием допамина. Большинство из этих запросов допамина регулирования в мозгу внимание на молекулярные основы ее регулирования в терминале поле регионах нигростриатной и mesoaccumbens пути, стриатуме и прилежащем ядре. Кроме того, такие исследования были сконцентрированы на анализе содержания допамина ткани с нормализацией только сырого веса ткани. Исследование белков, которые регулируют допамина, такие, как тирозин гидроксилазы (TH) белка, TH фосфорилирования, переносчика дофамина (DAT), и везикулярного транспортера моноаминов 2 (VMAT2) белок часто не включают в себя анализ содержания дофамина в тканях и того же образца. Умение анализировать и содержание дофамина ткани и ее регулирующих белков (в том числе пост-траnslational модификации) не только дает присущее власти интерпретации отношений допамина с уровнем белка и функции TH, DAT, или VMAT2, но распространяется также образцы экономики. Это приводит к меньшей стоимости, и тем не менее дает полное представление о молекулярной регуляции допамина практически в любой парадигме выбор следователей.

Мы ориентируемся анализа в мозге. Несмотря на то, СН и ВТА, как правило, игнорируется в большинстве исследований дофамина регулирования, эти ядра легко расчлененный с практикой. Всеобъемлющего считывания содержания допамина ткани и TH, DAT, или VMAT2 может быть проведена. Там в растущей литературы о влиянии функции дофамина в СН и ВТА на поведение, и impingements экзогенных веществ или болезненных процессов в нем ^1-5. Кроме того, такие соединения, как факторы роста оказывают глубокое влияние на допамин и дофамин-регулирование белков, в сравнительно большей степени в SN или VTA Проиллюстрируем вскрытия техника для разделения этих двух ядер и обработки образцов из расчлененных ткани, которая производит профиль выявления молекулярных механизмов регуляции допамина в естественных условиях, характерных для каждого ядра (рис. 1).

Protocol

1. Рассечение

1. На ложе из мокрого льда, охладить матрицу грызунов мозга (корональные разделы выделены 1 мм друг от друга), чашки Петри, содержащие 5 бритвы, и № 11 скальпеля. В отдельной емкости, места помечены 2 мл труб размером микроцентрифужную в сухой лед.
2. Следователь будет выбрать способ эвтаназии. У нас есть воспроизводимыми результатами проведения анестезии очень короткий с ИФ, в идеале, испаритель должны быть использованы. Однако, если нет, мы используем большой сосуд батарея с платформы. С батареи банка расположены в утвержденный вентиляционных капот, разместить ИФ-насыщенных марлевым тампоном под платформу и ждать 3-5 минут, чтобы насыти....

Discussion

Как указано на рисунке 1, описанные выше методы должны дать показания нескольких дофамина и его регулирующие белки TH, DAT, и VMAT2 от одного образца СН или VTA получены либо из крысы или мыши. Опять же, выгоды от проведения этого протокола в том, что следователь может получить оперативно подобранные показания о том, как допамин регулируется в естественных условиях практически в любой экспериментальной парадигмы и, тем самым, значительно сэкономить экспериментальных ресурсов за счет сокращения числа животных, н.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
Додецилсульфата натрия (SDS)	- JT Baker	4095-02
Trizma базы	Сигма	T1503, 1 кг
Trizma HCl	Сигма	T3253, 1 кг
Глицерин	Сигма	G8773-500 мл
PVP-40	Сигма	PVP40-1 кг
DPBS	Гибко	21600-069
Tween20	Сигма	P1379-500 мл
Глицин	Сигма	G8898-1 кг
Понсо S	Fluka	81460
Bromophenol синий	Сигма	B8026-5-го поколения
Дитиотреитола	Сигма	D-9163
Белки Стандартный 2 мг BSA	Сигма	P5619-25VL
Пирс BCA белка Анализ реагентов	Thermo Fisher Scientific-	23223
Precision Plus белка Стандартный	Био Рад	161-0373
[125I]-белка, удельная активность	Перкин-Элмер

Реагенты	Формулы
10% SDS	10 г SDS, 100 мл DI H 2 0
1% SDS (рН до 8,2)	10 мл10% SDS 60,5 мг Trizma базы 37,22 мг ЭДТА 90 мл DI H 2 0
Медные II раствор сульфата	1 г медного II сульфат 25 мл DI H 2 0
3X буфера образца	Trizma база 2,27 г SDS 6 г Дитиотреитола 0,463 г Глицерина 30 г Bromophenol Blue 10 мг DIH 2 0 (сначала добавить выше реагентов 40 мл H 2 0 в мерный цилиндр, а затем добавить H 2 0, пока объем достигает 100 мл) HCl (добавить, необходимых для достижения рН 6.85) Замораживание раствора в 50 мл 2,0 трубы. (Составляет 100 мл): Объем 3X буфера образца необходима = ½ объема SDS используется в образце.
1X Пример буфера	Развести 3X буфера образца до 1X образец буфера с помощью DI H 2 0
10X Запуск Buffer (Делает 4 л)	Trizma базы 121,1 г Глицин 577 г SDS 40 г
10X Буфер передачи: (Делает 4 л)	Глицин 360 г Trizma базы 96 г
Пунцовый цвет	Понсо С. 0,5 г Уксусная кислота 5 мл Д.И. H 2 0 95 мл
0,2% HCl решения	5,2 мл соляной кислоты в 500 мл Д.И. H 2 0
PVP-T20 Блокировка Soln. (Делает 4 л)	PVP-40 40 г DPBS 38,2 г Tween20 2 г Thimerisol 0,4 г 1М Трис рН 7,6 (60,6 г трис HCl + 13,9 г трис базы в 500 мл DI H 2 0) - 50 мл
10X Буфер Blot (Делает 4 л)	Твин-20 20 г Трис базы 14 г Трис-HCl 61 г