Измерение листьев гидравлические проводимости и проводимости устьиц и их реакции на освещенность и обезвоживание Использование метода испарительного Flux (EFM)

Краткое содержание

Мы описываем относительно быстрой (30 мин) и реалистический метод для одновременного измерения листа гидравлические проводимости ( K Лист) И проводимости устьиц ( Г S) Для транспирирующей вырезали листья. Этот метод может быть модифицирован для измерения света и обезвоживания ответы K Лист И Г S.

Аннотация

Вода является ключевым ресурсом, и система транспорта воды в растении определяет пределы максимального роста и устойчивости к засухе. Когда растения открывают устьица для достижения высокой устьичной проводимости (g_s) с целью захвата CO₂ для фотосинтеза, вода теряется в процессе транспирации^1,2. Вода, испаряющаяся из межклетниковых пространств, восполняется из клеточных стенок, которые, в свою очередь, забирают воду из ксилемы жилок листа, а та, в свою очередь, из ксилемы стеблей и корней. По мере перемещения воды по системе она встречает гидравлическое сопротивление, что создает натяжение во всей системе и низкий водный потенциал листа (Ψ_leaf). Сам лист является критическим «узким местом» во всей системе растения, обеспечивая в среднем 30% гидравлического сопротивления растения³. Гидравлическая проводимость листа (K_leaf = 1/ гидравлическое сопротивление листа) представляет собой отношение скорости потока воды к градиенту водного потенциала через лист и обобщает работу сложной системы: вода перемещается через черешок и несколько порядков жилок, выходит в обкладку проводящего пучка и проходит через клетки мезофилла или вокруг них, прежде чем испариться в межклетниковое пространство и выделиться через устьица. K_leaf представляет большой интерес как важный физиологический признак для сравнения видов, позволяющий количественно оценить эффективность структуры и физиологии листа для транспорта воды; также это ключевая переменная для исследования ее связи с вариациями структуры (например, в архитектуре жилкования листа) и ее влияния на фотосинтетический газообмен. Кроме того, K_leaf сильно реагирует на внутренние и внешние условия среды листа³. K_leaf может резко возрастать при увеличении облученности, что, по-видимому, связано с изменениями в экспрессии и активации аквапоринов — белков, участвующих в транспорте воды через мембраны⁴, а при засухе K_leaf сильно снижается из-за кавитации и/или коллапса сосудов ксилемы, и/или потери проницаемости внексилемных тканей вследствие сжатия клеток мезофилла и обкладки проводящего пучка или деактивации аквапоринов^5-10. Поскольку K_leaf может ограничивать g_s и скорость фотосинтеза у разных видов как в условиях достаточного увлажнения, так и при засухе, и тем самым ограничивать продуктивность всего растения, этот параметр может определять распределение видов, особенно в условиях роста частоты и суровости засух^11-14.

Мы представляем простой метод одновременного определения K_leaf и g_s на отделенных листьях. Транспирирующий лист соединяют за черешок с трубкой, ведущей к источнику воды, который помещен на весы. Потеря воды с весов регистрируется для расчета скорости потока через лист. При достижении стационарного состояния транспирации (E, mmol • m^-2 • s^-1), g_s определяют путем деления на дефицит давления пара, а K_leaf — путем деления на движущую силу водного потенциала, определенную с помощью камеры давления (K_leaf= E /- Δψ_leaf, MPa)¹⁵.

Этот метод может быть использован для оценки реакций K_leaf на различную интенсивность облучения и уязвимости K_leaf к дегидратации^14,16,17.

Протокол

1. Измерение листьев гидравлические проводимости для Гидратированный листья (K _макс)

1. Сбор побеги желательно в вечернее или ночное время, что ксилемы напряженность низкий, разрезать воздух и поместить в темное пластиковые мешок с мокрыми бумажными полотенцами. В лаборатории, Recut по крайней мере, двумя узлами в конце каждой съемки под водой. Пусть стреляют увлажняет ночь в чистой воде, или другие решения, которые будут использоваться для измерения K _листа. Сверхчистой воды рекомендуется в качестве потока решений, если последствия различных решений должны быть исследованы как фактор.
2. Разрежьте лист от побега с новым лезвием бритвы под частично дегазированной потока раствора. Сверхчистой воды рекомендуется в качестве потока решений, если последствия различных решений должны быть исследованы как фактор. Мы рекомендуем дегазации решение в течение ночи в колбе с помощью вакуумного насоса, но и другие методы могут быть использованы.
3. Wrap предварительно растянутой парафильмом вокруг petioле, чтобы обеспечить хорошее уплотнение между черешком и трубопроводов. Этот шаг является особенно полезным для некруглой черешках, как упаковка дополнительные парафильмом поможет вокруг черешка, чтобы поместиться внутри трубки. Стоматологическая паста может быть применена к черешка до обертывания парафином, чтобы заполнить пазы в черешках.
4. Подключите листа на силиконовой трубки под сверхчистой воды для предотвращения попадания воздуха в систему. Как листа поднимается над источником воды, воды в трубопроводе находится под давлением ниже атмосферного, и таким образом уплотнение хорошо, если воздух не втягивается в трубку во время измерения. В качестве альтернативы герметизации черешках непосредственно в силиконовые трубки, компрессионный фитинг с резиновой прокладкой могут быть использованы (например, (Omnifit A2227 отверстие адаптера; Omnifit, Кембридж, Великобритания); такой подход полезен для черешки с особенно сложной формы, или травинки , который можно обернуть вокруг стеклянного стержня и скреплено компрессионный фитинг. Когда это возможно, герметизации черешок непосредственно в сиlicone трубка имеет то преимущество, что быстрое и оставляя черешок НКТ узел, который является прозрачным, что позволяет пузыри, чтобы быть более легко видеть. Трубка соединяет лист на жесткий трубопровод работает в мерный цилиндр на балансе (± 10 мкг разрешение), которое записывает данные каждые 30 секунд на компьютере (например, с помощью «Баланс Link" программное обеспечение; Mettler-Toledo GmbH, Greifensee, Швейцария) Для расчета расхода через листья.
5. Листья должны быть проведены адаксиальной поверхностью вверх в лес кадры с нанизанными на леску над большой поклонник коробки и под источником света (> 1000 мкмоль • м ² • с ^-1 фотосинтетически активной радиации высокой освещенности измерения), что несколько выше уровня мениска в мерный цилиндр. Лист должен быть помещен над водой в мерный цилиндр, чтобы убедиться, что движение воды в лист обусловлен транспирации, и не входящие в лист под давлением силы тяжести, равно как ив случае, если лист были помещены ниже мениска воды в цилиндре. Малый контейнеров с мокрым бумажным полотенцем должны быть размещены внутри баланс камеры для обеспечения воздухом в балансе насыщен водой, что позволяет избежать испарения с источником воды в атмосферу в балансе. Эта возможность может быть проверена путем прекращения потока в слой с использованием четырех-ходовой кран клапан в трубы, и убедившись, что масса воды цилиндр на баланс не уменьшается.
6. Поместите прозрачный контейнер Pyrex заполнен водой выше листьев для поглощения тепла от лампы.
7. Поддержание лист температуре от 23 ° C и 28 ° C в течение всего эксперимента, добавляя больше холодной воды в контейнер Pyrex, что тепла лампы не нагреваются контейнер Pyrex достаточно, чтобы нагреть воздух вокруг листьев ниже.
8. Разрешить листа к выяснится на аппарат в течение по крайней мере 30 минут, что дает достаточно времени, чтобы акклиматизироваться к высокой освещенности, а также дополнительonally, пока расход стабилизируется, не вверх или вниз тенденция, и с коэффициентом вариации <5%, по крайней мере, 5-10 измерений, проведенных на 30-секундными интервалами поток. Важно, чтобы скорость потока для достижения устойчивого состояния, потому что этот метод предполагает стабильное _лист Ψ. Предыдущие исследования показали, эти критерии должны быть достаточными для стабилизации расхода (E), Ψ _листа и _листа K; тесты с более длинными периодами измерения после стабильный поток был создан показали никакого отношения _листа K для измерения времени для каждого из семи видов широком Диапазон листьев емкостью ^17,18. Стабилизация обычно занимает 30 минут или меньше, но у некоторых видов может потребоваться более часа для некоторых видов.

Примечание: При расходе очень низкой (<8 мкг с ^-1), стабильность может быть определена с помощью скользящего среднего за последние пять каждые 30 сек.

9. Откажитесь измерений, если поток внезапно меняется, либо из-за внезапного закрытия устьичных, или видимая утечка из уплотнений или блокировка в системе частиц или пузырьков воздуха.
10. Когда поток стабилизируется, записывать лист температуры с помощью термопары.
11. Быстро удалить лист из трубки, мазок высушить и поместить черешок листа в герметичный мешок, который ранее был выдохнул, чтобы остановить испарение.
12. Пусть слой равновесие в своей сумке, по крайней мере 20 мин.
13. Средний последних 10 измерений расхода. Это будет ваш E измерения.
14. Когда лист находится в равновесии, измерить окончательный потенциал воду листьев (Ψ _финал) с напорной камеры.
15. Измерьте площадь листьев с планшетного сканера и программного обеспечения для обработки изображений, или с метра площади листа.
16. К _лист рассчитывается как E / _{ΔΨ-лист (лист,} где ΔΨ = Ψ _{окончательное} - 0 МПа) и далее нормированной площади листа. Единицы в ммоль м ^-2 с ^-1 МПа ^-1. Потому что листья расположены чуть выше уровня воды в мерный цилиндр, действие силы тяжести в снижении давления воды на входе в лист будет незначительным, особенно по отношению к Ψ _финал, который всегда> -0,1 МПа.
17. Для коррекции изменений в K _листа индуцированных температурную зависимость вязкости воды ^15,19,20, стандартизировать значения K _листа до 25 ° C с помощью следующего уравнения:

18. Проводимости устьиц _(г) может быть определена как E, деленная на лист-воздух паров перепад давления, что эквивалентно паре давлеRe дефицит (ДДП), определяется с помощью температуры и относительной влажности датчик рядом с листа. ДДП рассчитывается по следующей формуле ²¹

где RH является относительной влажности, вице-президент является давление насыщенных паров в воздухе (в кПа; зависимости от температуры, в соответствии с уравнением Arden Buck ^22), А. П. атмосферного давления (в кПа).

2. Измерение листьев гидравлические проводимости для обезвоженной Листья

1. Сбор побеги желательно в вечернее или ночное время, что ксилемы напряженность низкий, разрезать воздух и поместить в темное пластиковые мешки с мокрыми бумажными полотенцами. В лаборатории, Recut по крайней мере, двумя узлами в конце каждой съемки под водой. Пусть стреляют увлажняет ночь в чистой воде, или другие решения, которые будут использоваться для K _леAF измерений. Сверхчистой воды рекомендуется в качестве потока решений, если последствия различных решений должны быть исследованы как фактор.
2. Вырезать побеги на отрезки по меньшей мере тремя листьями под сверхчистой воды и обезвоживанию побеги с вентилятором для различных периодов времени в диапазоне значений Ψ _листа.
3. Как только побеги обезвоженной, разместить герметичные мешки (Вихрь-Pak; Nasco, Форт-Аткинсон, Висконсин, США), которые были ранее в выдыхаемом) вокруг каждого листа побега, а затем поместить весь стрелять в большой герметичный мешок с мокрой бумаге полотенце.
4. Пусть стреляют равновесия в течение по крайней мере 30 минут (для сильно обезвоженной побегов более длительное время уравновешивания может быть необходимым).
5. После уравновешивания, акцизы верхнего и нижнего листа и мерой начальной Ψ _лист (Ψ = _O) с помощью барокамеры.
6. Откажитесь от побега, если разница в _лист Ψ этих двух листьев более 0,1 МПа (для стронGly обезвоженных листьев, этот диапазон может быть расширен до 0,3 МПа).
7. Третий лист затем используется для определения K _{листьев} и д _ы с EFM, следующие шаги 1,2 -1,18 выше. Примечательно, что устойчивый E состоянии может быть получена даже листья, которые были сильно обезвоженной листья, как устьица остаются открытыми и генерировать значения _G S существенно выше, чем кутикулярной проводимости ^17.
8. Для построения кривых гидравлических уязвимости, вычислить K _листа помощью Ψ _финал, как в шаге 1,16, а затем сюжет K _листа значения против зависимости от того, низкая, Ψ Ψ _о или _{окончательный,} т. е. сильным обезвоживанием испытывают листа в ходе эксперимента (= Ψ _{самый низкий).} Кроме того, снижение г _с в ответ на обезвоживание листьев может быть определена путем построения г _с против Ψ _{низкая.} Предыдущая работа имеет ш собственные, что обезвоживание вызывает по меньшей мере частично необратимым снижением K _{листьев} и г _с ^14,16.
9. Мы рекомендуем получения по меньшей мере 6 K _листа значения в 0,5 МПа интервал Ψ _низкая (этот интервал может быть сокращен до 0,25 МПа, если вида вы работаете с действительно уязвимы к обезвоживанию).
10. Выполните Диксон выброса тест на значениях K _лист для каждой 0,5 МПа водный потенциал интервал Ψ _низкая для удаления выбросов от вашей уязвимости кривой ^23.
11. Потому что виды различаются в своих ответах К _{листьев} и г _а к обезвоживанию ^14,16, подходят различные функции для каждого вида и выбрать максимального правдоподобия (AIC низкая стоимость; см. ¹⁴ для подробностей). Мы рекомендуем установку по меньшей мере четыре функции, которые ранее использовались в литературе: линейный (ГУ "FO: содержание ширина =" 1,4 дюйма "FO: SRC =" / files/ftp_upload/4179/4179eq3highres.jpg "/>), сигмоидальных ( ), Логистика ( ) И экспоненты ( ).

3. Представитель Результаты

Падение листьев гидравлической проводимости с обезвоживанием сильно варьирует у разных видов (рис. 1). Засуха чувствительных видов испытывать сильное снижение на менее негативные потенциалы воды, чем более засухоустойчивых видов, при измерении в условиях высокой освещенности (PAR> 1000 мкмоль • м ^-2 • с ^-1). Водыпотенциал на 80% потерь гидравлической проводимостью (P ₈₀₎ для мезоатомов травы Helianthus Annuus было 3 МПа менее негативно, чем Heteromeles arbutifolia, родом из Калифорнии колючий кустарник. Heteromeles arbutifolia ответил линейно на снижение водного потенциала, в то время как Helianthus Annuus показали, не -линейное снижение.

Оба проводимости устьиц _(г) и листьев гидравлические проводимости (K _лист) могут также реагировать на резко излучения (рис. 2). Для Raphiolepis показателей, проводимости устьиц сильно сократилось с обезвоживанием для листьев измеряется в условиях высокой освещенности (PAR> 1000 мкмоль • м ^-2 • с ^-1) и при свете лаборатории (PAR <6 мкмоль • м ^-2 • с ^-1). При высокой освещенности, листья измеряли с EFM, которые были обезвоженной к воде потенциал, который характерен для хорошо освещенных LeaVES на интактных растений в середине дня показал аналогичный _G S, как и для листьев измеряется на интактных растений с порометров (звезда на рис. 2). Примечательно, что для листьев при максимальной гидратации, K _листа была в четыре раза выше, листья подвергаются воздействию высоких, чем низкая освещенность (11 против 2,8 ммоль м ^-2 с ^-1 МПа ^-1), и, следовательно, K _{листьев} показал более сильный свет ответ в хорошо гидратированных листьев, чем г _с. Кроме того, в условиях высокой освещенности, K _листа сократился более тесные связи с обезвоживанием. P ₈₀ был 0,93 МПа менее негативно, чем при высокой низкой освещенности.

Рисунок 1. Листьев гидравлического кривые уязвимости для засухи чувствительных (вверху) и устойчивых к засухе (внизу) видов (от ^14,24). Каждая точка представляет собой грехGLE измерения листа гидравлические проводимости (K _листа) на отдельном листе методом испарения потока (EFM). Вертикальные полосы представляют собой водный потенциал, при котором виды потеряли 80% от начальной листом гидравлические проводимости (P _80). Идеально подходит функций с помощью максимального правдоподобия построены для обоих видов.

Рисунок 2. Реакции проводимости устьиц _(г) и листьев гидравлической проводимости (K _листа) к снижению потенциального листьев вода для Raphiolepis показатели измеряются при высоком против низкой освещенности (из ^16). (PAR> 1000 и <6 ммоль • м ^-2 • с^-1). Каждая точка представляет собой одно измерение на отдельном листе методом испарения потока (EFM), с белой и черной точек, представляющих листьев измеряется в условиях высокой и низкой освещенности соответственно. Уравнения для устьичного кривых проводимости в высоком против низкой освещенности: и . Уравнения для уязвимости в кривых высокими и низкими освещенности: и . Серая звезда в верхней панели представляет собой среднее ± станцииndard ошибка _с г листьев и водный потенциал измеряется на листьях интактных растений в середине дня с порометров. Серые и черные вертикальные полосы в нижней панели представляют собой водный потенциал, при котором виды потеряли 80% от начальной листом гидравлические проводимости (P ₈₀₎ при высокой и низкой освещенности соответственно.

Обсуждение

Метод испарения потока, представленные здесь позволяет относительно быстрой (30 мин) определение лист гидравлические проводимости в лабораторных условиях с одновременным измерением проводимости устьиц.

EFM до сих пор метод, который наиболее близко повторяет естественные пути воды в листьях, учитывая, что вода испаряется в лист воздушном пространстве и диффундирует из устьиц ^15. Ряд других экспериментальных методов определения _листа K существует ^25, с тремя быть особенно часто. (1) В высоком методом давления потока (HPFM), вода выталкивается через листья под высоким давлением ^15,26. Тем не менее, уязвимость кривых не могут быть получены с помощью этого метода, поскольку применяется положительное давление может пополнения эмболии и увлажняет мезофилла ткани. (2) В методе регидратации кинетику (РКМ), K _листа рассчитывается с использованием аналогии между регидратации обезвоженные листья с ч.arging конденсатора последовательно с резисторами ^27,28. Этот метод является быстрым, но не воспроизводит всю систему природных transpirational пути в листьях и не так легко изменена, чтобы измерения листьями приспособиться к высокой освещенности. (3) В методе вакуумного насоса (ВПМ) листьев помещают в камеру, ее черешок подключен к источнику воды на баланс, в то время как пылесосы различной интенсивности применяются к воде листьев вождения потери от листьев ^15,26. Этот метод может занять много времени. Измерения с использованием всех трех методов было установлено, дают согласующиеся результаты ^15,28,29, и таким образом EFM часто используется с учетом его основываясь на transpirational движения воды, и ее относительная быстрота, и его модификация для измерения K _листа в различных условиях.

Все типичные методы, используемые для определения K _листа включают уровень неопределенности в количественном соответствииurately движущую силу соответствующего транспирации ^25. В EFM, _лист ΔΨ используется для расчета K _лист ниже, чем истинная движущая сила, так как она основана на основной _лист Ψ после того, как лист находится в равновесии для давления бомбы. На данный момент, основной _лист Ψ не обязательно представляет собой водный потенциал клетки в конце гидравлического пути, где вода испаряется, а объем средневзвешенной за относительно небольшое число клеток с низким потенциалом воды, где вода перемещение и испарения, а также для более многочисленных клеток высокий потенциал воды, которая может быть изолирована от испарения потока. Сколько _{листьев} Ψ отличается от истинной движущей силой таким образом, зависит от того, где вода испаряется в лист. Если вода испаряется по всему листу, основной _лист Ψ может быть близка к истинной движущей силой, и если вода испаряется только из относительно небольшого числа слоктей около устьица, основная _лист Ψ может существенно недооценивает истинной движущей силы, т. е. водный потенциал этих клеток на самом деле может быть гораздо ниже, и таким образом фактически _листа K будет ниже, чем определяется с EFM. Таким образом, степень, что K _листа определяется EFM представляет настоящий _лист K чувствительна к воде потока путей, которые до сих пор не совсем понятны. В то время как EFM предоставляет данные, которые совпадают с другими методами для измерения K _листа (см. выше), и отлично подходит для сравнительного использования, возможность видами изменение пути потока воды через мезофилла нуждается в дальнейшем исследовании. Действительно, даже для листьев данного вида, эти водные пути могут отличаться в разных условиях, например, при различных облучения и тепловых нагрузок ^4,30 или различные состояния воды (с учетом усадки ткани) ^31. Далее знанийна путях водного транспорта, таким образом, позволяют EFM быть использованы для решения последствий изменения путей на общую листьев гидравлического транспорта.

Измерения проводимости устьиц в EFM имеет преимущества позволяющий определение ответов на излучение и обезвоживание, а также предоставление соответствующих ответов г _с с _листа K. Кроме того, эффект предыдущей обезвоживание листа следует регидратации на д _ы могут быть оценены с помощью этого метода. Однако, этот метод имеет две потенциальные недостатки. Во-первых, это измерение _G S выполнен на вырезают лист, а не на заводе нетронутыми, и, во-вторых, определения проводимости устьиц основан на измерении климата на некотором расстоянии от листьев, а не рядом с листа, как в камере порометров , хотя вентиляции листа с вентилятором уравновешивает поверхности листа с окружающим воздухом. Для некоторых видов подакцизныхЛистья могут показывать различные устьичного ответов, чем листьев на заводе ^16,32 нетронутыми. Тем не менее, для некоторых видов _с г оценивается с использованием EFM был похож на значения, полученные на интактных растений с порометров для листьев в середине дня Ψ _лист ¹⁶ (рис. 2).

EFM могут быть применены для понимания физиологической, т. е. исследования динамики K _{листьев,} в своей основе структуры и анатомии, а также ответы на факторы окружающей среды. Кроме того, метод может быть использован для сравнения растений данного вида, выращенных в различных условиях, или разных возрастов, или сравнить растений разных видов, приспособленных к различным средам.

По построения кривых лист уязвимости, можно получить представление о механизмах виды допусков к засухе. Во время засухи, кавитации и клеточной распада было показано, что происходит в лист ксилемы некоторых видов, и сотовые усадки в мезофилла при дегидратации может также повлиять на движение воды (обзор в ^14). Дальнейшие исследования будут необходимы, чтобы определить относительную важность каждого из этих процессов в движении падение K _{листьев} и устьичного закрытия.

Irradiance также является сильным фактором, влияющим K _{листьев} и EFM хорошо подходит для измерений в условиях высокой освещенности. Объединенная реакция аквапорины к освещенности и засухи должны получить большой интерес. Высокая освещенность приводит к увеличению экспрессии и / или активации аквапорины, которые позволяют быстрее потока воды через живые клетки, увеличивая K _листа, в то время как обезвоживание приводит к снижению экспрессии и / или де-activatation аквапоринов, уменьшая K _листа. Комбинированное воздействие освещения и водоснабжения на _листе K требуют дальнейшего изучения ^4,10,16,33.

палатка "> Кроме того, у разных видов, K _листа и его уязвимость была связана с распределения видов по отношению к источнику света воды и других ресурсов ^3,13,24. Виды из засушливых районов, как правило, проявляют большую устойчивость к гидравлическим спад, стоящих перед более отрицательных потенциалов воды в почве, а также поддержание высокого _листа K при более отрицательных потенциалах воды, они могут поддерживать высокую г _с и продолжить съемку CO ₂ для фотосинтеза ^13,14. Таким образом, исследование листьев гидравлические свойства позволяют судить на уровне клетки, лист, и все растение и его реакции на окружающую среду, и, скорее всего, с получением многочисленных важных новых открытий на всех уровнях.