Методическая статья

Инструментарий, позволяющий конверсии углеводородов в водной среде

DOI:

10.3791/4182

⸱

2 октября 2012 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, Delft University of Technology, 2Delft Center for Systems and Control, Delft University of Technology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Устойчивое авто регулирующих бактериальные системы для восстановления нефтяных загрязнений была разработана с использованием стандартных взаимозаменяемых частей ДНК (BioBricks). Инженерии E. палочки Штамма был использован для ухудшают алканов с помощью β-окисления токсичных водной среде. Соответствующих ферментов из различных видов показало, алканов деятельности деградации. Кроме того, повышение толерантности к П-Гексан было достигнуто путем введения генов от алкан-толерантный бактерий.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа выдвигает набор инструментов, который позволяет превращения алканов кишечной палочки и представляет собой доказательство принципа его применимости. Оно состоит из нескольких стандартных взаимозаменяемых частей (BioBricks) 9 адресации преобразования алканов, регуляции экспрессии генов и выживания в токсичные богатой углеводородами окружающей среды.

Трехступенчатый путь к деградации алкана был реализован в E. палочки для того, чтобы преобразования средне-и долгосрочной цепи алканов в соответствующие спирты, alkanals и в конечном итоге алкановых кислот. Последние были усвоены через родной β-окисления пути. Для облегчения окисления средней цепи алканов (C5-C13) и циклоалканов (С5-С8), четыре гена (alkB2, rubA3, rubA4 и Rubb) из алкана системы гидроксилазы от Гордония зр. TF6 8,21 были преобразованы в E. палочки. Для преобразованиядлинной цепи алканов (С15-С36), ген ЛАДА Geobacillus thermodenitrificans был реализован. Для необходимые дальнейшие шаги процесса деградации, АДГ и ALDH (исходящие из G. thermodenitrificans) были введены 10,11. Деятельность измеряли отдыха анализов клеток. Для каждого окислительного шаг, активность фермента не наблюдалось.

Для оптимизации эффективности процесса, выражение было только индуцированных в условиях низкой глюкозы: субстрат-регулируемого промотора, pCaiF, был использован. pCaiF присутствует в E. палочки K12 и регулирует экспрессию генов, участвующих в деградации неглюкозными источников углерода.

В последней части инструментария - таргетинг выживания - был реализован с использованием растворителя генов толерантности, PhPFDα и β, как с Pyrococcus horikoshii OT3. Органические растворители могут вызывать клеточный стресс и снижение живучести отрицательно affectinг сворачивания белка. В качестве сопровождающих, PhPFDα и β улучшения сворачивания белка, например, процесс в рамках присутствии алканов. Экспрессии этих генов привела к улучшению толерантности углеводородного показали повышение темпов роста (до 50%) в присутствиях 10% н-гексана в культуральной среде не наблюдается.

Подводя итоги, результаты показывают, что инструментарий позволяет E. палочки для преобразования и терпеть углеводородов в водной среде. Как таковая, она представляет собой первый шаг на пути устойчивого решения для нефти реабилитации с использованием синтетического подхода биологии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Загрязнение нефтью является одной из самых серьезных причин загрязнения окружающей среды и сильно влияет на экосистемы, предприятия и сообщества 3. Например, необходимы решения для борьбы с непрерывным загрязнением нефтью, возникающим из хвостовых вод нефтеносных песков в провинции Альберта, Канада. В процессе извлечения нефти из нефтеносных песков битум, полутвердая окисленная форма нефти, удаляется с помощью методов термической рекуперации, которые потребляют около 3,1 баррелей воды на один баррель нефти1. Загрязненная нефтью техническая вода, в основном поступающая из местной реки, после извлечения битума хранится в хвостохранилищах. Необходим....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. BioBrick Ассамблеи

  1. BioBricks из реестра стандартной биологической части осуществляется ИГЕМ штаб-квартиры. Чтобы построить новую BioBrick из существующих BioBricks, переварить доноров BioBrick (до 1,0 мкг) с ферментами EcoRI и SpeI для размещения донора частью вниз по течению от акцепторной части. Дайджест с XbaI и PstI для размещения донора частью вверх по течению от акцепторной части. Добавьте третий соответствующего фермента рестрикции, что сокращение в основу донора. Выполните пищеварения в общем объеме 20-25 мл с соответствующим буфером, в соответствии с поставщика (конечная концентрация 1x). Используйте 5 единиц / мкг ДНК для ферментов рестрикции.....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Преобразование алканов

Активность трех стадий окисления от алкана до соответствующей жирной кислоты оценивалась с помощью анализов клеток покоя и измерений активности ферментов. Результаты представлены по следующим путям реакций (1) алкангидроксилазы, (2) алкогольдегидрогеназы и (3) альдегиддегидрогеназы.
На первом этапе были сконструированы различные плазмиды для средне- и длинноцепочечных алканов. Плазмида BBa_K398014 .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Принцип BioBrick используется для создания шасси для деградации алканов и доказательство принципа для отдельных компонентов набора инструментальных средств было получено. Несколько анализов предлагается измерять в естественных условиях и в пробирке деятельности алкана ферменты пути. Представленная работа успешно демонстрирует ряд методов, которые могут быть использованы для определения активности ферментов и выражения в организме хозяина E. палочка после осуществления соответствующей BioBricks.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В экспериментах, проведенных в этом видео-статьи были разработаны для международного генно-инженерных машин конкуренции 9. Авторы хотели бы поблагодарить членов ИГЕМ команды Лука Bergwerff, Питер ван TM Boheemen, Jelmer Cnossen, Hugo F. Куэто Рохас и Рамон ван дер Валк для помощь в исследованиях. Мы благодарим Хан-де-Winde, Стефан де-Кок и Эсенгул Йылдырым за полезные обсуждения и проведения этого исследования. Эта работа была поддержана TU Delft University Отдел биотехнологии, биоинформатика Delft лаборатории, TU Delft департамента Bionanoscience, Oil Sands лидерство Initiative (OSLI), Стад studentenuitzendbureau, Нидерланды Genomics инициативы, Kluyver ц....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
E. coli K12New England BiolabsC2523H
Октановоечисло Fluka74822
ГексадеканFluka52209
октанол-1Fluka95446
додеканол-1Sigma-Aldrich126799
HexaneSigma-Aldrich296090
NADHSigma-AldrichN4505
FMNSigma-AldrichF2253
MgSO4J.T. Baker Casno7487 889
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
T4 лигазаNew England BiolabsM0202L
Газовый хроматограф
Клеточный разрушительLA BiosystemsCD-019
СпектрофотометрAmersham pharmaciaspec 2000
Считыватель пластинTecan Group Ltd.Magellan v7.0
Инкубатор Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubBDelft University of Technology на кафедре биотехнологии или реестра стандартных биологических частейBBa_K398014Alkane Hydroxylaze System
Резистентность: Chloramphenicol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA Делфтский технологический университет на кафедре биотехнологии или Реестр стандартных биологических частейBBa_K398027ladA Protein Generator
Устойчивость: Chloramphenicol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH Делфтский технологический университет на кафедре биотехнологии или Реестр стандартных биологических частейBBa_K398018ADH generator
Сопротивление: Chloramphenicol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH Делфтский технологический университет на факультете биотехнологии или Реестр стандартных биологических частейBBa_K398030ALDHgenerator
Сопротивление: Chloramphenicol
BioBrickTM K398326: pCaiF Делфтский технологический университет на факультете биотехнологии или Реестр стандартных биологических деталейBBa_K398326pCaiF promoter
Резистентность: Chloramphenicol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401Делфтский технологический университет на кафедре биотехнологии или Реестр стандартных биологических частейBBa_K398331pCaiF измерительное устройство
Сопротивление: Chloramphenicol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα -BBa_J61107- Делфтский технологический университет на факультете биотехнологии или реестре стандартных биологических частейBBa_K398406Толерантность к растворителям кластер
Стойкость: Хлорамфеникол

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allen, E. W. Process water treatment in Canada's oil sands industry: I: Target pollutants and treatment objectives. J. Environ. Eng. Sci. 7, 123-138 (2008).
  2. Alon, U. An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological C....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Escherichia coliBioBricks

Похожие статьи