Методическая статья

Инструментарий, позволяющий конверсии углеводородов в водной среде

DOI:

10.3791/4182

⸱

2 октября 2012 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, Delft University of Technology, 2Delft Center for Systems and Control, Delft University of Technology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Устойчивое авто регулирующих бактериальные системы для восстановления нефтяных загрязнений была разработана с использованием стандартных взаимозаменяемых частей ДНК (BioBricks). Инженерии E. палочки Штамма был использован для ухудшают алканов с помощью β-окисления токсичных водной среде. Соответствующих ферментов из различных видов показало, алканов деятельности деградации. Кроме того, повышение толерантности к П-Гексан было достигнуто путем введения генов от алкан-толерантный бактерий.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа выдвигает набор инструментов, который позволяет превращения алканов кишечной палочки и представляет собой доказательство принципа его применимости. Оно состоит из нескольких стандартных взаимозаменяемых частей (BioBricks) 9 адресации преобразования алканов, регуляции экспрессии генов и выживания в токсичные богатой углеводородами окружающей среды.

Трехступенчатый путь к деградации алкана был реализован в E. палочки для того, чтобы преобразования средне-и долгосрочной цепи алканов в соответствующие спирты, alkanals и в конечном итоге алкановых кислот. Последние были усвоены через родной β-окисления пути. Для облегчения окисления средней цепи алканов (C5-C13) и циклоалканов (С5-С8), четыре гена (alkB2, rubA3, rubA4 и Rubb) из алкана системы гидроксилазы от Гордония зр. TF6 8,21 были преобразованы в E. палочки. Для преобразованиядлинной цепи алканов (С15-С36), ген ЛАДА Geobacillus thermodenitrificans был реализован. Для необходимые дальнейшие шаги процесса деградации, АДГ и ALDH (исходящие из G. thermodenitrificans) были введены 10,11. Деятельность измеряли отдыха анализов клеток. Для каждого окислительного шаг, активность фермента не наблюдалось.

Для оптимизации эффективности процесса, выражение было только индуцированных в условиях низкой глюкозы: субстрат-регулируемого промотора, pCaiF, был использован. pCaiF присутствует в E. палочки K12 и регулирует экспрессию генов, участвующих в деградации неглюкозными источников углерода.

В последней части инструментария - таргетинг выживания - был реализован с использованием растворителя генов толерантности, PhPFDα и β, как с Pyrococcus horikoshii OT3. Органические растворители могут вызывать клеточный стресс и снижение живучести отрицательно affectinг сворачивания белка. В качестве сопровождающих, PhPFDα и β улучшения сворачивания белка, например, процесс в рамках присутствии алканов. Экспрессии этих генов привела к улучшению толерантности углеводородного показали повышение темпов роста (до 50%) в присутствиях 10% н-гексана в культуральной среде не наблюдается.

Подводя итоги, результаты показывают, что инструментарий позволяет E. палочки для преобразования и терпеть углеводородов в водной среде. Как таковая, она представляет собой первый шаг на пути устойчивого решения для нефти реабилитации с использованием синтетического подхода биологии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Загрязнение нефтью является одной из самых серьезных причин загрязнения окружающей среды и сильно влияет на экосистемы, предприятия и сообщества 3. Например, необходимы решения для борьбы с непрерывным загрязнением нефтью, возникающим из хвостовых вод нефтеносных песков в провинции Альберта, Канада. В процессе извлечения нефти из нефтеносных песков битум, полутвердая окисленная форма нефти, удаляется с помощью методов термической рекуперации, которые потребляют около 3,1 баррелей воды на один баррель нефти1. Загрязненная нефтью техническая вода, в основном поступающая из местной реки, после извлечения битума хранится в хвостохранилищах. Необходима более эффективная рециркуляция технической воды для снижения потребности в поглощении пресной воды. Для облегчения извлечения битума и обеспечения того, чтобы участки, расположенные ниже по течению, соответствовали рекомендациям по качеству воды для защиты водных экосистем, очистка технологической воды быстро развивается3.

Для борьбы с загрязнением органическими соединениями в настоящее время поощряются технологии биоремедиации с использованием микроорганизмов 1. Алканы являются наиболее распространенным семейством углеводородов в сырой нефти, содержащим от 5 до 40 атомов углерода на молекулу 7, 21. Известно, что многие бактерии разлагают алканы различной длины путем последовательного окисления терминальной метильной группы, образуя сначала спирты, затем альдегиды и, наконец, жирные кислоты. В рамках этого проекта iGEM были экспрессированы и охарактеризованы несколько ферментов из различных организмов, которые стали доступны через стандарт BioBrick и Реестр стандартных биологических частей.

Хорошо изученная система алкангидроксилазы Gordonia sp. TF6 облегчает начальную стадию окисления алканов C5-C 13 вместе с циклоалканами C5-C 8, используя минимум четыре компонента: alkB2 (алкан 1-монооксигеназа), rubA3, rubA4 (два рубредоксина) и RubB (рубредоксина редуктаза) 8, 21. Сообщается, что окисление длинноцепочечных алканов (в диапазоне от C15 до C36) осуществляется ladA, флавопротеиновой алканмонооксигеназой из Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 7, 15, 18, 22. LadA образует каталитический комплекс с флавинмононуклеотидом (ФМН), который использует атомарный кислород для окисления. Это приводит к превращению алканов в соответствующий первичный алканол. Спирты далее окисляются спиртом и альдегиддегидрогеназами до жирных кислот, которые легко вступают в путь окисления β 7, 21. Цинк-независимая алкогольдегидрогеназа из термофильной бактерии Geobacillus thermoleovorans B23 окисляет среднецепочечные алканолы до их соответствующих алканалов, используя НАД+ в качестве кофактора 10. Альдегиддегидрогеназа из той же бактерии способна катализировать NAD+-зависимую конечную стадию среднецепочечного окисления 11.

Чтобы снизить затраты на индукцию и поддерживать оптимальную пролиферацию бактериальной системы, был охарактеризован промотор pCaiF из E.coli. Этот промотор может регулировать экспрессию компонентов пути деградации углеводородов и регулируется уровнями цАМФ-Crp, которые, в свою очередь, зависят от уровня глюкозы6. При высоких внеклеточных концентрациях глюкозы в окружающей среде уровень клеточного цАМФ (циклического аденозинмононуклеотидфосфата) был низким из-за ингибирования аденилатциклазы в качестве побочного эффекта опосредованного ПТС транспорта глюкозы. И наоборот, во время ограничения (низкие концентрации глюкозы) уровень цАМФ увеличивался, и Crp связывался с цАМФ, образуя комплекс cAMP-Crp, который связывал pCaiF и активировал транскрипцию нижестоящих компонентов 6, 14.

Дикий тип E. coli может переносить только умеренные концентрации углеводородов. Чтобы завершить разработку инструментария, необходимо было решить проблему толерантности к углеводородам. Известно, что несколько органических бактерий, устойчивых к растворителям, выживают в двухфазных системах на основе воды и растворителей 12. Молекулярные компоненты, которые, как известно, повышают толерантность, являются шаперонами, которые способствуют правильному сворачиванию белков. Показано, что префолдиновая система из Pyrococcus horikoshii OT3, состоящая из белков phPFDα и phPFDβ, повышает толерантность к углеводородам17.

Набор инструментов для преобразования алканов был создан в соответствии с принципом BioBrick, который задокументирован в Реестре стандартных биологических частей 9. Биобрики представляют собой плазмиды, содержащие определенную функциональную вставку, которая окружена 4 предопределенными сайтами рестрикции. Вставки BioBrick могут быть гибко расширены, что позволяет создавать биологические системы с новыми функциями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. BioBrick Ассамблеи

  1. BioBricks из реестра стандартной биологической части осуществляется ИГЕМ штаб-квартиры. Чтобы построить новую BioBrick из существующих BioBricks, переварить доноров BioBrick (до 1,0 мкг) с ферментами EcoRI и SpeI для размещения донора частью вниз по течению от акцепторной части. Дайджест с XbaI и PstI для размещения донора частью вверх по течению от акцепторной части. Добавьте третий соответствующего фермента рестрикции, что сокращение в основу донора. Выполните пищеварения в общем объеме 20-25 мл с соответствующим буфером, в соответствии с поставщика (конечная концентрация 1x). Используйте 5 единиц / мкг ДНК для ферментов рестрикции.
  2. Дайджест акцептора BioBrick либо EcoRI и XbaI или SpeI и PstI.
  3. Инкубируйте пищеварения (по крайней мере) один час при температуре 37 ° C. Деактивировать рестрикции тепла, инкубации при 80 ° С в течение 10 мин и центрифуги в ближайшее время.
  4. Лигируют переваривается BioBrickчастей (доноров и акцепторов) вместе. С XbaI и SpeI создания совместимых концы ДНК, смешанной сайт создан, которые не могут быть сокращены с любым ферментов рестрикции в результате новой "объединенной" BioBrick, что в окружении 4 стандартных сайты рестрикции. В лигирования смеси конечной концентрации ДНК предпочтительно ~ 100 нг / мкл. Выполните реакции лигирования в общем объеме 10-15 мл с T4 буфера лигирования (конечная концентрация 1x) и лигазы Т4 (1 ед / мкг ДНК).
  5. Инкубируйте перевязки смеси при 16 ° C в течение не менее 3 часов.
  6. Выполнить преобразование реакцию с около половины лигирования смеси.
  7. Подтвердите BioBrick правильной последовательности с.
  8. Чтобы построить новую BioBrick от синтезированную ДНК, изменить гены для синтеза для оптимальной экспрессии в E. палочка с помощью JCat инструмент веб-сайте ( http://www.jcat.de/ ). Проведение дальнейших модификаций в соответствии с требованиями B ioBrick стандарта. Эта стандартизация подразумевает, что каждый BioBrick состоит из последовательности ДНК интерес префикс и с суффиксом. Префикс и суффикс-последовательности, которые содержат предопределенные сайты рестрикции, которые отсутствуют в остальных плазмиды последовательности. Эти стандартные сайты рестрикции позволяет поменять и продлить BioBrick вставляет гибко 9. Префиксов и суффиксов имеют следующую последовательность:
Имя Последовательность Комментировать
Префикс 5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3 "
5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3' Если следующие части кодирующей последовательности или любой его части, которая начинается с "ATG"
Суффикс 5 'TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'
ove_title "> 2. Alkane преобразования отдыха анализа Cell, In Vivo

Этот анализ проводился на основе метода, описанного Фуджи и соавт. (2004).

  1. Культура E. кишечной клетки, экспрессирующие Alkane системы гидроксилазы ( BBa_K398014 ) и клеток, несущих пустой вектор ( BBa_J13002 ) в 5 мл LB среде с соответствующими антибиотиками в течение ночи.
  2. Передача 500 мкл ночной культуры в 50 мл свежей LB (с антибиотиком) и инкубировать до ячейки мутности достигли OD (оптической плотности) 0,3 при 600 нм.
  3. Центрифуга в течение 10 мин при 4000 оборотах в минуту и ​​ресуспендируют осадок в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4).
  4. Центрифуга в течение 10 мин при 4000 оборотов в минуту и ​​ресуспендируют осадок в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера теперь содержащих E2 соли и 0,66% объем / объем глицерина (азот deficienт среде).
  5. Измерьте клетки мутности (OD 600).
  6. Подготовка клетки смеси аликвоты 6 мл в 25 мл закрытой крышкой стеклянной колбы и не-клеточных элементов управления (E2 соли + 0,66% объем / объем глицерина).
  7. Добавить 100 нмоль алканов в каждую колбу.
  8. Инкубируйте смеси при 37 ° С в течение 24 ч (укоротить, когда более высокие темпы получены).
  9. Измерьте OD 600 после инкубации.
  10. Извлечение углеводородов в культуре средств массовой информации в этилацетат и определения концентрации углеводородов в культуре клеток с помощью газовой хроматографии (см. протокол 3).
  11. Рассчитать деградации на единицу биомассы путем деления общей суммы алканов преобразуется общего настоящее биомассы в каждой колбе (конвертировать OD 600 на сухой вес). Разделив результат на экспериментальной продолжительность приводит к деградации активность на единицу биомассы в единицу времени. Средняя берется из трех отдельных трасс.

3. Alkane преобразования ферментов анализа, вVitro

Этот анализ был выполнен по существу в соответствии с методом, описанным Li и соавт. (2008).

  1. Культура E. кишечной клетки, экспрессирующие ген Lada ( BBa_K398017 ) и клеток, несущих пустой вектор ( BBa_J13002 ) в 50 мл LB среде с соответствующими антибиотиками в течение ночи.
  2. Передача 500 мкл ночной культуры в 50 мл свежей LB (с антибиотиком) и инкубировать до ячейки мутности достигли оптической плотности 0,6 при 600 нм.
  3. Центрифуга 10 мин при 4000 оборотов в минуту (4 ° C) и ресуспендируют осадок в 5 мл 50 мМ Трис буфера.
  4. Разрушать ультразвуком (Cell разрушитель, LA Biosystems) клеток на 40% рабочий цикл с выходом управления 4, держать раствор на льду в течение всего срока.
  5. Центрифуга полученную смесь в течение 5 мин при 4000 оборотов в минуту на 4 и Dнапример, C для удаления остатков клеток. Передача супернатант в чистую пробирку.
  6. Определение общей концентрации белка в клеточных экстрактах с помощью анализа Брэдфорда. Примечание: используйте стеклянные флаконы, чтобы предотвратить увеличение фона и / или потерю белка.
  7. Подготовьте 100 мл смеси, содержащей 0,1% об / об алкана и 50 мМ Трис-HCl буфера.
  8. Смесь нагревают при 100 ° С в течение 5 мин. Примечание: Выполните этот шаг только для средне-длинной цепи алканов с высокой температурой кипения. (Например, C 16: 287 ° C).
  9. Для достижения оптимальной растворимости алканов, разрушать ультразвуком в течение 1 мин в то же время теплым до получения однородной, вязкой смеси.
  10. Добавить 1 мМ НАДН, 1 мМ FMN, 1 мМ MgSO 4 и 0,01 о / Triton X-100.
  11. Подготовить 6 мл аликвоты в 25 мл закрытой крышкой колбы.
  12. Добавить достаточного количества клеточного экстракта (в зависимости от анализов Брэдфорд, конечная концентрация 5 мг белка / л). Подготовка нет белка контроль.
  13. Инкубировать при 60 ° C (для оптимального электроннойnzymatic деятельности) в течение 24 часов.
  14. Извлечение углеводородов в культуре средств массовой информации в этилацетат и определения концентрации углеводородов в культуре клеток с помощью газовой хроматографии (см. протокол 3).
  15. Рассчитать деградации на единицу биомассы путем деления общей суммы алканов преобразуется общего белка добавляли к каждой колбе (по калибровочной кривой Bradford). Дальнейшее деление на продолжительность эксперимента приводит к деградации активность на единицу клеточного белка в единицу времени. Средняя берется из трех отдельных трасс.

4. Этиловый ацетат добычи углеводородов и измерения концентрации

  1. Алканы извлекают из водного раствора путем добавления 2,5 мл этилацетата (аполярная solvant) до 6 мл экспериментального решения. Внутренний стандарт добавляется в растворитель при концентрации 0,1% (V / V). Стандарт (например, цикло-декан) варьируется в зависимости от ожидаемого диапазона пики интереса.
  2. Дополнительно: Добавить TritonX-100 к водной смеси и центрифуги образцов в течение 10 мин при 4000 оборотов в минуту для того, чтобы получить надлежащее двухфазной системе.
  3. Vortex смесь в течение 5 секунд (1.500 оборотов в минуту) и инкубировать при комнатной температуре до двух фаз отдельно.
  4. Удалить максимальное количество органического слоя (вверху) и высушить растворитель с использованием безводного сульфата магния.
  5. Удалить MgSO 4 путем фильтрации (0,2 мкм) и передать фильтрата в газе флаконы хроматограф для измерения или хранить при -20 ° C.
  6. Определить концентрацию газовой хроматографии с использованием CP-SIL 5ЦБ колонка (длина = 5 м). Inject 10 мкл образца в режиме разделенного (1:10, 230 ° C). Установить потока газа в колонке 1 мл / мин (гелий). В следующей программе температуры печи используются:
    Скорость Температура [° C] Время [мин]
    0 50 7,5
    50 90 1,0
    50 110 2,0
    50 130 2,0
    50 145 2,0
    50 160 2,0
    50 170 2,0
    50 185 2,0
    50 210 2,0
    50 250 2,0
    50 320 2,0
  7. Интеграция пики и исправить концентрации по отношению к внутреннему стандарту.

5. Алкоголь / альдегиддегидрогеназы деятельности пробирного

Этот анализ был выполнен по существу в соответствии с методом, описанным Kato и соавт.(2010).

  1. Культура E. кишечной клетки, экспрессирующие АДГ ( BBa_K398018 ) или ALDH ( BBa_K398030 ) генов и клеток, несущих пустой вектор ( BBa_J13002 ) в 50 мл LB среде с соответствующими антибиотиками в течение ночи.
  2. Передача 500 мкл ночной культуры в 50 мл свежей LB (с антибиотиком) и инкубировать до ячейки мутности достигли оптической плотности 0,6 при 600 нм.
  3. Центрифуга 10 мин при 4000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C и ресуспендируют осадок в 5 мл 50 мМ Трис буфера.
  4. Разрушать ультразвуком клетки решения при 40% рабочего цикла с выходом управления 4 (держать раствор на льду во время обработки ультразвуком).
  5. Центрифуга полученную смесь в течение 5 мин при 4000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С для удаления остатков клеток.
  6. Определите дляТаль концентрации белка клеточных экстрактов по Бредфорда (Примечание: использовать стеклянный флакон для предотвращения связывания с белками).
  7. Загрузите 96-луночный планшет с 180 мкл 57 мМ глицина буфер, содержащий NAD (конечная концентрация 1 мМ, рН 9,5) в каждую лунку.
  8. Добавьте 5 мкл спирта (альдегид), которые будут проверены на скважинах. Примечание: Тепло спирты с длинной цепью до начала анализа, чтобы жидкость. Для каждого спирта (альдегид) управление без подложки должна быть добавлена ​​(отрицательный контроль). Кроме того, подготовить пустой, содержащий смесь буфера и подложки без клеточного экстракта.
  9. Подогрейте тарелки ридер (Tecan Magellan v7.0) в течение 15 мин при 37 ° C, чтобы равновесие системы.
  10. Добавить достаточного количества клеточного экстракта (в зависимости от анализов Брэдфорд, конечная концентрация 5 мг белка / л). Подготовка нет белка контроль.
  11. Измерьте NADH производства с использованием спектрофотометра при длине волны 340 нм каждые 2-3 мин в течение 1 часа при 37 ° C.
  12. Рассчитать NADH дебит по наклону OD (340 нм). Примите во внимание длину пути света и коэффициента экстинкции NADH из 6220 М -1 см -1. Разделите NADH уровень добычи на общее количество белка добавил, чтобы выразить активность дегидрогеназы реакции в клеточный экстракт (U / мг общего белка клетки). Рассчитать среднее и стандартное отклонение от трех независимых трасс.

6. Характеристика pCaiF

  1. Культура E. кишечной клетки, экспрессирующие pCaiF-GFP конструкции ( BBa_K398331 ) и клеток, несущих промоутером в одиночку ( BBa_K398326 ) в течение ночи в 5 мл LB среднего соответствующими антибиотиками в течение ночи.
  2. Инокулировать 5 мл M9, содержащей 10 г / л глюкозы и антибиотиков с 50 мкл ночной культуры и расти в течение ночи.
  3. Субкультура 50 мкл в течение ночи результатом в 5 мл свежего M9 с 10 г / л и инкубировать до ячейки мутности достигли оптической плотности 0,2 при 600 нм.
  4. Загрузите 96-луночный планшет с 100 мкл свежей среды M9 содержащие необходимое количество источника углерода для тестирования в каждую лунку. Выполните трех экземплярах экспериментов для статистической оценки и добавить соответствующий отрицательный контроль (дикого типа E.coli К12).
  5. Добавьте 5 мкл ночной культуры в среде, содержащей скважин.
  6. Измерьте кривой роста (OD 600) и флуоресценции GFP (485 нм возбуждения излучения и 520), используя ридер каждые 10 мин в течение 18 ч при температуре 37 ° C с постоянной тряски.
  7. Рассчитать скорость роста и конкретного содержания GFP из соответствующих измерений и сравнить с управлением. Рассчитать среднее и стандартное отклонение по крайней мере трех независимых экспериментах.

7. Толерантность анализа

  1. КультураE.coli, выразив PhPFDα и β гена ( BBa_K398406 ) в течение ночи в 5 мл среды LB и соответствующие антибиотики. Е. палочки выражения Лада гена ( BBa_K398017 ) используется в качестве отрицательного контроля.
  2. Субкультура 10 мкл ночь вырост на свежий 5 мл LB (с антибиотиком) и инкубировать до ячейки мутности достигли оптической плотности от 0,3 до 0,4 при 600 нм.
  3. Развести культур со свежей среде до OD 600 в 0,1 достигнут.
  4. Загрузите 96-луночный планшет с 180 мкл среды M9 содержащей соответствующие антибиотики и надлежащего конечной концентрации токсичных соединений (например, 0, 4, 8, 10% н-гексан) в трех экземплярах. Потому что алканов смесей воды может привести к двухфазных системах, необходимо иметь соответствующие элементы управления на тарелку (например, Different штаммов и соответствующих пустых экспериментов).
  5. Добавить 20 мкл культуры (контроля) в лунки.
  6. Измерение концентрации биомассы (OD 600) использованием ридер каждые 10 мин в течение 24 ч при температуре 37 ° C с постоянной тряски.
  7. Рассчитайте темпы роста от соответствующих измерений для различных концентрациях агента и по сравнению с отрицательным контролем. Рассчитать среднее и стандартное отклонение по крайней мере трех независимых трасс.

8. Взаимодействие карт гомолога

  1. Приложение HIM была разработана для выполнения белком запросов PostgreSQL сервер баз данных STRING (бесплатно для академического использования) 20. Отображение гомолог взаимодействия приложение определяет взаимодействующих белков в оригинальной организма-хозяина, используя строку базы данных. Последовательности соответствующих генов взаимодействуют используется в доменной поиска, чтобы найти гомологичных генов в целевой организма. Cytoscape 4 используется для визуализации результатов сопоставления. HIM программное средство можно загрузить по адресу: https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
  2. Чтобы выполнить отображение (1) ввести ID BioBrick и приложение будет автоматически загружать часть последовательности данных из реестра стандартной биологической части 9, или (2) Введите (паста) последовательность данных в приложении.
  3. Использование веб-сайта STRING баз данных, чтобы найти ID STRING белка для введенного аминокислотной последовательности.
  4. Белка с высокой степенью гомологии определяется с помощью BLAST. Впоследствии приложение содержит список всех известных белков, взаимодействующих в организме источников и поиска гомологов в организме хозяина (например, кишечная палочка).
  5. Экспорт в результате предполагаемого списка взаимодействия с текстом или Cytoscape.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Преобразование алканов

Активность трех стадий окисления от алкана до соответствующей жирной кислоты оценивалась с помощью анализов клеток покоя и измерений активности ферментов. Результаты представлены по следующим путям реакций (1) алкангидроксилазы, (2) алкогольдегидрогеназы и (3) альдегиддегидрогеназы.
На первом этапе были сконструированы различные плазмиды для средне- и длинноцепочечных алканов. Плазмида BBa_K398014 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Принцип BioBrick используется для создания шасси для деградации алканов и доказательство принципа для отдельных компонентов набора инструментальных средств было получено. Несколько анализов предлагается измерять в естественных условиях и в пробирке деятельности алкана ферменты пути. Представленная работа успешно демонстрирует ряд методов, которые могут быть использованы для определения активности ферментов и выражения в организме хозяина E. палочка после осуществления соответствующей BioBricks...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В экспериментах, проведенных в этом видео-статьи были разработаны для международного генно-инженерных машин конкуренции 9. Авторы хотели бы поблагодарить членов ИГЕМ команды Лука Bergwerff, Питер ван TM Boheemen, Jelmer Cnossen, Hugo F. Куэто Рохас и Рамон ван дер Валк для помощь в исследованиях. Мы благодарим Хан-де-Winde, Стефан де-Кок и Эсенгул Йылдырым за полезные обсуждения и проведения этого исследования. Эта работа была поддержана TU Delft University Отдел биотехнологии, биоинформатика Delft лаборатории, TU Delft департамента Bionanoscience, Oil Sands лидерство Initiative (OSLI), Стад studentenuitzendbureau, Нидерланды Genomics инициативы, Kluyver центр, Biotechnologische Nederlandse Vereniging (Stichting биотехнологии Nederland) , DSM, Geneart, Greiner Bio-One и Genencor.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
E. coli K12New England BiolabsC2523H
Октановоечисло Fluka74822
ГексадеканFluka52209
октанол-1Fluka95446
додеканол-1Sigma-Aldrich126799
HexaneSigma-Aldrich296090
NADHSigma-AldrichN4505
FMNSigma-AldrichF2253
MgSO4J.T. Baker Casno7487 889
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
T4 лигазаNew England BiolabsM0202L
Газовый хроматограф
Клеточный разрушительLA BiosystemsCD-019
СпектрофотометрAmersham pharmaciaspec 2000
Считыватель пластинTecan Group Ltd.Magellan v7.0
Инкубатор Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubBDelft University of Technology на кафедре биотехнологии или реестра стандартных биологических частейBBa_K398014Alkane Hydroxylaze System
Резистентность: Chloramphenicol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA Делфтский технологический университет на кафедре биотехнологии или Реестр стандартных биологических частейBBa_K398027ladA Protein Generator
Устойчивость: Chloramphenicol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH Делфтский технологический университет на кафедре биотехнологии или Реестр стандартных биологических частейBBa_K398018ADH generator
Сопротивление: Chloramphenicol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH Делфтский технологический университет на факультете биотехнологии или Реестр стандартных биологических частейBBa_K398030ALDHgenerator
Сопротивление: Chloramphenicol
BioBrickTM K398326: pCaiF Делфтский технологический университет на факультете биотехнологии или Реестр стандартных биологических деталейBBa_K398326pCaiF promoter
Резистентность: Chloramphenicol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401Делфтский технологический университет на кафедре биотехнологии или Реестр стандартных биологических частейBBa_K398331pCaiF измерительное устройство
Сопротивление: Chloramphenicol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα -BBa_J61107- Делфтский технологический университет на факультете биотехнологии или реестре стандартных биологических частейBBa_K398406Толерантность к растворителям кластер
Стойкость: Хлорамфеникол

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allen, E. W. Process water treatment in Canada's oil sands industry: I: Target pollutants and treatment objectives. J. Environ. Eng. Sci. 7, 123-138 (2008).
  2. Alon, U. An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological Circuits. , CRC Press. (2007).
  3. Center, O. P. Understanding Oil Spills and Oil Spill Response. , (1999).
  4. Cytoscape. An Open Source Platform for Complex Network Analysis and Visualization [Internet]. , Available from: http://www.cytoscape.org (2012).
  5. Non-Invasive Biomass Monitor with Wide Linear Range [Internet]. , Available from: http://www.buglab.com/docs/OnLineODMeasurement.pdf (2012).
  6. Eichler, K., Buchet, A., Lemke, R., Kleber, H. P., Mandrand-Berthelot, M. A. Identification and characterization of the caiF gene encoding a potential transcriptional activator of carnitine metabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178, 1248-1257 (1995).
  7. Feng, L., Wang, W., Cheng, J., Ren, Y., Zhao, G., Gao, C., Tang, Y., Liu, X., Han, W., Peng, X., et al. Genome and proteome of long-chain alkane degrading Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 isolated from a deep-subsurface oil reservoir. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (13), 5602-5607 (2007).
  8. Fujii, T., Narikawa, T., Takeda, K., Kato, J. Biotransformation of various alkanes using the Escherichia coli expressing an alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF6. Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (10), 2171-2177 (2004).
  9. iGEM. Registry of Standard Biological Parts [Internet]. , Available from: http://partsregistry.org/Main_Page (2012).
  10. Kato, T., Miyanaga, A., Haruki, M., Imanaka, T., Morikawa, M., Gene Kanaya, S. cloning of an alcohol dehydrogenase from thermophilic alkane-degrading Bacillus thermoleovorans B23. J. Biosci. Bioeng. 91 (1), 100-102 (2001).
  11. Kato, T., Miyanaga, A., Kanaya, S., Morikawa, M. Gene cloning and characterization of an aldehyde dehydrogenase from long-chain alkane-degrading Geobacillus thermoleovorans B23. Extremophiles. 14, 33-39 (2010).
  12. Kieboom, J., De Bont, J. aM. Bacterial Stress Responses. , ASM Press. Washington, D.C. (2000).
  13. Kotte, O., Zaugg, J. B., Heinemann, M. Bacterial adaptation through distributed sensing of metabolic fluxes. Mol Syst Biol. 6, 355(2010).
  14. Kremling, A., Bettenbrock, K., Gilles, E. D. Analysis of global control of Escherichia coli carbohydrate uptake. BMC Syst. Biol. 1, (2007).
  15. Li, L., Liu, X., Yang, W., Xu, F., Wang, W., Feng, L., Bartlam, M., Wang, L., Rao, Z. Crystal structure of long-chain alkane monooxygenase (LadA) in complex with coenzyme FMN: unveiling the long-chain alkane hydroxylase. J. Mol. Biol. 376 (2), 453-465 (2008).
  16. Lin, H. Y., Mathiszik, B., Xu, B., Enfors, S. O., Neubauer, P. Determination of the maximum specific uptake capacities for glucose and oxygen in glucose-limited fed-batch cultivations of Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 73 (5), 347-357 (2001).
  17. Okochi, M., Kanie, K., Kurimoto, M., Yohda, M., Honda, H. Overexpression of prefoldin from the hyperthermophilic archaeum Pyrococcus horikoshii OT3 endowed Escherichia coli with organic solvent tolerance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79 (3), 443-449 (2008).
  18. Rehm, H. J., Reiff, I. Mechanisms and occurrence of microbial oxidation of long-chain alkanes. Adv. Biochem. Eng. / Biotechnol. 19, 175-215 (1981).
  19. Rojo, F. Degradation of alkanes by bacteria. Environ. Microbiol. 11 (10), 2477-2490 (2009).
  20. STRING 9.0 Known and Predicted Protein-Protein Interactions [Internet]. , Available from: http://string-db.org/newstring_cgi/show_download_page.pl (2012).
  21. Van Beilen, J. B., Panke, S., Lucchini, S., Franchini, A. G., Rothlisberger, M., Witholt, B. Analysis of Pseudomonas putida alkane-degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes. Microbiology. 147, 1621-1630 (2001).
  22. Wang, L., Tang, Y., Wang, S., Liu, R. L., Liu, M. Z., Zhang, Y., Liang, F. L., Feng, L. Isolation and characterization of a novel thermophilic Bacillus strain degrading long-chain n-alkanes. Extremophiles. 10 (4), 347-356 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Escherichia coliBioBricks

Похожие статьи