Очистка и агрегации белка-предшественника амилоида внутриклеточного домена

Краткое содержание

Метод крупномасштабной очистки APP внутриклеточного домена (AICD) описывается. Мы также описать методологию, чтобы побудить В пробирке AICD агрегирования и визуализации атомно-силовой микроскопии. Описанные методы могут быть использованы для биохимических / структурных характеристик AICD и последствия молекулярных шаперонов на его агрегации.

Аннотация

Белка-предшественника амилоида (APP) представляет собой трансмембранный типа я белка, связанного с патогенезом болезни Альцгеймера (AD). APP характеризуется большой внеклеточный домен и короткий цитозольного домена называется APP внутриклеточного домена (AICD). Во время созревания через секреторный путь, APP могут расщепляться протеазами называется α, β, γ и-секретазы ^1. Последовательное протеолитического расщепления APP с β и γ-секретазы приводит к образованию небольшого пептида протеолитические, называется Ар, который является амилоидогенных и основной составляющей старческих бляшек. AICD также освобожден от мембраны после обработки секретазы, и через взаимодействие с Fe65 и Tip60, можно перемещать в ядро участвовать в регуляции транскрипции нескольких генов-мишеней ^2,3. Белок-белковые взаимодействия, связанные с AICD могут повлиять на торговлю, обработку и клеточных функций голо-APP и C-терминологиюАль-фрагментов. Недавно мы показали, что AICD можете совокупности в пробирке, и этот процесс тормозится AD-замешан молекулярного шаперона ubiquilin-1 ^4. В соответствии с этими выводами, AICD выявила гидрофобных доменов, и внутренне неупорядоченным в пробирке ^5,6, однако он получает стабильную вторичную структуру при связывании с Fe65 ^7. Мы предположили, что ubiquilin-1 предотвращает нарушение меж-и внутримолекулярных взаимодействий AICD, предотвращая агрегацию в пробирке и в неповрежденные клетки ^4. Хотя большинство исследований сосредоточена на роли АЭС в патогенезе БА, роль AICD в этом процессе не ясно. Выражение AICD было показано, индуцируют апоптоз ^8, для модуляции сигнальных путей, ⁹ и регулировать кальция сигнализации ^10. Сверхэкспрессия AICD и Fe65 в трансгенных мышах вызывает болезнь Альцгеймера, как патология ^11, а в последнее время AICD был обнаружен в бюстгальтерВ лизатов с помощью вестерн-блоттинга при использовании соответствующего антигена поиска методов ^12. Для облегчения структурных, биохимических и биофизических исследований AICD, мы разработали процедуру для получения рекомбинантных большого количества очень чистой AICD белка. Мы также описать способ индуцирования в пробирке тепловой агрегации AICD и анализ атомно-силовой микроскопии. Методы, описанные полезны для биохимических, биофизических и структурных характеристик AICD и последствия молекулярных шаперонов на AICD агрегации.

Протокол

1. Экспрессия рекомбинантного APP внутриклеточного домена (AICD)

1. Transform E. Штамм BL21 с человеческим AICD (остатки 649-695 АРР, нейронные изоформы нумерации) клонировали в векторе pGEX-4Т-1 (GE Healthcare). Этот вектор будет выражать AICD как С-концевой фрагмент гибридный белок глутатион-S-трансферазы (GST). Этот вектор также кодирует последовательность расщепления тромбином для облегчения удаления фрагмента GST. Подробная информация о клонировании AICD в pGEX-4Т-1 можно найти в нашей предыдущей публикации ^4.
2. С одной колонии, привить 10 мл LB бульоне с ампициллином (100 мкг / мл) и инкубировали в течение ночи при 37 ° C при сильном встряхивании.
3. На следующее утро, привить 400 мл LB / ампициллин в одну литровую колбу с 5 мл ночной культуры.
4. Инкубировать при 37 ° С при интенсивном встряхивании до оптической плотности при 600 нм достигла 0,4 до 0,6. Это обычно занимает от 2 до 2,5 часов.

Содержание "> На данный момент это может быть желательно брать небольшого образца (~ 10 мкл) следить за очисткой SDS-PAGE (см. рисунок 1а, б). Каждая последующая стадия очистки должны также иметь небольшой аликвоты для анализа удалено на SDS-PAGE.

5. Индуцируют экспрессию GST-AICD добавлением 0,4 мМ изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид (IPTG). Инкубировать при 37 ° С при интенсивном встряхивании в течение 5 часов.
6. Центрифуга клетки при 6000 х г в течение 15 мин при 4 ° C. Осадок клеток могут храниться при -80 ° C в течение нескольких месяцев на данном этапе процедуры.

2. Очистка GST-AICD

1. Подготовка 50 мл буфера для лизиса следующим образом: 1 мМ ДТТ, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 0,1% Triton-X100, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), полный коктейль ингибиторов протеаз (Roche Applied Science), и фосфатным буферным раствором. Охладить на льду.
2. Оттепель бактериальных гранул (если ранее замороженных) нальда.

В этот момент очень важно, чтобы все действия выполняются при 4 ° С для ограничения протеолиза. Все трубы, буферы и другие реагенты должны быть предварительно охлажденным. При использовании французской прессе или эмульгатор для лизиса, они должны быть предварительно охлажденное, а также.

3. Тщательно ресуспендируйте бактериальных гранул в 20 мл буфера для лизиса. Сочетание встряхивания и растирания с 10 мл пипетки на льду будет обеспечивать полное ресуспендирования гранул.
4. Передайте ресуспендированных бактериальных клеток через эмульгатор (например, Авестина EmulsiFlex-C3) или французского ячейки давления, предварительно охлажденный до 4 ° C на 30000 фунтов на квадратный дюйм. Передайте лизат через эмульгатор второй раз. Сбор лизат в предварительно охлажденный 50 мл трубки.

Основным преимуществом этих двух документов является то, что они минимизируют нагрева образца. Обычно используется техника ультразвука создает значительные тепла на кончик зонда и ультразвукомможет привести к агрегации рекомбинантных белков.

5. Центрифуга лизата при 15000 х г в течение 30 мин. Отделите и держать супернатанта в предварительно охлажденный 50 мл трубки.
6. Добавить 500 мкл 50% суспензии глутатион-агарозы (Sigma-Aldrich). Поворот в течение 30 мин при 4 ° C. В то время как образец вращается, делает свежего буфера элюирования: 50 мМ Трис 7,8, 0,1% Triton-X100, 0,5 мМ ДТТ, 10 мМ восстановленный глутатион.

Единственный шаг протокол, который проводился при комнатной температуре элюции. Таким образом, элюирующего буфера хранится при комнатной температуре. Элюции буфером должны быть готовы свежие.

7. Залить лизат и шлама в одноразовый 5 "колоночной хроматографии полистирола с грубыми (90-130 мкм), фильтры (Evergreen Scientific). Промойте колонку 5 раз с 3 мл фосфатным буферным раствором.
8. Закройте нижнюю часть колонны и добавить 500 мкл буфера элюирования номере температуры. Закройте верхнюю частьколонки и вращаться в течение 5 мин при комнатной температуре. Собрать элюат в охлажденный 1,5 трубку микроцентрифуге мл. Повторите элюирования еще два раза (1,5 мл элюата общего).
9. Диализировать элюата в 10,000 молекулярная масса отсечки диализной мембраны (например, Thermo Scientific Slide-A-анализатора диализа кассеты) в 4 л фосфатный буферный раствор в течение ночи при 4 ° C. Диализ против дополнительных 4 литра фосфатным буферным раствором при 4 ° С в течение 1 часа на следующий день.
10. Удалить белка из диализ кассеты и выполнения анализа белков для определения количественного выхода GST-AICD. Типичный очистка от 400 мл культуры приведет к выходам> 20 мг очищенного белка в концентрации 10-20 мг / мл. Аликвотировать белка в 200 мкл аликвоты и заморозить при температуре -80 ° C.

3. Тромбин Расщепление GST-AICD и очистка AICD

1. Оттепель 200 мкл очищенного GST-AICD и добавить 20 мкл 1 ед / мкл Thrombдюйм Инкубируют в течение ночи при 37 ° C.

Качество и чистота тромбина значительно варьирует среди производителей, и может быть значительным источником загрязнения. Мы используем тромбина от GE Healthcare (см. таблицу реагентов). После инкубации в течение ночи> 95% слитого белка должно быть расщеплен (рис. 1б).

2. После ночного расщепления тромбином, вполне вероятно, что часть освобожденных AICD прошли агрегации и решение может появиться облачность. Снимите агрегированного материала путем центрифугирования при 20000 х г в течение 30 мин при 4 ° C. Удалить супернатант в предварительно охлажденный пробирке.
3. Добавить 50 мкл 50% глутатион-агарозы суспензии и 50 мкл 50% р-aminobenzamidine-агарозы суспензии для удаления GST и тромбин, соответственно. Инкубируйте с вращением в течение 5 мин при комнатной температуре.
4. Центрифуга кратко осадка агарозном бисером, и удалите супернатант в новую пробирку. Извлечение тОн GST еще четыре раза с глутатион-агарозы. Один экстракции р-aminobenzamidine-агарозы достаточно, чтобы удалить 20 U тромбина.
5. Выполнить анализ белков количественного по 5 мкл очищенного AICD. Типичные выходы из 400 мл культуры 50-100 мкг в концентрации от 0,2 до 0,5 мг / мл. Повышение урожайности возможно путем расщепления больших объемов GST-AICD.

Очищенный AICD должны быть готовы свежие для биохимических / биофизических характеристик. Неиспользованный материал должен быть уничтожен. Кроме того, можно сосредоточиться AICD путем лиофилизации образца и ресуспендирования в меньшем объеме буфера ^6. Если обнаружение AICD требует блоттинга (например, после фильтра ловушки или дот-блот анализа), антиген поиска на мембране должна быть выполнена, как описано Pimplikar и Suryanarayana ^12.

4. AICD агрегации для атомно-силовой микроскопии (АСМ)

1. Развести свежеприготовленный AICD в рhosphate буферный раствор с концентрацией 0,1 мг / мл в конечном объеме 15 мкл. На данный момент, различные соединения и / или белки могут быть добавлены, чтобы определить, если они тормозят агрегацию AICD. Например, мы показали, что эквимолярной концентрации ubiquilin-1 предотвращения агрегации AICD в этом тесте ^4.

Кроме того, можно объединять большие объемы реакции для биохимических экспериментов, таких как фильтр анализы ловушку и рассеяние света ^4. Мы имели успех выполнения анализов фильтр ловушки на реакционной смеси такого размера, как 400 мкл с AICD разбавляют до таких низких концентрациях, как 1 мкМ.

2. Вызвать тепловой агрегации путем инкубации образцов при 43 ° C при встряхивании со скоростью 800 оборотов в минуту в Eppendorf Thermomixer течение 48 часов. Эта температура была выбрана основаны на сопровождающих анализов, которые исследуют тепловой агрегации подложки модель шаперона цитрат-синтазы ^4,13.

3. Развести образца 20-кратный в деионизированной воде и месте 2 мкл на свежесколотых слюды. Высушите образца в эксикаторе в течение ночи. Это будет необходимо эмпирически определить оптимальные разведения для работы с изображениями, и таким образом несколько разведений от 10 - до 100-кратного бы разумным.
4. Визуализируйте агрегированных AICD с помощью операционной AFM в освоении режиме ^14. Консолей используются с золотым покрытием микро резкое рычаги нитрида (MSNL, Bruker) с номинальным радиусом кончика 2 нм. Типичные нажав амплитуды мажорния изображений на 10-20 нм на резонансной частоте консолей (30-50 кГц).

Мы обнаружили, что качество и контрастность изображения различных агрегатов белка зависит от приложенной силы и продолжительности эксперимента. Чтобы свести к минимуму образца возмущение чаевые, мы сохранили применять силу относительно низкой, сохраняя заданное соотношение выше 95% и ограничение сканирования каждого образца до 5-10 мин. Обработка изображений проводили с WSxM программного обеспечения (Nanotec). Стандартная обработка изображений состояла из плоскости вычитание и уплощение. Наши лаборатории используют "домашний построен" ^АСМ-15 сопряжена с коммерческими сканирующего зондового микроскопа системы управления (Nanotec).

5. Представитель Результаты

Выражения и относительного обогащения GST-AICD показано на рисунке 1а. После лизиса, большинство из слитого белка присутствует в растворимой фракции, и, следовательно, извлечение из inclusiна телах не требуется. Материал элюировали из колонки глутатион агарозном составляет> 95% чистой. При подготовке показано на рисунке 1, концентрация белка элюировали из колонки составила 14,5 мг / мл, а доходность составила 22 мг (от исходной культуры на 400 мл). Расщепление 200 мкл этого препарата в течение ночи с 20 U тромбина в результате почти 100% расщепления гибридного белка (рис. 1б). Количество тромбина использовали достаточно низкой, чтобы не быть обнаружены путем окрашивания Кумасси синим (см. "Расколотая" переулок, Рис. 1b). Удаление тромбина и GST привело к некоторой потере материала, однако это было> 90% чистой с выходом в этой подготовительной из 70 мкг AICD в концентрации 0,35 мг / мл. Рис. 1С показана схема для агрегации AICD и последующего анализа. AICD агрегатов изображается AFM, как правило, сфероид / аморфным, и варьируются в размерах от 50 до 100 нм (рис. 1D, F). СовокупныйМатериал не поддается обнаружению при эквимолярного количества сопровождающих ubiquilin-1 добавляют в реакцию агрегации (рис. 1E) ^4.

Рисунок 1. Очистка и агрегации AICD.) Кумасси синего окрашивания образцов, собранных на каждом этапе процесса очистки. Для неиндуцированных и индуцированные образцов 20 мкл от общего числа бактерий проводили на геле. Для фракции супернатанта, 5 мкл лизатов (от общего объема 20 мл) проводили на геле. Для фракции гранул, осадок суспендируют в 20 мл буфера для лизиса, и 5 мкл этот материал обрабатывали ультразвуком в ультразвукового водяной бане в течение 30 мин при 4 ° C до погрузки на гель. Для расходе, 5 мкл были работать на геле. Количество элюата загружены на гель указаны. B) кумасси синим окрашенный гель нерасщепленного и дрова GST-AICD (2 мкл) и 1 и 5-мU; л очищенного AICD. C) Блок-схема AICD очистки, агрегации и анализа. D, E) представитель АСМ изображение термически объединяются AICD в отсутствии (D) и наличие (E) молекулярного шаперона ubiquilin-1. F) Гистограмма распределения по размерам AICD агрегатов.

Обсуждение

В этом протоколе мы наметили порядок получения особо чистой AICD для структурных, биофизических и биохимических анализов. Эта процедура не требует сложного оборудования хроматографии и, следовательно, доступными для большинства лабораторий. Другие группы, очистив AICD ^5-7,16, в том числе GST-AICD ^17-19, для биохимического / структурного анализа. Недостатки в предыдущие протоколы включают плохой растворимости AICD ^16, меньше, чем идеал чистоты ^17, и требования к размеру исключе...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
pGEX-4Т-1	GE Healthcare	28-9545-49
Тромбин	GE Healthcare	27-0846-01
Ампициллин	Fisher Scientific	BP1760
Bradford анализа белка реагентов	Bio-Rad	500-0002
Кумасси синим	Bio-Rad	161-0786
IPTG (изопропил-бета-D тиогалактопиранозид)	Sigma-Aldrich	I6758
Глутатион-агарозы	Sigma-Aldrich	G4510
р-aminobenzamidine-агарозы	Sigma-Aldrich	A7155
Полное коктейля ингибитора протеазы	Roche	11836170001
Слайд-A-анализатора кассеты диализа	Thermo Scientific	66380
Хроматографические колонки	Evergreen Научные	208-3367-050
Эмульгатор	Авестина, Inc	EmulsiFlex-C3	Настоятельно рекомендуется
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670107
Слюда дисков	Ted Pella	50-12
AFM консолей	Bruker	MSNL-10
WSxM программного обеспечения	Nanotec	N / A	Frе скачать