Новый метод скрининга для направленной эволюции термостабильных ферментов Бактериолитические

Summary

Роман направленной эволюции метода, специфичные для области термостойкости инженерных была разработана и утверждена, следовательно, для бактериолитический ферментов. После всего лишь один тур случайного мутагенеза, развивались бактериолитический фермент, PlyC 29C3, отображаемых в два раза превышает остаточную активность по сравнению с белком дикого типа после повышенной температуры инкубации.

Abstract

Направленная эволюция определяется как метод использования естественного отбора для создания белков, приобретающих определенные свойства, которые не связаны с белком в природе. В литературе приведено множество примеров реализации направленной эволюции для успешного изменения молекулярной специфичности и катализа¹. Основное преимущество использования направленной эволюции вместо более рациональных подходов в молекулярной инженерии связано с объемом и разнообразием вариантов, которые могут^{быть проверены}. Одно из возможных применений направленной эволюции заключается в улучшении структурной стабильности бактериолитических ферментов, таких как эндолизины. Бактериофаги кодируют и экспрессируют эндолизины для гидролиза критической ковалентной связи в пептидогликане (т.е. клеточной стенке) бактерий, что приводит к лизису клетки-хозяина и высвобождению вирионов потомства. Примечательно, что эти ферменты обладают способностью внешне индуцировать лизис восприимчивым бактериям в отсутствие фагов и, кроме того, были проверены как in vitro, так и in vivo на предмет их терапевтического потенциала^3-5. Предметом нашего исследования направленной эволюции является эндолизин PlyC, который состоит из субъединиц PlyCA и PlyCB⁶. При очистке и добавлении наружно голофермент PlyC лизирует стрептококки группы А (GAS), а также другие стрептококковые группы в течение нескольких секунд и, кроме того, был валидирован in vivo против GAS⁷. Важно отметить, что мониторинг остаточной кинетики фермента после инкубации при повышенной температуре дает явные доказательства того, что PlyC резко теряет литическую активность при 45 °C, что предполагает короткий терапевтический срок хранения, что может ограничивать дополнительное развитие этого фермента. Дальнейшие исследования показали, что недостаточная термическая стабильность наблюдается только для субъединицы PlyCA, в то время как субъединица PlyCB стабильна при температуре до ~90 °C (неопубликованное наблюдение). Помимо PlyC, в литературе есть несколько примеров, описывающих термолабилильную природу эндолизинов. Например, эндолизины Staphylococcus aureus LysK и Streptococcus pneumoniae эндолизины Cpl-1 и Pal спонтанно теряют активность при 42 °C, 43,5 °C и 50,2 °C соответственно^8-10. Согласно уравнению Аррениуса, которое связывает скорость химической реакции с температурой, присутствующей в конкретной системе, увеличение термостабильности будет коррелировать с увеличением ожидаемого срока годности^. С этой целью было показано, что направленная эволюция является полезным инструментом для изменения тепловой активности различных молекул в природе, но никогда эта конкретная технология не была успешно использована для изучения бактериолитических ферментов. Точно так же не существует успешных объяснений прогрессирующей структурной стабильности этого конкретного класса противомикробных препаратов в целом. В этом видео мы используем новую методологию, в которой используется подверженная ошибкам ДНК-полимераза с последующим оптимизированным процессом скрининга с использованием 96-луночного микротитрового планшета для выявления мутаций в субъединице PlyCA стрептококкового эндолизина PlyC, которые коррелируют с повышением кинетической стабильности фермента (рис. 1). Результаты, полученные после всего одного раунда случайного мутагенеза, позволяют предположить, что методология генерирует варианты PlyC, которые сохраняют более чем в два раза большую остаточную активность по сравнению с PlyC дикого типа (WT) после обработки при повышенной температуре.

Protocol

1. Определение оптимальных условий отопления

Во-первых, необходимо экспериментально определить оптимальную температуру инкубации и время, чтобы использовать для отопления шагом в анализе. Для наших PlyC модели, важно отметить, что Е. палочка совместно трансформировали plyCA и plyCB генов на отдельных плазмид выражение было показано, образуют полнофункциональную PlyC холофермента ^6. 96-луночные подготовки пластины микротитровальных, а также рост клеток условий и последующий метод покрытия реплики были адаптированы из примеров, приведенных в литературе ^12-16. Инкубационный период от 30 минут будет подходящим для этого анализа, как результаты предыдущих экспериментов тепловой инактивации диктовать быстрой потери активности при краткосрочной инкубации в среде, превышающих физиологическую температуры (неопубликованные наблюдения). Оптимальная температура инкубации в течение PlyC было выяснено следующее:

1. Transform выражение конструкция pBAD24: plyCA (Amp ^г) в компетентные E. Штамм DH5α pBAD33: plyCB (см ^г).
2. Плита трансформантов на Лурия-Bertani (LB) агаром дополнить ампициллин (100 мкг / мл) и хлорамфеникол (35 мкг / мл). Инкубируйте пластины течение ночи при 37 ° C.
3. С стерильной зубочистки, привить отдельные колонии в каждом ряду скважин (рис. 2, а) в стерильном, ясно, плоскодонных 96-луночных, крышками планшет, который содержит 200 мкл LB дополнены ампициллин и хлорамфеникол.
4. Безопасное место 96-луночный планшет микротитровальных на 37 ° C инкубатор и вырастить бактерии в течение ночи при 300 оборотах в минуту.
5. Получение 96-луночный планшет микротитровальных от 37 ° C инкубатор и реплики пластину на новую 96-луночный планшет микротитровальных следующим образом:
   1. Добавить 180 мкл LB дополнены ампициллин и хлорамфениколВ каждую лунку реплики пластины.
   2. Передача 20 мкл бактерий из оригинальной пластины в соответствующие скважины в реплике пластину. Это должно привести к начальной OD ₆₀₀ ~ 0,5.
6. Безопасное место реплики пластины на 37 ° C инкубатор и Инкубировать в течение 1 часа при 300 оборотах в минуту, затем добавьте inductant. В случае pBAD системы экспрессии, inductant составляет 0,25% арабинозу. Другие системы экспрессии могут потребоваться различные inductants. Поместите пластину назад на 37 ° C инкубатор и дрожание со скоростью 300 оборотов в минуту для 4 дополнительных часа для обеспечения экспрессии белка. Уровни экспрессии обычно колеблется в пределах 10-20 мкг PlyC.
7. После экспрессии белка пришла к выводу, извлечь пластину реплики и гранулах бактерий путем размещения 96-луночный планшет микротитровальных в охлаждаемой центрифуге, которая содержит бакет-ротора, что соответствует 96-луночные планшеты для микротитрования. Центрифуга при 3000 оборотов в минуту в течение 10 мин при комнатной температуре.
8. Извлеките носитель супернатант медленно обращения планшет и аккуратно переливание средств массовой информации.
9. Лизиса клеток путем добавления 50 мкл B-PER II бактериального реагента Добыча белки в каждую лунку. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 мин.
10. Увеличение объема в каждую лунку по 120 мкл путем добавления 70 мкл фосфатным буферным раствором (PBS) рН 7,2.
11. Пелле нерастворимые продукты распада клеток, крутя пластинки в 3000 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° C в охлаждаемой центрифуге.
12. Передача 110 мкл растворимый лизат нефти в соответствующие лунки 96-луночного амплификатора.
13. Используя 30 мин в заданном времени инкубации, подвергать растворимые лизатов в настоящее время проживают в 96 и амплификаторе пластины для широкого круга градиента температуры охватывающей 15-20 ° С. Отметим, что целью является определить, на какой температуре частности фермент теряет> 95% каталитической активности.
14. После инкубирования, инкубировать 96-аамплификаторе пластины при температуре 4 ° C в течение 5 мин и передачи 100 мкл лизатов с растворимым 96-луночный планшет амплификатора в соответствующие скважины в финале 96-луночный планшет.
15. С 12-канальный multipipettor, добавьте 100 мкл ГАЗ штамм D471 в каждую лунку. Обратите внимание, D471 клетки первоначально лиофилизируют из ночи культуры и ресуспендировали с PBS рН 7,2 для получения OD ₆₀₀ из ~ 2,0.
16. Немедленно поместите 96-луночный планшет в планшет спектрофотометр и мониторинг кинетики ферментов путем измерения OD ₆₀₀ каждые 15 секунд в течение 20 мин. Самая низкая температура инкубации, что соответствовало скважин, которые не имели изменения оптической плотности (ΔOD ≤ 0,1) определяется как не-допустимой температуре.

После широкого экрана температуры выполняется с целью выявления не-допустимая температура, тем выше действия можно повторять в течение более узком диапазоне температур (5 ° -10 ° C) до выясненияточно, не допустимая температура для фермента интерес. Обратите внимание, что без разрешительных температуры, указанных в этом анализе могут быть различными, чем температура плавления выяснить с помощью других средств из-за различий в объеме, концентрация и т.п.

2. Создание библиотеки мутантов

Создание мутантов библиотеке пройти обследование включает в случайном включении мутаций ошибок ДНК-полимеразы с минимальным уклоном в нуклеотидной ген plyCA помощью GeneMorph II Kit Случайный мутагенез следующим образом:

1. Дизайн нуклеотидных праймеров с похожими температуры плавления (T _м) между 55-72 ° C с ограничением сайтах выбор на 5 'и 3' концах гена plyCA.
2. Поскольку желаемый частота мутаций составляет 2-3 нуклеотидов в plyCA (1,4 кб), используют ПЦР концентрации компонентов, а также амплификаторе условиях, рекомендованных заводом-изготовителем для низких F мутацииrequencies (0-4.5 за кб).
3. Клонирование генов мутагенизированных plyCA в вектор экспрессии pBAD24.
4. Преобразование конструкций в DH5α pBAD33: plyCB фон и пластины трансформантов на LB агаром дополнить ампициллин и хлорамфеникол.
5. Кроме того, преобразования и пластины DH5α pBAD33: plyCB с выражением вектора pBAD24, содержащий ген WT plyCA. Колонии с этой пластинки будет служить контроля во время скрининга.

3. 96 лунок Подготовка плиты Микротитровальные и условия роста клеток

1. Заполните каждую лунку 96-луночный планшет микротитровальные 200 мкл LB дополнены ампициллин и хлорамфеникол.
2. После схеме планшет (рис. 2б), тщательно выбирать отдельные колонии с ночлегом пластин агар с стерилизованное зубочистку и привить бактерий в назначенное а из 96 микротитровальных плаТе. Важно, чтобы гарантировать, что только одна колония на лунку засевают.
3. Встряхните надежно закреплены 96-луночный планшет микротитровальных на 300 оборотов в минуту в течение ночи при 37 ° C.

4. Реплика покрытие, индукция экспрессии белков и Lysate подготовка

1. Выполните шаги 1.5-1.11 из раздела "Определение оптимальных условий отопления" с одной модификацией. Храните оригинальные пластины при 4 ° С после стадии реплик покрытие пришел к выводу.
2. После шаг 1,11, передача 110 мкл лизатов растворимого сырья в соответствующие лунки 96-луночный планшет амплификаторе за исключением положительного контроля скважин A1-D1. Что касается положительных лизатов управления (т.е. лизатов, которые не нагреваются), передачи 100 мкл лизатов в соответствующие скважины в новом 96-луночный планшет микротитровальных, который будет служить в качестве окончательного пластины теста для эксперимента и хранить на льду.

5. Растворимые Lysate Термообработка

1. Нагрейте отрицательного контроля и мутантных растворимые лизатов в настоящее время находящихся в 96-луночный планшет амплификатора в амплификатор течение 30 мин при оптимизированных без разрешительных температуры инкубации определяются на шаге 1.
2. После не-допустимой температуре инкубации, инкубировать 96-луночный планшет амплификаторе при 4 ° С в течение 5 мин.
3. Передача 100 мкл лизатов с растворимым 96-луночный планшет амплификаторе их идентичными и места в финале 96-луночный планшет анализа микротитровальных, уже содержащий положительный контроль растворимые лизатов.
4. С 12-канальный multipipettor, добавьте 100 мкл ГАЗ штамм D471 в каждую лунку. Немедленно поместите пластину в планшет спектрофотометр.
5. Мониторинг кинетики ферментов путем измерения OD ₆₀₀ каждые 15 секунд в течение 20 мин.
   1. PlyC вариант с прогрессировала термическое поведение определяется как конструкция, которая может уменьшить оригинальной оптической плотности на 50 процентов меньше, чем 900 сек прибез разрешительного температуры. Кроме того, положительный контроль (т.е. не с подогревом, WT PlyC) нужно отобразить WT каталитической активности (T _1/2 ≤ 100 сек) и отрицательный контроль (т.е. нагревается, WT PlyC) должен быть лишен активности.
6. После того, как PlyC вариант с прогрессировала термическое поведение определяется, получить оригинальный пластины хранить при температуре 4 ° C и прививать бактерии из отдельных людей, так характерных для мутантов интерес в свежей среде LB дополнены ампициллин и хлорамфеникол. Расти посевной течение ночи при 37 ° C.
7. Извлечение и очистить плазмидной ДНК из культуры, а затем представить для секвенирования с целью выявления нуклеотидных мутаций, которые вывод повышенной термической поведение PlyCA. Кроме того, в дополнение небольшой аликвоты из ночной культуры с 10% глицерина и хранить при температуре -80 ° C для дальнейшего использования.

Results

В конце первого раунда случайного мутагенеза, более 6000 PlyC мутанты были обследованы и в общей сложности 35 мутантов с потенциально увеличить термическое поведение было выявлено, выбрать и последовательно. Геномного анализа, приведены в таблице I, показывают, что из 35 кандидатов, 7 из конструкций, содержащихся WT PlyCA последовательностей на уровне перевода, соответствующие ложных срабатываний, определенных анализа. Из оставшихся 28 кандидатов, мутации диапазон был от 1 до 6 нуклеотидных мутаций средняя скорость мутации в 2,75 нуклеотидов в гене plyCA, которая была в 2-3 нуклеотидных спектр мутаций, мы были таргетинга. На уровне трансляции, эта нуклеотидная мутация и диапазон частот дали аминокислоты спектр мутаций кислоты от 1 до 5 аминокислот, средняя скорость мутаций на 1,9 аминокислотных мутаций в PlyCA полипептида.

Из 28 кандидатов по меньшей мере одной аминокислоты Mutat кислотыиона, четыре из этих мутантных конструкций были случайным образом выбраны для дальнейших исследований для подтверждения, что длительный процесс отбора направленной эволюции методологии действительно функционирует должным образом. Мутант PlyC ферменты очищают до> 95% однородности на основе SDS-PAGE анализа, как описано ранее ^6-7. Фермент кинетики WT PlyC и каждая из четырех PlyC мутанты были характерны в равной молярной концентрации после инкубации очищенных ферментов на различных повышенных температурах. Деятельность контролировали после добавления D471 газа путем измерения оптической плотности при 600 нм каждые 15 секунд в течение 20 мин. Деятельность определяется как остаточная максимальной скорости фермента после тепловой инкубации. Из четырех кандидатов, случайно выбранные для дальнейших исследований, мутант 29C3 показала самый повышенной термической поведения. Термическое поведение WT PlyC и 29C3 была исследована при различных температурах, в то время как инкубации и анализа на деятельность в PBS рН 7,2 в80 нМ и 40 нМ концентрации, соответственно. 45-50 ° С инкубационный экспериментов (рис. 3) были выполнены в амплификатор, где образцы инкубировали в тонкостенный 96-луночный планшет амплификатора в общем объеме 120 мкл. 35 ° C, 40 ° C и 45 ° C инкубационный экспериментов (рис. 4 и 5) были выполнены в тепловой блок, где образцы инкубировали в 1,5 мл трубки микроцентрифужных в общем объеме 1,3 мл. Все эксперименты проводили в трех повторах.

WT PlyC 29C3 и не показали существенной разницы в кинетическую стабильность при комнатной температуре (25 ° C), как показано в первом множество баров на Рисунке 3. Тем не менее, после краткосрочной инкубации в течение 30 мин с температурой от 45-50 ° C, деятельность 29C3 была существенно выше, чем активность, характерные для WT построить в каждой точке температуры. Например, WT PlyC отображается на 44% потери активности на 45,2° C, тогда как 29C3 показали лишь 2% потери активности при той же температуре.

Долгосрочные инкубации исследований, сравнивающих остаточной активности обеих WT PlyC и 29C3 дополнительно были выполнены при температуре 35 ° C и 40 ° C по измерению остаточной активности в 24 и 48 очков час времени. При 35 ° C, 29C3 отображается 41% и 176% выше активность, чем WT PlyC через 24 и 48 ч инкубации моменты времени, соответственно (рис. 4а). При 40 ° C, 29C3 отображается 28% и 107% высокую активность, чем WT PlyC через 24 и 48 ч инкубации моменты времени, соответственно (рис. 4б).

Остаточной активности WT PlyC и 29C3 также мониторинг каждые 20 мин в течение в общей сложности 3 часа при 45 ° C. WT PlyC только был в состоянии сохранить 21% активности после 3 ч инкубации при этой температуре в то время как 29C3 удалось сохранить 46% активности. Период полувыведения (Т _1/2) для WT PlyC и 29C3 были на 67 и 147 минут, соответственно, предложить ния, что 29C3 имеет 2,2-кратное увеличение кинетической стабильности при 45 ° C (рис. 5).

Всего 1 тур кандидатов	35
Кандидаты с последовательностью WT PlyCA	7
Кандидаты с ≥ 1 мутации Amino кислота	28
- Средняя частота мутаций нуклеотидных (NT / plyCA)	2,75
- Диапазон нуклеотидных мутаций (NT)	1-6
- Средняя частота мутаций Amino Acid (AA / PlyCA)	1,9
- Amino Range Мутация кислоты (AA)	1-5

Таблица 1. Кандидат бассейн геномного анализа.

pload/4216/4216fig1highres.jpg "/>
Рисунок 1. Режиссер методологии анализа эволюции. В направленной эволюции, человек начинает с ведущим фермент, который будет WT PlyC в первом раунде. Библиотека PlyC мутантов, содержащих случайные беспристрастные нуклеотидных мутаций в гене plyCA затем построены ошибок ДНК-полимеразы, клонировали в вектор экспрессии pBAD24 и превращается в E. Штамм DH5α, уже содержащий pBAD33. plyCB индивидуальных трансформантов вносили в свои специфические лунку 96-луночный планшет для микротитрования. Через широкий процесс отбора, индивидуальный PlyC мутантов, которые являются каталитически активными после инкубации при недопустимых температур классифицируется как мутанты с повышенной кинетической стабильности. Theconstruct отображения наиболее продвинулись термическое поведение будет, следовательно, становится ведущим фермента в следующий раунд случайного мутагенеза. В целом, существует три полных раунда Randoм мутагенеза следует перетасовка ДНК в результате бактериолитический молекулы с развивались термическое поведение. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 2. 96-луночный планшет шаблоны для направленной эволюции анализа. Схемы планшет при определении оптимальных условий нагрева (рис. 2) состоит из одной прививки родительских WT PlyC клон в каждой строке планшет. Схема планшет во время скрининга мутантов (рис. 2, б) состоит из прививки каждую лунку в столбце 1 с уникальной родительских WT PlyC клона, а также прививки каждой лунки в колонках 2-12 с различными PlyC мутантных клонов. Wells A1-D1 предназначены для положительного родительского контроля, которая совместноnsist из WT PlyC конструкций не подвергается не-допустимой температуры инкубации. Wells E1-H1 предназначены для отрицательных родительского контроля, которые состоят из WT PlyC конструкций, которые подвергаются не-допустимой температуры инкубации.

Рисунок 3. Остаточная активность кинетического анализа сравнения WT PlyC и 29C3. Ферменты очищают до однородности и инкубировали в течение 30 мин в амплификатор на равных молярных концентрациях на любом комнатной температуре или при градиент температуры от 45-50 ° C. Ферментативная активность коррелирует с максимальной скоростью отображается после конкретного температуры инкубации. За исключением 25 ° C и 47,7 ° C, изменения в активности между WT и 29C3 при каждой температуре коррелирует с р-значение <0,05. Все данные представлены как среднее ± SEM из трех независимых экспериментов.

Рисунок 4. Остаточная активность кинетического анализа сравнения WT PlyC к 29C3 при температуре 35 ° C и 40 ° C. равных молярных концентрациях очищенного WT PlyC и 29C3 инкубировали в нагревательный блок при температуре 35 ° С (рис. 4а) или 40 ° С (рис. 4б). Остаточная активность фермента была измерена в 24 и 48 очков час времени. Деятельность отображаются каждой конструкции были нормированы на максимальную скорость отображается в нулевой момент времени точка. Различия в активности между WT и 29C3 в каждой точке температуры и времени коррелирует с р-значение <0,05. Все данные представлены как среднее ± SEM из трех независимых экспериментов.

Рисунок 5. Остаточная активность кинетического анализа сравненияWT PlyC к 29C3 при 45 ° C. равных молярных концентрациях очищенного WT PlyC и 29C3 инкубировали в нагревательный блок при 45 ° С и остаточной активности фермента измеряли каждые 20 мин в течение 3 часов. Деятельность отображаются каждой конструкции были нормированы на максимальную скорость отображается в нулевой момент времени точка. За исключением точек данных на 20 мин, изменения в активности между WT и 29C3 в каждый момент времени коррелирует с р-значение <0,05. Все данные представлены как среднее ± SEM из трех независимых экспериментов.

Discussion

Этот протокол, указаны на рисунке 1, представляет собой 96-луночные методологии пластины микротитровальных, что позволяет использовать направленной эволюции для увеличения термостойкости любой бактериолитический фермента. Благодаря использованию ошибок ДНК-полимеразы, можно ввести случайных мутаций, которые увеличивают общую кинетическую стабильность в переводе бактериолитический интерес молекулы, которые, как правило, за счет молекулярного реорганизаций, состоящий из увеличения электростатического, дисульфида моста и гидрофобных взаимодействий, которые генерируют улучшилось упаковки молекул, расширенные модификации поверхностного заряда сетях или усиление выше олигомеризации состоянии ^17-18. После введения нуклеотидных мутаций, обширные процедуры скрининга затем был использован для выявления мутаций, которые являются термически полезно. Представитель результаты, представленные здесь, были основаны на один раунд случайного мутагенеза. На самом деле, было высказано предположение, чтопо крайней мере, трех последовательных раундов случайного мутагенеза, каждый из которых использует самые надежные мутанта в качестве ведущего фермента, после перетасовки ДНК подходит для этих типов направленной эволюции тепловых исследований поведения ^2.

Важно понимать, что в то время как этот протокол определяет мутации, которые увеличивают кинетическую стабильность, эти варианты не обязательно возросла термостабильность. Молекула считается термостабильные, когда оно имеет способность сохранять свою структуру при высокой температуре. Тем не менее, в анализе представлены, остаточная активность мутантного лизатов не анализировали при той же температуре, что они были первоначально инкубировали в течение стадии термообработки и, следовательно, не может быть выбора для мутаций, которые способствуют рефолдинг, а не расширение термостабильность ^19. Пока мы экстраполяции термическое поведение как признак термической стабильностью, правда термической стабильности должна быть измерена эмпирическим путем Biophysческих методов, таких как кругового дихроизма (КД), дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) и дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF). Предварительные данные с компакт-диска и DSF эксперименты показывают, что несколько кандидатов, выявленных в методологии, представленной действительно отображения прогресса термостабильность (данные не показаны).

Хотя методика, представленная здесь, характерных для реализации повышенной тепловой поведение PlyC, эта же методика может быть дополнительно использованы для повышения тепловой активности других ферментов бактериолитический с некоторыми незначительными изменениями переменных, таких как буфер, частота мутаций, отопление условий и выражений системы. Одним из наиболее важных переменных, связанных с этим анализом относится к нуклеотидной скорость мутации ошибок ДНК-полимеразы. Мы решили использовать ошибок Mutazyme ДНК-полимеразы II в нашем направленной эволюции анализа в связи с экспериментальных доказательств того, данный фермент отображает наименьшее количество смещения сотношении которых нуклеотиды случайно включен в интересующего гена по сравнению с другими случайными методами мутагенеза, такие как использование гидроксиламина, мутатор E. штаммов и других ошибок ДНК polyermases ^20. В целом, снижение ставок мутации имеют тенденцию быть более желательным по двум причинам. Во-первых, инженерно термостабильность с белками, как правило, состоит из сравнительно небольшого числа аминокислотных замен. Высокие темпы мутация может привести к серьезным структурным изменениям в частности молекул, которые могут окончательно привести к структурным и функциональным неправильного сворачивания расхождения. Например, включение глицина и пролина может нарушить альфа-винтовой вторичной структуры ^21. Во-вторых, высокие цены нуклеотидных мутаций увеличить шансы на включение преждевременного стоп-кодона, в результате усеченный молекул, которые являются биологически неактивными. В целом, снижение ставок мутации являются предпочтительными, поскольку нижние частоты появления ошибок в результате АккумуляторыATION адаптивных мутаций в то время как более высокие темпы мутаций создания нейтральной или вредных мутаций ^22.

Для каждого раунда случайного мутагенеза, еще одна важная переменная, что надо оптимизировать включает в себя температуру инкубации использованы в процессе скрининга. Выбор экспериментальных без разрешительных температура относительно сложной задачей. Мы изначально использовали температуру инкубации, которая была 10 ° C выше, чем без разрешительных температура PlyC, однако после скрининга 3000 мутантами, мы не смогли выявить любые выгодные мутации. Имея в виду, направленная эволюция методологии состоит из последовательного выявления полезных аминокислотных замен, которые имеют аддитивный эффект, было установлено, что менее строгие температура должна быть использована в процессе скрининга, даже если она увеличилась вероятность генерации ложных срабатываний. Таким образом, мы использовали температуру инкубации, который был всего на несколько градусов выше, не допустIve температуры и повторный скрининг отобранных кандидатов для исключения ложных срабатываний.

Мы решили использовать температуру инкубации который не был слишком умеренным (≤ 1 ° C выше, чем низкие, не разрешительный температуры) и, наоборот, не слишком жесткие (≥ 5 ° C выше, чем низкие, не разрешительный температуры). Идеальная температура мы решили использовать в данном анализе была умеренной 2 ° C выше, чем экспериментально определяется не-допустимой температуре. Выбор температуры, которая является слишком мягким приведет к гораздо более высокий процент ложных срабатываний идентификации, чем ~ 20% наблюдалось (табл. I) при использовании умеренной температуры инкубации. Кроме того, использование температуры инкубации, которая является слишком суровым в конечном счете может привести к невозможности определить мутантов со значительно повышенной термической поведения. Например, с помощью инкубации температура ≥ 5 ° C привело бы к невозможности определитьперспективные 29C3 мутант, а также большинство других кандидатов, отобранных в первом туре отбора.

Подводя итог, мы предоставляем протокол для инженерных бактериолитических ферментов приобрести расширенные кинетической стабильности. Кроме того, этот же анализ, без отопления шаги, может быть использована для выявления мутаций, которые увеличивают каталитическую активность. Дополняя как каталитическая активность и термостабильность является важным препятствием развития, стоящих перед любым терапевтическим фермента. Хотя детали этого протокола являются специфическими для лейкин PlyC, методика может быть адаптирована к любым бактериолитический фермента только с несколькими изменениями. Мы представили предварительные результаты только первого раунда мутагенеза, который подтверждает, что функциональные возможности анализа, в результате реализации и идентификации мутаций, которые генерируют увеличение молекулярной термостабильность значительной величины.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
B-PER II бактериального реагента Добыча белки	Thermo Scientific	78260
GeneMorph II Kit Случайный мутагенез	Agilent Technologies	200500
Очистить 96 лунок с плоским дном Микротитровальные пластины с крышкой	BD Vacutainer Лабораторное оборудование Медицинское	353072
96 лунок Nonskirted ПЦР Планшеты	Fisher Scientific	14-230-232
Свинг-Ковш ротора	Eppendorf	A-2-DWP
Ампициллина натриевую соль	Fisher Scientific	BP1760
Хлорамфеникол	Fisher Scientific	BP904
Арабиноза	Fisher Scientific	BP2504
pBAD24 Выражение векторного	ATCC	87399
pBAD33 Выражение векторного	ATCC	87402