Визуализация бактериальный токсин индуцированные ответы с помощью флуоресцентной микроскопии Онлайн сотовых

Summary

Методы очистки холестерина обязательного токсина стрептолизин O из рекомбинантных E. палочки И визуализации связывания токсинов жить эукариотических клеток описаны. Локализованные доставки токсин вызывает быстрые и сложные изменения в целевые клетки раскрывая новые аспекты токсина биологии.

Abstract

Бактериальные токсины связываются с холестерином в мембране, образуя поры, которые позволяют утечка клеточного содержимого и притоком материалов из внешней среды. Клетка может либо выйти из этой оскорбление, которое требует активных процессов ремонта мембран, либо умирают в зависимости от количества воздействия токсинов и клетки ^1-го типа. Кроме того, эти токсины вызывают сильную воспалительную реакцию в зараженных хостов через активацию иммунных клеток, включая макрофаги, которые производят множество провоспалительных цитокинов ^2. Многие грамположительных бактерий производить холестерин обязательным токсины, которые, как было показано, способствует их вирулентность в значительной степени через неохарактеризованных механизмов.

Морфологические изменения в плазматической мембране клетки подвергаются воздействию этих токсинов включают их поглощение холестерина в обогащенной поверхности выступов, которые могут быть пролита в межклеточное пространство, что предполагает внутреннюю клеточную защитуМеханизм ^3,4. Этот процесс происходит во всех клетках в отсутствие метаболической активностью и могут быть визуализированы с помощью EM после химической ⁴ фиксации. В иммунных клеток, таких как макрофаги, которые опосредуют воспаление в ответ на воздействие токсинов, индуцированные мембранных везикул предложили, чтобы содержать цитокины IL-1 семья и может быть ответственность как за сброс токсинов и распространения этих провоспалительных цитокинов ^5,6,7. Связь между IL-1β выпуска и определенный тип гибели клеток, называемых pyroptosis была предложена, так как являются каспазы-1 зависимых процессов ^8. Чтобы разобраться в сложностях этого макрофагов ответ, который включает в себя токсины обязательным, упав на мембранных везикул, высвобождение цитокинов и, возможно, гибели клеток, мы разработали методы маркировки и флуоресцентной микроскопии, которые позволяют визуализации реального времени токсина межклеточных взаимодействий, в том числе Измерения дисфункции и смерти (рис. 1). Использоватьиз живых клеток необходимо в связи с ограничениями в других методов. Биохимические подходы не могут решить эффектов, происходящих в отдельных клетках, в то время проточной цитометрии не предлагает высокое разрешение, визуализации в реальном времени отдельных клеток. Методы, описанные здесь, могут быть применены к кинетического анализа ответов индуцированных другие стимулы включают в себя сложные фенотипические изменения в клетках.

Protocol

1. Очистка стрептолизина O (SLO)

1. Инокулировать 20 мл ночной культуры BL21 ЗОЛОТО клеток, содержащих pBADgIII-SLOhis плазмиды ⁹ в 0,5 бульоне LB L и добавить 500 мкл 50 мг / мл ампициллина. Встряхнуть культуры на 225 оборотов в минуту при 37 ° С до OD ₆₀₀ = 0,6, как правило, ~ 1,5 часа. Центрифуга 1 мл бактерий (считается T ₀₎ при 10000 XG 5 мин, растворить осадок в 140 мкл 1x SDS буфера для образцов / 1 OD и разрушать ультразвуком сдвига ДНК для анализа белков чистоты.
2. Вызвать бактерий с добавлением 5 мл 20% арабинозы к культуре, трясти при 225 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 3 часов. Сбор 1 ....

Results

Обычно 10 ⁷ -10 ⁸ ед / мл SLO может быть получена с белком концентрации 4 мг / мл. Количество токсина необходимых для лизиса клеток меняется в зависимости от типа клеток, но, как правило, 125-500 ЕД / мл SLO (рис. 2В). Сотовый типов, таких как макрофаги могут быть более устойчивыми (4000 ЕД / мл), хотя другие (особенно Т клеточных линий) являются более чувствительными. Эти чувства соотносятся с коммерчески доступными SLO. Токсин активность снижается примерно в 2 раза с каждой замор.......

Discussion

Описанные здесь методы позволяют рассмотрении реакции иммунных клеток к бактериальным токсинам. Самым важным шагом является обработка и дозировки токсина. Токсин деятельности может быть чрезвычайно разнообразен, даже между различными аликвоты того же препарата, из-за его хрупкости. Это требует либо тестирования каждой аликвоты токсин против линии ссылкой на ячейку или эритроцитов или с использованием токсинов градиентов. Токсин градиенты, сданным микропипетки, позволяют полный спектр токсина видах деятельности, которые .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Ni-NTA агарозы	Qiagen	30210
полимиксина-агарозы	Сигма	P1411-5мл
Zeba опреснения Спин коллег	Рыбак	PI-89891
овец эритроцитов	Рыбак	50-415-688
pBADgIII-SLO	N / A	N / A	см. ссылку 9
Cy5 monoreactive красителя	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM / Ethidium гомодимером	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
коллагена покрытые прозрачным дном блюдо	Маттек	P35GCol-1.5-10-C
фемто-наконечник II	Рыбак	E5242957000
Microloader	Рыбак	E5242956003
декстран Alexa 555	Life Technologies	D34679
InjectMan NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Таблица 1. Список и источником специфических реагентов и ОснасткаЛОР необходимости. Специальное оборудование и реагенты, используемые в настоящем протоколе, вместе с компанией и каталожный номер в списке.
			Буфер Состав Шаг Б Lyse / Уош 50 мМ NaH 2 PO 4 300 мМ NaCl 10 мМ имидазола, рН 8,0 1,4 Tris / соли 50 мМ Трис, рН 8,0 300 мМ NaCl 1,7 Элюции буфером 50 мМ Трис, рН 8,0 300 мМ NaCl 250 мМ имидазола 1,8 РБК Аналитический буфер 0,3% BSA 2 мМ CaCl 2 10 мМ HEPES, рН 7,4 2,1 Буфер R / B RPMI культуре клеток среде 2 мМ CaCl 2 0,5% BSA 3,1
			Таблица 2. Список буферов, используемых в этом протоколе. Буферов, используемых, их состав и первым шагом на которых они используются в протоколе перечислены.