Методическая статья

Преодоление Био-Электронный интерфейс с Biofabrication

DOI:

10.3791/4231

⸱

6 июня 2012 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland , 2Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland , 3Department of Materials Science and Engineering, University of Maryland

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается biofabrication подход: осаждение стимулов проблематику полисахариды в присутствии предвзято электродов для создания биосовместимых фильмов, которые могут быть функциональными клетками или белками. Мы показываем, настольные стратегии для создания фильмов, а также их основных применений для создания интерактивных biofunctionalized поверхности для лабораторий-на-чипе приложений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Достижения в технологии лабораторий на чипе обещают произвести революцию как в исследованиях, так и в медицине за счет снижения затрат, повышения чувствительности, портативности и производительности. Включение биологических компонентов в биологические микроэлектромеханические системы (биоМЭМС) показало большой потенциал для достижения этих целей. Микроизготовленные электронные чипы позволяют использовать микрометровые функции, а также электрическое соединение для измерения и срабатывания. Функциональные биологические компоненты дают системе возможность специфического обнаружения аналитов, ферментативных функций и возможностей всей клетки. Стандартные процессы микропроизводства и биоаналитические методы успешно используются в течение десятилетий в компьютерной и биологической промышленности соответственно. Однако их комбинация и взаимодействие в среде «лаборатория на чипе» порождает новые проблемы. Существует потребность в методах, которые могут создать интерфейс между электродом и биологическим компонентом, который является мягким и простым в изготовлении и моделировании.

Biofabrication, описанный здесь, является одним из таких подходов, который показал большие перспективы благодаря простому в сборке включению биологических компонентов с универсальностью встроенных функций. В биопроизводстве используются биологические материалы и биологические механизмы (самосборка, ферментативная сборка) для восходящей иерархической сборки. В то время как наши лаборатории продемонстрировали эти концепции во многих форматах 1,2,3, здесь мы демонстрируем процесс сборки на основе электроосаждения с последующим многократным применением взаимодействий на основе сигналов. Процесс сборки состоит из электронанесения биосовместимых полимерных пленок, реагирующих на стимулы, на электроды и их последующей функционализации биологическими компонентами, такими как ДНК, ферменты или живые клетки 4,5. Электроосаждение использует градиент pH, создаваемый на поверхности смещенного электрода в результате электролиза воды 6,7,. Хитозан и альгинат являются чувствительными к стимулам биологическими полимерами, которые могут самособираться в гидрогелевые пленки в ответ на наложенные электрические сигналы. Толщина этих гидрогелей определяется степенью, в которой градиент pH распространяется от электрода. Это может быть изменено с использованием различных плотностей тока и времени осаждения 6,7. В этом протоколе будет описано, как пленки хитозана осаждаются и функционализируются путем ковалентного присоединения биологических компонентов к обильным первичным аминогруппам, присутствующим на пленке, с помощью ферментативных или электрохимических методов 9,10. Также будут рассмотрены пленки альгината и их захват живых клеток 11. Наконец, полезность биопроизводства демонстрируется на примерах взаимодействия на основе сигналов, включая передачу сигналов от химического к электрическому, межклеточному, а также передачу сигнала от фермента к клетке.

Как электроосаждение, так и функционализация могут быть выполнены в условиях, близких к физиологическим, без необходимости использования реагентов и, таким образом, избавить лабильные биологические компоненты от суровых условий. Кроме того, как хитозан, так и альгинат уже давно используются в биологически значимых целях 12,13. В целом, биофабрикация, быстрый метод, который может быть просто выполнен на настольном столе, может быть использован для создания узоров функциональных биологических компонентов в микронном масштабе на электродах и может быть использован для различных применений в лабораториях на чипе.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Альгинат Электроосаждение

  1. Подключите блок питания к пользовательским сфабриковано электродов через патч-корды использованием крокодил. Оксид индия и олова (ITO), покрытых стекло будет действовать в качестве анода (рабочий электрод) и платиновой фольги будет служить в качестве катода (контр-электрод). Расположите электроды таким образом, поверхность ITO быть функциональными против счетчик электрода и позиционируется как вертикально погружается в раствор или горизонтально, что отложение решения, содержащиеся на поверхности.
  2. Подготовить решение альгинат осаждения путем смешивания 1% альгината и 0,5% CaCO 3 (по весу) в дистиллированной воде, а затем автоклавирования решения. Рекомендуется постоянно перемешивать раствор, когда он не используется.
  3. Погрузитесь в обоих электродах осаждения раствора. Альгинат может быть использован флуоресцентно меченные флуоросфер (Invitrogen), в соответствии с Cheng и соавт. 14, для обеспечения fluorescenсе визуализации полученной пленки.
  4. Применение постоянного тока (3 / м 2) в течение 2 минут, напряжение перейдет в пределах 2-3 В.
  5. Отсоедините электроды и удалить без хранение решение. Аккуратно промойте пленку с NaCl (0,145 м), чтобы удалить лишние альгината.
  6. Инкубируйте фильме кратко (~ 1 мин) в CaCl 2 (0,1 М) в целях укрепления геля. Полоскание с NaCl (0,145 М) и инкубировать в искомое решение дополнить CaCl 2 (1 мм).
  7. Изображения с помощью флуоресцентного микроскопа (рис. 1б).

2. Соосаждения Общение клеточных популяций альгинат

  1. Сигнал отправителя культуре клеток (W3110 вес E.coli), выращенных в LB средствах массовой информации, и сигнал приемника культуре клеток (MDAI2 + pCT6-LSRR - усилитель г + ПЭТ-DsRed - кан г), выращенных в средствах массовой информации LB + 50 мкг / мл каждого из канамицин и ампициллин, должны быть выращены на ночья повторно привиты для роста оптической плотности (600 нм) 1. Настройка оптической плотности культуры клеток приемника 0,4-0,6 с LB перед использованием.
  2. Подготовить осаждения 2% раствора альгината и 1% CaCO 3, и смешать с каждой культуре клеток в соотношении 1:1 до конечной концентрации 1% альгината, 0,5% CaCO 3, с клетками разводят до плотности около половины культивирования плотность.
  3. Используйте стекло с узором двумя электродами ITO содержится полидиметилсилоксана (PDMS) и (подготовлен в соответствии с инструкциями Sylgard и сократить до нужного размера) и платиновый электрод счетчика. Подключите один ITO электродов к источнику питания с платиной, как описано в процедуре 1 (альгинат электроосаждения).
  4. Погрузите электроды в осаждения раствора, содержащего приемник клеток. Установите блок питания постоянного тока при плотности 3 / м 2, где размер площади определяется один электрод, на котором depositioя не произойдет.
  5. Применить текущие в течение 2 минут, чтобы обеспечить соосаждения клеток в матрице альгината.
  6. Промойте фильм, как описано в шаге 1.5.
  7. Включите анодной связи на второй, соседний, ITO электродов.
  8. Повторите процедуру отложения (шаги 2.4 - 2.7), но на этот раз введение раствора, содержащего отправителя клеток.
  9. Инкубировать 2-электрод чип содержащие codeposited клеток и кальция альгинат ночи при 37 ° C в фосфатном буферном растворе (PBS) с добавлением 10% LB СМИ и 1 мМ CaCl 2.
  10. После инкубации изображения с помощью флуоресцентного микроскопа (рис. 2В).

3. Хитозан Электроосаждение

  1. Подключите блок питания к электродам через крокодил. Золото покрытием кремниевый чип будет выступать в качестве катода (рабочий электрод) и платиновой фольги будет служить в качестве анода (контр-электрод). Установите поверхности золотого электрода, таким йна него против счетчик электрода и как расположены вертикально, чтобы быть погружают в раствор или горизонтально, что отложение решения, содержащиеся на поверхности.
  2. Приготовьте раствор хитозана путем смешивания хитозана хлопья в воду и медленно добавляя 2 М HCl для растворения полисахаридов (окончательное рН 5,6), убедившись, что следовать процедуре, описанной Мейером и соавт. 15.
  3. Установите электроды в раствор хитозана (0,8%), полностью погружая нужную область для нанесения. Хитозан используемых можно флуоресцентно меченных с 5 - (а-6)-carboxyrhodamine 6G сукцинимидил эфира (Invitrogen), а на Ву и др. 8, изображение электроосажденных фильм флуоресцентной микроскопии..
  4. Применение постоянного тока (4 / м 2) в течение 2 минут. Напряжение будет смещаться в пределах 2-3 В. Расчет плотности тока в зависимости от золотой поверхности рабочего электрода подвергаются depositioл раствора.
  5. Промойте электрод деионизированной водой, чтобы удалить лишние хитозана. Чип может быть сохранен в воде или PBS (10 мМ, рН 7,0).
  6. Изображения с помощью флуоресцентного микроскопа (рис. 3).

4. Электрохимический трансдукция с функционализированных фильм Хитозан

  1. Codeposit хитозана и глюкозооксидазы (GOX) из раствора (1% хитозана, 680 ед / мл GOX, рН 5,6) при плотности тока 4 А / м 2 на узорной электрода в соответствии с процедурой 3 (Хитозан электроосаждения). Фильм хитозана в ловушке GOX будет.
  2. Прикрепите лечение электрода трех электродной системы в качестве рабочего электрода, платиновой проволоки в качестве контр-электрода и Ag / AgCl в качестве электрода, как показано на рис 4А.
  3. Погрузите электроды в раствор фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0), содержащем NaCl (0,1 М).
  4. Электрохимически сопряженных белка хитозанаФильм, применяя постоянное напряжение (0,9 В) для использования 60-х годов chronoamperometry 10.
  5. Поместите фишки в фосфатный буфер (0,1 М, рН 7,0), а также мыть в течение 10 минут на орбитальный шейкер для удаления непрореагировавшего NaCl и неконъюгированного GOX.
  6. Повторно приложить к трех-электродной системы, как описано в пункте 4.2 и погружают в раствор 5 мМ глюкозы. Использование циклической вольтамперометрии, подметать потенциала в положительном направлении до 0,7 В. Использование контроль фильм, не содержащий глюкозооксидазы для сравнения на сумму окисления видно развертки (рис. 4В).
  7. Удалите электроды из раствора глюкозы и промыть фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0), а затем поместить электроды в 10 мл стакан, содержащий 8 мл фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0). Смещение GOX-функциональными чипа до 0,6 V в качестве рабочего электрода (рис. 4С).
  8. Добавить порции глюкозы в буфер (каждую аликвоту повышает концентрацию глюкозы на4 мм).
  9. Создание стандартной кривой между устойчивым состоянием и концентрации глюкозы в GOX-функциональными фильм хитозана.

5. Белки Функционализация помощью ферментативного Ассамблеи

  1. Используйте стекло с узором золота и смежных ITO электродов, содержащихся в так PDMS. Смещение золотого электрода с катодным потенциалом электролитическое хитозана как было показано ранее. Промыть фильма кратко DI водой, а затем PBS помощью пипетки.
  2. Добавить раствор 3 мкм синий флуоресцентно с надписью "АИ-2-синтазы" 16 (с использованием DyLight комплект этикеток) + 100 ЕД / мл тирозиназы в PBS.
  3. Выдержите в течение 1 часа при комнатной температуре, затем смыть пленку с PBS.
  4. Применить анодного потенциала на электрод ITO в codeposit решение альгинат осаждения содержащие приемник клеток (подготовленный с шагом 2.1-2.2). Выполните шаги 2.3-2.6 процедуры 2 (соосаждения клеточных популяций в альгинат).
  5. Для созданияпередаваемого сигнала (АИ-2) ферментативно после промывки фильмы добавить раствор 500 мкМ S-аденозил гомоцистеина (САК) в PBS, с добавлением 10% LB СМИ и 1 мМ CaCl 2. Накройте электроды для предотвращения испарения раствора и инкубировать в течение ночи при температуре 37 ° C. Это позволит клеточного ответа приемник, создавая красный флуоресцентный белок (DsRed).
  6. Прилегающие электроды могут быть отображены с флуоресцентной микроскопии, настраивая фильтры, чтобы захватить голубой флуоресценции АИ-2-синтазы и красной флуоресценции выраженные codeposited приемник клеток (рис. 5В).

6. Представитель Результаты

Налагаемого электрических сигналов могут создавать локализованные микросреды (например, полей и градиентов) вблизи поверхности электрода, и эти стимулы могут вызвать самосборки полисахариды, такие как альгината и хитозана внести в гидрогель пленки на поверхности электрода. Поскольку тего золь-гель-переход происходит на поверхности электрода, в результате фильм electroaddressed, с его геометрией соответствующий шаблон электрод (рис. 1В, 3C). Биосовместимых таких фильмах, как альгината и хитозана обеспечивают поверхностей, которые могут быть функциональными с биологическими компонентами. Использование альгината, уникальные клеточные популяции были codeposited на отдельных адресов. Доказательства их electroaddressment наблюдается при взаимодействии между отправителем и приемником населения клетке. Молекула аутоиндуктор-2 (АИ-2) диффундирует от отправителя клеток и поглощается приемником клеток, что приводит к выражению DsRed красный флуоресцентный белок (рис. 2A). На рисунке 2B, красная флуоресценция наблюдается только на электроде, где приемники рассматриваются.

Аминогрупп хитозана присутствует на обеспечить ее рН реакции, необходимые для электроосаждения, а также поверхность, подходящую для функционализации. Мыиспользовать эти уникальные свойства электрохимически сопряжения биодатчиков фермента глюкозо-оксидаза (GOX) для электролитического хитозана фильмов. Этот фермент затем предоставляет возможность для определения глюкозы через ферментативной реакции (рис. 4а) производит пероксид водорода, который затем может быть электрохимически окисляется до получения выходного тока. Таким образом, химический сигнал может быть трансдуцированных к электрическим. Рисунок 4B показывает, что фильмы, в которых GOX было электрохимически сопряженные производства анодной сильный сигнал в присутствии глюкозы в отличие от тех фильмов, не содержащих GOX. Эти результаты показывают, GOX могут быть собраны на хранение фильм хитозана и сохраняет каталитическую активность. Кроме того, рисунок 4C показывает, шаг увеличения анодного тока, в ответ на повышение концентрации глюкозы в крови. Калибровочной кривой также присутствует на рисунке 4C показывает, что шаг увеличения проходили в ближайшее линейного ФАСХион зависит от количества глюкозы добавил. Эти результаты показывают, что фермент также сохраняет свою чувствительность к повышению концентрации глюкозы на сопряжении к фильму хитозана. Нижний предел обнаружения не изучалось здесь, как это ранее было характерно для этой системы в работе Мейера и др.. др..

Мы также продемонстрировали ковалентной иммобилизации ферментов интерес, спроектирован, чтобы содержать пользовательские пента-тирозин тег, чтобы хитозана в ферментативно-контролем. В частности, этот процесс при посредничестве фермента тирозиназы. Как показано на схеме на рис 5А (верхний), фермент, АИ-2-синтазы включает пяти-тирозин тегов. Тирозиназа действует на тирозин тег, окисляющие фенольные группы остатков "О-хинонов, которые затем ковалентно связываться с аминами хитозана в. Свидетельство хитозана фильм функционализации с АИ-2-синтазы тирозиназой сборки наблюдается на рис 5B (рис. 5А (ниже)). Красная флуоресценция приемник клеток (рис. 5В) в очередной раз демонстрирует взаимодействие между адресами в связи с распространением АИ-2 с одного на другой, и далее указывает, что ферменты, иммобилизованные на хитозана сохраняют активность раз ковалентно связаны.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Альгинат электроосаждения. (А) механизм электроосаждения альгината: как электрод анодно предвзятым, электролиз воды происходит на ее поверхности, создавая локализованные низкий рН. Частиц карбоната кальция реагирует с избыткомпротонов, выпустив катионов кальция, как частицы растворяются. При наличии цепи полимера альгинат, ионы в хелатной "eggbox" сеть, образуя сшитый гидрогель на электроде. По мере удаления от электрода увеличивается, альгинат имеет большую тенденцию оставаться в растворе за счет снижения присутствии ионов кальция. (B) L-формы рисунком ITO электродов была использована для электролитическое альгината. PDMS и был зафиксирован на электрод содержит зеленый флуоресцентно-меченных альгината (1%) и CaCO 3 (0,5%) осаждения раствора. После электроосаждения в течение 2 мин. при плотности тока 3А / м 2, electroaddressed гидрогель альгинат удалось сфотографировать с помощью флуоресцентной микроскопии.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Соосаждения клеточных популяций. (А) Схема показывает взаимодействие между двумя E. палочки штамма: один население производит аутоиндуктор-2 (АИ-2), Сигнальную молекулу, и называется "АИ-2 отправителя". Остальным населением, называют "АИ-2 приемника", корреспондент АИ-2, после получения АИ-2 за счет диффузии из отправителя, она выражает красный флуоресцентный белок DsRed. (Б) красный флуоресценции изображение пары электродов с АИ-2 Отправитель населения codeposited с альгинат на левом электроде и АИ-2 приемника населения codeposited с альгинат на правом электроде. Увеличенный вид демонстрирует DsRed выражение только АИ-2 приемника.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Хитозан электроосаждения. (А) Схема показывает зависит от рН электроосаждения хитозана. Электролиз воды в катодной предвзято электрода приводит к локализованным высоких значениях рН (показано локализованное изменение цвета красителя рН индикатор вблизи катода в микрофотография), который стимулирует золь-гель перехода хитозана в этом регионе. (B) амины представить на хитозана дают рН проблематику свойствами. Над рН 6.3 (рКа хитозана) амины депротонированного, способствуя переходу от его протонированных растворимой формы в нерастворимую форму ее гелем. (C) узорной золотой электрод был использован для электролитическое хитозана. Электрод, соединенный с катодной питания, была погружена в зеленый флуоресцентно-меченого хитозана (0,8%) осаждения раствора. После электроосаждения в течение 2 мин. при плотности тока 4 А / м 2, electroaddressed фильм хитозана удалось сфотографировать с помощью флуоресцентной микроскопии.

figure-protocol-4
Рисунок 4. Электрохимический трансдукции с функциональными фильм хитозана. (А) Схематическое изображение установка из трех электродной системы. Функционализированных фильм хитозана служит в качестве рабочего электрода, платиновой проволоки, как счетчик электрода и Ag / AgCl в качестве электрода сравнения. Электрохимический трансдукции глюкозы проходит через йэлектронной ферментативных и электрохимических реакций показал, где производится перекись водорода может окисляться и обнаружил на рабочем электроде. (B) Циклические voltammagram (CV) на электрод с фильмом хитозана содержащие электрохимически сопряженных глюкозооксидазы (GOX) показывает сильный анодного сигнала в 5 мМ раствора глюкозы. Фильм, не содержащих GOX служила контролем и не проявляли сигнал в том же растворе. (C) между стандартной кривой анодного тока и концентрации глюкозы выводится почти линейная зависимость (каждую аликвоту увеличить концентрацию глюкозы на 4 мм, а также увеличение амплитуды тока на вставке в графе поэтапно).

figure-protocol-5
Рисунок 5. Белки функционализации использованием ферментативных сборки. (А, верхние) Схема показывает тирозин-тегом "АИ-2-синтазы" быть ковалентно привязанными к фильму хитозана сборки тирозиназы. Тирозину стали оксидized О-хинонов тирозиназой действия и может реагировать с аминогруппами на пленке хитозана, образуя ковалентную связь. (A, ниже) АИ-2-синтазы генерирует АИ-2 с подложкой (САК), приемник клетки сообщают созданные АИ-2, DsRed флуоресценции выражения. (B) Флуоресцентные изображения, показывающие фильм хитозана на золото, функциональными с голубой этикеткой АИ-2-синтазы. Смежно, АИ-2 клеток приемника codeposited с альгинат на ИТО. После добавления субстрата ферментативной к колодцу и инкубации, АИ-2 клеток приемник выражают DsRed.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наши процедуры демонстрируют электроосаждения и функционализации биополимер фильмов, и этот процесс мы называем biofabrication. Через функционализации с клетки и биомолекул мы создаем биологических поверхностях, способных взаимодействовать друг с другом и электродом, к которому они собираются на. Первый шаг, электроосаждение, происходит через вызвало самоорганизации биополимеров, альгината и хитозана в наших исследованиях, в ответ на электрический сигнал. Как уже говорилось ранее градиент рН создается которой можно управлять с помощью плотности тока осаждения и времени, обеспечивая дополнительный контроль за фильм размеры и свойства 6,17. Мы обнаружили, что различные плотности тока и времени осаждения комбинации могут быть использованы для электродов, указанных в таблице 1. При использовании других электродов возможно, изменения в процедуру будет необходимо. По сравнению с другими методами образования пленки в процессе electrodeposiТион простой, быстрый и безреагентной. Существует нет необходимости в обширный репертуар дорогостоящего оборудования и кропотливая подготовка. Важно отметить, что этот процесс может выдерживать незначительные отклонения экспериментальных и может быть легко началась более в случае возникновения проблем.

Хитозан способна реагировать на высоком катодной градиент рН в связи с важными функциональными свойствами присвоил ему высокое содержание первичных аминов. При высоком рН (больше, чем его рКа ~ 6.3) амины депротонированного и хитозан становится нерастворимым, что позволяет пленки. После осаждения, фильмы будут оставаться прикрепленной к электроду. Тем не менее, существует возможность расслаиваться их желанию. Фильмы будут оставаться стабильными до тех пор, как рН раствора не опускается ниже рКа. Кислотные растворы протонировать аминов и последующего электростатического отталкивания набухают гель до полного его растворения 18. То есть, сборка / разборка процесс является обратимым по требованию и аллоWS для удаления пленок и повторное использование электродов. Удобно, рН, при которой золь-гель-переход происходит близка к той, в которой большинство биологических компонентов функционировать оптимально. Это делает процесс идеально подходит для сохранения функциональности во время сборки 6.

Формирование альгинат фильм способствует анодного электролиза воды, а также наличие карбоната кальция 7. Локализованных низким рН на аноде растворяется карбонат кальция приводит к катионов кальция релизе. Эти ионы в хелатной форме альгинат, образуя сшитые сети на поверхности электрода. Альгинат фильмов заметно обратимой конкуренции для ионов кальция из других соединений, хелатирующих, такие как цитрат или EDTA, который может быть использован для растворения пленок, позволяет повторное использование основных электродов. Таким образом, альгинат фильмов относительно хрупким при воздействии на физиологические условия, потому что ионы кальция легко сcavenged из геля матрицу, ослабляя его структуру и развитие фильм отслоения или повторное растворение. Чтобы преодолеть это ограничение, мы включили инкубации для фильма в 1 М CaCl 2 для укрепления геля. Кроме того, мы рекомендуем инкубации решение фильма (ячейка СМИ и т.д.) дополнить CaCl 2 в концентрации 500 мкМ, 3 мм.

Вторая основная процедура функционализации осажденной пленки с соответствующими биологическими компонентами. Это может быть достигнуто двумя способами, первый из которых электрохимического сопряжения, стратегия, которая позволяет быстро, безреагентной сборки белков с исключительным пространственным управления 10. Тем не менее, функционализации таким образом, ограничивается распространение Cl - ионов через пленку к электроду, а также распространение HOCl, созданных реактивных промежуточных обратно в раствор. Способность электрохимически активных молекул пройтичерез пленку позволяет трансдукции химических и биологических сигналов в легкой для чтения электрических сигналов 15. Мы показали, тирозиназы-опосредованной связи в качестве второй стратегии фермент функционализации в хитозан, свидетельствует ковалентного присоединения АИ-2-синтазы. Такая стратегия позволяет функционализации, чтобы процесс был контролируемым и селективные - в зависимости от конкретного реагента, тирозиназы, который действует избирательно на белки, содержащие тирозин теги 9.

Мы покажем, полезность и биосовместимость многоадресной систем репликации природных путей на чипе. Сначала мы организовали две клеточные популяции (например, "отправителей" и "приемников") в различные адреса, и показал, что они взаимодействуют между соседними электродами доставить АИ-2 и создания флуоресценции ответ. Эта концепция также была продемонстрирована Cheng и соавт. в микрожидком 14 чипов. Мы также имитировал взаимодействия, но вместо этого использоватьфермента синтеза АИ-2 для доставки. Таким образом, синтетические внутриклеточные пути, АИ-2 синтеза, была воспроизведена через biofabrication и действовал, сколько это будет в растворе.

В обоих случаях, сборка нескольких адресов представляет задача предотвращения неспецифического связывания между адресами, потому что каждое отложение решения должны быть внесены в весь массив электродов, хотя электроосаждения предназначена только по одному адресу. Нежные еще тщательной промывки можно удалить большинство остаточных решение от не-предвзятым электродов, использование потоков в микрофлюидных каналов может также свести к минимуму не-специфичность. В частности, для соседней biofabrication хитозана и альгината адресов, мы рекомендуем сдачи фильма хитозана во-первых, после этого с biofunctionalization шаги, и после этого гальванопокрытию альгината. Хотя мы еще не сделали этого здесь, мы обнаружили, что блокирование фильм хитозана с инертными белками (например, милк, BSA, и т.д.) значительно снижает неспецифического связывания нежелательных молекул аминированию поверхности хитозана в.

Мы нашли утилиту в создании узорной электродов, часто встречается в устройствах bioMEMS, как к «проекту» для комплекса расположение клеток и биомолекул. Использования хитозана в электроосажденных bioMEMS устройств выходит далеко за рамки примеры, приведенные здесь 19. Хитозан может быть нанесен на различные микромасштабной геометрии - например, в микроканалов и на не плоских поверхностей 20,15. Фильмы также могут быть изменены с другими полимерами и разнообразные белки, ДНК, наночастицы, и редокс-активных молекул на новые свойства 21,22,23. В устройствах bioMEMS, хитозан фильмов были использованы для доставки лекарств, окислительно-восстановительные и малые молекулы обнаружения, биокатализа и клеточной исследования 20,23,24,25. Кроме того, альгинат широко используется в качестве клеточного захвата и матрица была изучена для обратимых жидкостный сдерживанияклеточных популяций и в фильме иммуноанализа 26,27,28. Композитные пленки для применения тканевой инженерии были изготовлены на основе альгината электроосаждения с компонентами, такими как гидроксиапатит для ортопедических имплантатов 29.

В нашей демонстрации biofabrication, мы показали, как взаимодействие между биологическими компонентами и всей биологической электронный интерфейс, в равной степени применимо, это ставит под достичь перспективы интеграции всех разновидностей взаимодействия для работы в сложных на-чипе передачи сигнала. Соответственно, biofabrication может способствовать производству устройств с пониженным "минимальных размеров функцию" как прямое последующих на быстрое развитие микротехнологий, как это часто мотивировано потребительской электроники. То есть, рядом устройств следующего поколения может на самом деле включают лабильных биологических компонентов, которые предлагают изысканное собрание природы и признание возможности на еще меньшую длину SCAле, чем техногенных систем. Мы предполагаем, ближайшее применение в аналитической аппаратуры, экологических датчиков, и даже биосовместимых имплантируемых устройств.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Производство и свободного доступа к этой статье под эгидой обороны США Агентство по уменьшению угрозы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признаем, финансирование из DTRA для поддержки этой рукописи и с ОНР, DTRA и NSF для частичной поддержке базовых исследований.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Имя компонента Компания Номер по каталогу
Источник питания Keithley SourceMeter 2400
Три электрода потенциостате CH инструменты Потенциостате / Galvanostat 600D
RE-5B Ag / AgCl электрода сравнения Гибкий соединитель Basi MF-2052
Золотое покрытие пластин кремния, 500um Si, 12nM Cr, 120nm Au, SiO 2 для изоляции пользовательские сфабрикованы
Оксида индия и олова покрытые предметное стекло, прямоугольные, 8-12 Ом сопротивление Sigma-Aldrich 578274
Лист Platinum / фольга (0,002 дюйма) Surepure Chemetals 1897
Slim Line 2 "зажимами RadioShack 270-346
Multi-Укладка банан патч-корд Плагин TSElectronic B-36-02
B-24-02
SYLGARD 184 силиконового эластомера комплект Dow Corning NC9020938
С Фишером
Fluorescecence стереомикроскоп Олимп MVX10 MacroView
Стандартный cellSens Олимп Версия 1.3

Таблица 1. Электроосаждение и флуоресценции техники визуализации.

Название реагента Компания Номер по каталогу
Хитозан, со средним молекулярным весом Sigma-Aldrich 448877
Соляная кислота, Aristar. ACS, NF, FCC Класс VWR BDH3030
Гидроксид натрия, раствор. 10.00N VWR VW3247
Альгиновой кислоты, натриевая соль Sigma-Aldrich 180947
Multifex-MM Осажденный
Карбонат кальция, 70-нм частицы 		Специальность
Минералы Инк 		100-3630-3

Таблица 2. Хитозана и альгината реагентов решение.

Название реагента Компания Номер по каталогу
Кальция хлорид, дигидрат JT Baker 0504
Натрия хлорид, сертифицированных
ACS кристаллической 		Фишер
Научный 		S271
Калия фосфат Монокальцийфосфат, безводный Sigma-Aldrich P9791
Калия фосфат двухосновный, безводный Sigma-Aldrich P3786
Фосфатного буфера Sigma-
Aldrich 		P4417

Таблица 3. Другие компоненты решений и буферных реагентов.

Название реагента О компании / Источник Номер по каталогу
Глюкозооксидазы из Aspergillus Нигер Sigma-Aldrich G2133
Тирозиназа из грибов Sigma-Aldrich T3824
LB бульоне, Миллер (гранулированный) Фишер Научные BP9723-2
"AI2-синтазы" (HGLPT) Лаборатория акции 16
W3110 дикого типа клеток Лаборатория акции 30
MDAI2 + pCT6-LSRR - усилитель г + ПЭТ DsRed - кан т клеток Лаборатория акции 30
Флуоросфер: 1 мкм в диаметре, Ex / Em: 505/515 Invitrogen F8765
5 - (а-6)-carboxyrhodamine 6G сукцинимидил эфир, Ex / Em: 525/560 Invitrogen C-6157
DyLight антитела маркировки комплект, 405 Thermo Scientific PI-53020

Таблица 4. Ферменты, клетки и другие реагенты функционализации.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luo, X. In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes. Lab Chip. 10, 59-65 (2010).
  2. Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers. Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).
  3. Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers. Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).
  4. Liu, Y. Biofabrication to build the biology-device interface. Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).
  5. Yang, X., Shi, X. -W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses. Langmuir. 25, 338-344 (2008).
  6. Cheng, Y. In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes. Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).
  7. Cheng, Y. Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate. Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).
  8. Wu, L. -Q. Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template. Langmuir. 19, 519-524 (2003).
  9. Wu, H. C. Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol. bioeng. , 103-231 (2009).
  10. Shi, X. -W. Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals. Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).
  11. Shi, X. -W. Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).
  12. de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells. Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).
  13. Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications. Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).
  14. Cheng, Y. Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling. Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).
  15. Meyer, W. L. Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers. Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).
  16. Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -C., Bentley, W. E. Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria. Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).
  17. Yi, H. Biofabrication with chitosan. Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).
  18. Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. Renewable and Sustainable Polymers. 1063, American Chemical Society. 61-71 (2011).
  19. Koev, S. T. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
  20. Luo, X. Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device. Lab Chip. 8, 420-430 (2008).
  21. Spinks, G. M. A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers. Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).
  22. Yi, H. Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization. Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).
  23. Kim, E. Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes. Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).
  24. Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array. Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).
  25. Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix. Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).
  26. Selimoglu, S. M., Elibol, M. Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells. Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).
  27. Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation. Lab Chip. 5, 553-559 (2005).
  28. Yang, X. In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides. Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).
  29. Cheong, M., Zhitomirsky, I. Electrodeposition of alginic acid and composite films. Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).
  30. Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli. Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BiofabricationElectrodepositionChitosan FilmsAlginate FilmsLab on a ChipBioMEMSFluorescence MicroscopyElectrochemical DetectionSignal TransmissionBiological Components

Похожие статьи