Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Неинвазивная визуализация острого отторжения аллотрансплантата после трансплантации почки крысы Использование

16.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4240

⸱

28 апреля 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine D, Experimental Nephrology, University of Münster, 2Department of Nuclear Medicine, University of Münster, 3European Institute for Molecular Imaging, University of Münster

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы здесь представляем модель крысы почечной трансплантации неинвазивно оценить острого отторжения аллотрансплантата использованием позитронно-эмиссионной томографии с 18F-фтордезоксиглюкоза.

Аннотация

Количество пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности, и количество реципиентов почечного аллотрансплантата непрерывно увеличивается. Эпизодов острого отторжения трансплантата (AR) являются отрицательным прогностическим фактором для долгосрочного выживания аллотрансплантата, и ее своевременная диагностика имеет решающее значение для функции аллотрансплантата 1. В настоящее время AR может быть окончательно диагноз ядро-биопсии, который, как инвазивный метод, обнажает значительный риск трансплантат травмы или даже гибели. Кроме того, биопсия не представляется возможным у пациентов, принимающих антикоагулянты и ограниченном участке выборки этой техники может привести к ложным отрицательным результатам, если AR является координационным или неоднородным. Как следствие, это привело к текущей поиск новых АР методы обнаружения, которые часто должно быть сделано у животных, включая использование различных моделей трансплантации.

С начала 60-х крыс трансплантации почки является хорошо установленным экспериментальным методом ExaminAtion и анализа AR 2. Мы здесь присутствовать в дополнение маленькое животное позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) с использованием 18 F-фтордезоксиглюкоза (ФДГ) для оценки AR в аллогенной uninephrectomized крысиной модели трансплантации почки и предложить трансплантата ФДГ-ПЭТ в качестве новой опции для неинвазивного, конкретные и ранней диагностики AR и для человека ситуации 3. Кроме того, этот метод может быть применен в отношении последующих мер по совершенствованию мониторинга отторжения трансплантата 4.

Протокол

1. Восстановление доноров органов

  1. Настройка стереотаксической микроскопом, записывать вес в возрасте 8-10 недель крысы (донор и веса организм реципиента должны совпадать).
  2. Обезболить крысы-донора (Lewis Коричневый Норвегии F1, LBN F1) с использованием кислорода / изофлуран ингаляции (4% изофлуран / 2 л / мин кислорода). Поддержания анестезии за счет снижения изофлурана до 2-2,5%.
  3. Поместите наркозом крыса на операцию площадку. Исправить конечностей крыс с помощью клейкой ленты на прокладку и применять глазные мази (Bepanthen, Bayer) глаза крысы.
  4. Бритье и дезинфицировать Живот крысы и выполнять вентральный срединный разрез от лобка к каудальной границе печени. Проэкспонируйте левой почки и его сосудов тщательно перемещения кишечника в правой стороне. Место тонкий лист марлей над левой почкой и смочить его с подогреваемой изотонический солевой раствор, чтобы предотвратить высыхание.
  5. Осторожно рассекают жировую ткань с Дюмон Угловой пинцет Tip (SS-Дюмон45 Пинцет медицинский Inox, изобразительных инструментов науки, номер по каталогу 11203-25) обволакивающее левого мочеточника. Избегайте прямого контакта с мочеточника, вместо этого, мобилизовать его достаточными окружающей жировой ткани.
  6. Отделите левой почечной вены от почечной артерии использованием щипцов Дюмон Угловой чаевые. Удалите все жира и соединительной ткани с обеих судов и прижечь надпочечников и яичек сосуды.
  7. Рассеките аорты и нижней полой вены (НПВ) выше и ниже ее слияния с левой почечной артерии и вены, соответственно, и прижигают всех исходящих артерий.
  8. Зажмите надпочечников аорты с микрохирургической зажим (Micro Serrefines, изобразительных инструментов науки, cat.no. 18055-04) над левой почечной артерии, как можно ближе к верхней брыжеечной артерии. Лигировать инфраренальной аорты с использованием хирургических шелка (5-0, Vömel, арт. 14739) примерно на 5 мм ниже левой почечной артерии.
  9. Лигировать инфраренальной IVC с хирургическим шелком (5-0, Vömel) и зажать надпочечников IVCс микрохирургической зажим (Micro Serrefines, изобразительных инструментов науки, cat.no. 18055-03).
  10. Разрежьте почечной вене как можно ближе к нижней полой вене с использованием тонких ножниц (Iris Ножницы - прямые ToughCut 11,5 см, изобразительных инструментов науки, cat.no. 14058-11).
  11. Медленно заливать почки на месте с 2 мл ледяного HTK перфузии раствором (Кустодиол HTK, доктор Франц Келер Chemie), вставляя канюли (27G Microlance 3 ¾, BD, номер по каталогу 302200) в инфраренальной аорты. Убедитесь, что почечные изменения цвета (теперь оливкового оттенка).
  12. Во-первых, секут надпочечников аорты, то инфраренального аорты и, наконец, мочеточник как можно ближе к мочевому пузырю.
  13. Снимите почки и ее сосудистой поставке вместе с мочеточника и хранить в HTK перфузии решение на льду.
  14. Усыпить крысы-донора путем удаления сосудистых зажимов и последовательное удаление сердце под наркозом.

2. Получатель Подготовка и трансплантацииции

  1. Настройка стереотаксической микроскопом, записывать вес крысы.
  2. Обезболить крысы-реципиента (Lewis) изофлураном 4%. Поддержания анестезии за счет снижения изофлурана до 2-2,5%.
  3. Поместите наркозом крыса на операцию площадку. Исправить конечностей крыс с помощью клейкой ленты на прокладку и применять глазные мази с крысой `ы глаз. Мониторинг и контроль температуры тела использованием ректального датчика температуры и потепление площадку. Во время операции повторно контроля температуры, дыхание и сердечный ритм животного.
  4. Бритье и дезинфицировать живота и выполнить вентральный срединный разрез от лобка к каудальной границе печени. Используйте скальпель forcutting кожи для того, чтобы свести к минимуму травмы кожи. Проэкспонируйте левой почки и его сосудов путем перемещения кишечника в правой стороне.
  5. Осторожно снимите капсулу почки использованием щипцов Дюмон Угловой наконечник и ватные тампоны.
  6. Окклюзии левой почечной артерии, вены и мочеточника около почечнойрубчик с двумя лигирований использованием хирургической нити (4-0 Mersilene, Ethicon, кот. нет. EH6732H). Акцизный большей части почки, оставив только почечная рубчик. Очистите поверхность среза ватными тампонами и проверить его на кровотечение. Добавить другой лигатуры при необходимости.
  7. Осторожно рассекают прямо через соединительную ткань, покрывающая инфраренальной аорта и полая вена на хвостовом сайт с ватными тампонами.
  8. Отделите видимых нерва из инфраренальной аорты и полой вены использованием щипцов Дюмон Угловой чаевые.
  9. Осторожно рассекают через соединительную листовой ткани между инфраренального аорты и полой веной, образуя два отверстия 2-4 мм длина: первый ниже разветвления яичек сосудов, а второй через ответвления общих подвздошных сосудов. Прижечь iliolumbar артерии и вены между ними.
  10. Нарисовать одной хирургической нити (Mersilene 0;. Ethicon, кошка no.EH6665E) через каждое из двух отверстий. Используя эти темы тянуть инфраренальнойаорты и полой вены слегка к правой стороне тела животного, чтобы получить доступ к сосудам разветвление на спинной сайта. Cauterize любой из этих сосудов между двумя отверстиями и удалить хирургических нитей после этого.
  11. Затем закрывают аорты и нижней полой вены по часовой стрелке применением микрохирургической четырех зажимов (Micro Serrefines, изобразительных инструментов науки, cat.no. 18055-04) начиная с верхнего отверстия с аортой и заканчивая полой вены в верхнее отверстие (Micro Serrefines , изобразительных инструментов науки, cat.no. 18055-03).
  12. Затем осторожно прокалывают верхний окончание изолированной части аорты с помощью иглы (27G Microlance 3 ¾, BD, номер по каталогу 302200), вставьте нижний нож штрафа ножницами весны (Весна Vannas Ножницы - 3 лезвия мм, Изысканные Инструменты науке, cat.no 15000-00) через прокол открытия и выполнить короткий продольный разрез. Промойте изолированной аорты с льдом раствор HTK перфузии для удаления остатков крови.
  13. Кроме того, тщательно Пирснижний окончание изолированной части полой вены с помощью иглы, вставьте нижний нож штрафа весной ножницами через прокол открытия и выполнить продольный разрез окончание вскоре ниже аортального разрез. Опять же, промойте судна для удаления остатков крови.
  14. Снимите почки трансплантата из раствора для хранения. Поместите его под прежнее положение левой почки, и убедиться, что он правильно ориентирован.
  15. Проверьте ориентацию трансплантатов почечной артерии и убедиться, что нет никаких поворотов. Затем положите тонкий слой марли за взяточничество и смочить его льдом раствор перфузии HTK, чтобы охладить его, а также для предотвращения высыхания.
  16. Fixate открытия надпочечников часть аорты часть, в которой почечной артерии трансплантата открывается в с хирургической нити (Ethilon 9-0, Ethicon, кошка не 2809G.). - Сначала на верхней, то на нижнем конце аорты разрез. Закрыть разрез по часовой стрелке непрерывным швом использованием хирургической нити(Ethilon 9-0), Дюмон Угловой пинцет наконечником и изогнутой иглой Castroviejo держатель (Fine инструментов науки, кот. Нет. 12061-01). Затем покрыть первый шов соединительной тканью против часовой стрелки через вторую непрерывным швом. Теперь, только нижняя часть аорты часть трансплантата остается быть закрыт. Регулярно охлаждения трансплантата с льдом раствор HTK перфузии.
  17. Заливать трансплантата с 1 мл льдом раствору перфузии НТК через тупой иглы, введенной в открытый конец куска трансплантатов аорты проверки герметичности и целостность шва, а также удаление оставшегося крови в трансплантата. После лигирования открытый конец аорты часть с хирургическим шелком (5-0, Vömel).
  18. Проверьте ориентацию трансплантатов почечной вены и убедиться, что нет никаких поворотов.
  19. Fixate открытия вены трансплантата с хирургической нити (Ethilon 9-0) - сначала на верхней, то на нижнем конце разрез на полую вену. Закрыть разрезчасовой стрелки с помощью непрерывного шва использованием хирургической нити (Ethilon 9-0), Дюмон Угловой пинцет Совет и изогнутой иглой Castroviejo держателя. Регулярно охлаждения трансплантата с льдом раствор HTK перфузии.
  20. Против удаления зажимов микрохирургических, начиная с самой верхней полой вены зажим. После удаления последнего зажима аорты, тщательно остановить кровотечение в конечном итоге мягким ватным тампоном. Через несколько секунд трансплантата получится розовым оттенком, а uretric сокращений должен появиться.
  21. Для вставки мочеточника трансплантатов в мочевом пузыре Получателя осторожно удалить небольшой участок мускулатуры в верхней части мочевого пузыря использованием Scissor Vannas Весна (Student Vannas Весна Scissor Прямой, тонкий инструментов науки, cat.no. 91500-09 ). Затем удалите окружающие ткани (в основном жир) из привитого мочеточника использованием щипцов Дюмон Угловой чаевые. Поэтому тщательно захватите кончик мочеточника и осторожно отделить окружающую клетчатку, соединительную ткань и сосуды встроенных сюдам, потянув их в противоположном направлении. Fixate uretric наконечник в конце хирургической нити (Prolene 6-0, Ethicon, кат. Нет. 8697H) и перфорировать предварительно приготовленной верхней части мочевого пузыря с прилагаемыми иглы. Потяните мочеточник через мочевой пузырь и выхода его в базу через второй перфорации.
  22. Fixate ранее из мочеточника отделить ткань в верхней части мочевого пузыря с хирургической нити (Ethilon 9-0). Обрежьте кончик мочеточника с прилагаемыми хирургической нити и вытяните назад мочеточника в мочевой пузырь осторожно нажав снизу. После этого, закройте второй пункции мочевого пузыря с хирургической нити (Ethilon 9-0).
  23. Закрыть брюшную стенку и кожу двумя непрерывными но отдельные швы использованием хирургической нити для наложения швов (Mersilene 0). Лечить раны использованием Pividon Йод и администрирования бупренорфин (0,1 мг на кг / BW / предложение) подкожно в течение трех дней после хирургического вмешательства для предотвращения раны боли.

3. Изображениями отторжения трансплантата

  1. Обезболить натощак крысы изофлураном 2-2,5%.
  2. 30 МБк ФДГ (30 МБк ФДГ в 0,1 мл 0,9% NaCl), которые вводили внутривенно через катетеризации латеральную хвостовую вену в 24-G катетер (Браун, Introcan, 4252500-01). После продувки катетер с 0,9 мл 0,9% раствора NaCl.
  3. Оставьте крыса в фиксатор без анестезии до начала сканирования и гидрата животное внутривенной инъекции 1 мл 0,9% раствором хлорида натрия ежечасно.
  4. Re-Anesthetize крысы изофлураном 2% сразу до начала сканирования.
  5. Наведите наркозом крыса в высоком разрешении многожильных камеры на основе животного ПЭТ камеру quadHIDAC (Оксфорд Позитронно Systems Ltd, Оксфорд, Великобритания). Пространственное разрешение ПЭТ сканера 1,0 мм и постоянной на всем поле зрения (диаметр 165 мм; осевую длину, 280 мм). Мониторинг и контроль температуры тела во время сканирования с помощью ректального датчика температуры и контроля анестезии оксиметр импульса.
  6. Начать динамические приобретение для 60 мв открытии 180 мин после инъекции ФДГ-Tracer для уменьшения накопления в почках вызваны почечной экскреции ФДГ.
  7. Применение 5 МБк 18 F-фторид IV и выполнять другую ПЭТ сразу после 18 F-фторид инъекции в течение 60 мин без изменения положения крысы в сканер для идентификации почечной паренхимы и для расчета 18 F зазор 5. Реконструкция изображения обоих сеансов сканирования. Трассировка вручную интересующего объема (ВОИ) на восстановленных изображениях через 2 мин после 18 F-фторид инъекции (перфузии фазы) вокруг почечной коры и передачи ВОИ к ФДГ изображений. Тщательно исключить почечную лоханку с ВОИ. Реконструкция изображения обоих сеансов сканирования и вручную проследить интересующего объема (ВОИ) вокруг почечной коры. Список режиме данные здания были реконструированы в изображения с воксел размером 0,4 × 0,4 × 0,4 мм 3. Тщательно исключить почечную лоханку с ВОИ.
  8. Вычислить ФДГ поглощение соотношение оF общего счета и объем и вычислить процент введенной дозы (% ID). Мы использовали MATLAB (версия R2011b, MathWorks, Натик, штат Массачусетс, США) и томографических изображений (TIM) версии 2.8 для анализа изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Гистология

Во лейкоцитов AR, т.е. главным образом Т-лимфоциты на работу в трансплантации, в то время как тяжесть отказ отражается от степени воспаления. В перийодат-Шиффа (PAS) окрашивание изображенный здесь (рис. 1), почечная аллотрансплантата показывает значительные гистологические признаки AR, а именно гломерулит, tubulitis, endothelialitis и привитые инфильтрации (рис. 1, ATX POD4) (POD = й день после операции) в то время как признаки отторжения от...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

ФДГ-ПЭТ является новой опцией для диагностики острого отторжения. Из-за своей неинвазивным и специфики, ПЭТ является преимуществ по сравнению с классической диагностики по пункционной биопсии. В отличие от ограниченного размера образца биопсии, ПЭТ анализ всей трансплантата. Более того, можно применить его к пациентам на антикоагулянт терапии, и можно выполнять ПЭТ мер повторно, например, для мониторинга эффективности лечения 4. Кроме того, мы уже показали, что два основных дифференциальной диагности...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Немецкого Forschungsgemeinschaft (SFB 656, Мюнстер, Германия, проекты C7 и C6) и IZKF Мюнстер (основных подразделений SMAP). Авторы благодарны Truc Le Van, Энн Kanzog, Уте Neugebauer, Wiebke Gottschlich и римских Priebe за отличную техническую помощь и Даниилу Burkert и Свен Фатум для производства радиоактивных индикаторов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Оборудование
Иглодержатель Матье — 14 cmFine Science Tools12010-14
Микроиглодержатель Кастровьехо — 9 cmFine Science Tools12061-01
Хирургические ножницы (острый/тупой конец)Fine Science Tools14001-12
Ножницы Ириса ToughCut, прямые, 11.5 cmFine Science Tools14058-11
Ученические пружинные ножницы ВаннасаFine Science Tools91500-09
Пружинные ножницы Ваннаса — лезвия 3 mmFine Science Tools15000-00
Ученический анатомический пинцет — 1x2 зубца, 12 cmFine Science Tools91121-12
Пинцет Dumont SS-45 — Inox MedicalFine Science Tools11203-25
Аппликатор для клипс Micro-Serrefine с замкомFine Science Tools18056-14
Клипса Micro-Serrefine 6 mm x 1 mmFine Science Tools18055-03
Клипса Micro-Serrefine 4 mm x 0.75 mmFine Science Tools18055-04
Реагенты
Изофлуран (напр. Forene 100% v/v)Abott
Антисептик для кожи (напр. Octeniderm) Schülke
Повидон-йод (напр. Betaisodona)Mundipharma
Офтальмологическая мазь (напр. Bepanthen)Bayer
Бупренорфин (напр. Temgesic)RB Pharmaceuticals
Перфузионный раствор HTK (напр. CUSTODIOL HTK)Dr. Franz Köhler Chemie
Хирургическая нить Mersilene 0EthiconEH6665E
Хирургическая нить Mersilene 4-0EthiconEH6732H
Хирургическая нить Prolene 6-0Ethicon8697H
Хирургическая нить Ethilon 9-0Ethicon2809G
Хирургический шелк 5-0Vömel14739
Канюля (напр. Microlance 3, 27G ¾)BD302200

Ссылки

  1. Wu, O., Levy, A. R., Briggs, A., Lewis, G., Jardine, A. Acute rejection and chronic nephropathy: a systematic review of the literature. Transplantation. 87, 1330-1339 (2009).
  2. Miller, B. F., Gonzales, E., Wilchins, L. J., Nathan, P. Kidney transplantation in the rat. Nature. 194, 309-310 (1962).
  3. Reuter, S., Schnöckel, U., Schröter, R., Schober, O., Pavenstädt, H., Schäfers, M., Gabriëls, G., Schlatter, E. Non-invasive imaging of acute renal allograft rejection in rats using small animal F-FDG-PET. PLoS. One. 4, e5296(2009).
  4. Reuter, S., Schnöckel, U., Edemir, B., Schröter, R., Kentrup, D., Pavenstädt, H., Schober, O., Schlatter, E., Gabriëls, G., Schäfers, M. Potential of noninvasive serial assessment of acute renal allograft rejection by 18F-FDG PET to monitor treatment efficiency. J. Nucl. Med. 51, 1644-1652 (2010).
  5. Schnöckel, U., Reuter, S., Stegger, L., Schlatter, E., Schäfers, K. P., Hermann, S., Schober, O., Gabriëls, G., Schäfers, M. Dynamic 18F-fluoride small animal PET to noninvasively assess renal function in rats. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 2267-2274 (2008).
  6. Grabner, A., Schnöckel, U., Kentrup, D., Schäfers, M., Reuter, S. Strategies for Non-Invasive Molecular Imaging of Acute Allograft Rejection by Gamma Scintigraphy and Positron Emission Tomography. Curr. Radiopharm. 4, 10-23 (2011).
  7. Racusen, L. C., Solez, K., Colvin, R. B., Bonsib, S. M., Castro, M. C., Cavallo, T., Croker, B. P., Demetris, A. J., Drachenberg, C. B., Fogo, A. B., et al. The Banff 97 working classification of renal allograft pathology. Kidney Int. 55, 713-723 (1999).
  8. Edemir, B., Reuter, S., Borgulya, R., Schröter, R., Neugebauer, U., Gabriëls, G., Schlatter, E. Acute rejection modulates gene expression in the collecting duct. J. Am. Soc. Nephrol. 19, 538-546 (2008).
  9. Velic, A., Gabriëls, G., Hirsch, J. R., Schröter, R., Edemir, B., Paasche, S., Schlatter, E. Acute rejection after rat renal transplantation leads to downregulation of Na+ and water channels in the collecting duct. Am. J. Transplant. 5, 1276-1285 (2005).
  10. Reuter, S., Velic, A., Edemir, B., Schröter, R., Pavenstädt, H., Gabriëls, G., Bleich, M., Schlatter, E. Protective role of NHE-3 inhibition in rat renal transplantation undergoing acute rejection. Pflugers Arch. 456, 1075-1084 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

ФДГ-ПЭТ-визуализация18F-ФДГ-ПЭТмодель аллогенной трансплантациикрыса с односторонней нефрэктомиейФДГ-ПЭТ трансплантатамониторинг отторжения трансплантатапозитронно-эмиссионная томография
Неинвазивная визуализация острого отторжения аллотрансплантата после трансплантации почки крысы Использование
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.