Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Гранулоцитов зависит от аутоантител вызванных кожи пузырей

10.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4250

⸱

12 октября 2012 г.

 ,  , 
1Department of Dermatology, University of Freiburg , 2Kepler High School Freiburg, 3Centre for Biological Signalling Studies (BIOSS), University of Freiburg

В этой статье

Краткое содержание

В животном модели, описанной в нашей нынешней работы, очищенный IgG антитела против участке 200 аминокислот (аа 757-967) коллагена VII вводят повторно мышам воспроизводя пузырей фенотипа, а также гисто-и иммунопатологические особенности, характерные для человека эпидермолиз буллезной acquisita (EBA) 1.

Аннотация

Аутоиммунные явления происходят у здоровых людей, но когда аутотолерантность не удается, аутоиммунный ответ может привести к конкретной патологии. По Witebsky постулатов, один из критериев в диагностике заболевания, аутоиммунные является воспроизводство заболевания у подопытных животных по пассивной передачи антител. Для эпидермолиз буллезной acquisita (EBA), прототипического орган-специфических аутоиммунных заболеваний кожи и слизистых оболочек, несколько экспериментальных моделей были недавно установлены. В животном модели, описанной в нашей нынешней работы, очищенный IgG антитела против участке 200 аминокислот (аа 757-967) коллагена VII вводят повторно мышам воспроизводя пузырей фенотипа, а также гисто-и иммунопатологические особенности, характерные для человека EBA 1. Полномасштабную распространенное заболевание обычно наблюдается через 5-6 дней после первой инъекции и степени заболевания коррелирует с дозой вводится сollagen VII конкретных IgG. Повреждения ткани (образование пузырей) в экспериментальном ЕВА, в зависимости от набора и активацию гранулоцитов тканью связанных аутоантител 2, -4. Таким образом, эта модель позволяет для вскрытия гранулоцитов зависит от воспалительных пути, участвующие в аутоиммунного повреждения тканей, так как модель воспроизводит только Т-клеток независимых этапа эфферентной аутоиммунный ответ. Кроме того, его значение указывается ряд исследований, демонстрирующих блистерная вызывающие потенциал аутоантител в естественных условиях и исследования механизма формирования пузыря в 1,3 EBA, -6. Наконец, эта модель будет в значительной степени способствовать развитию новых противовоспалительной терапии в аутоантител-индуцированных заболеваний. В целом, пассивная модель животного передаче EBA является доступным и поучительные модели заболевания и поможет исследователям анализировать не только EBA патогенеза, но ответить на фундаментальные биологически и клиническисущественные вопросы аутоиммунных заболеваний.

Протокол

1. Подготовка патогенные антитела

Примечание: Очистка и концентрация антител должны быть выполнены в тот же день, как антитела не будут храниться в 0,1 М глицин, рН 2,5-3 (буфера элюирования) в течение ночи (ON).

Affinity очистки IgG: используйте 25 мл иммунной сыворотки кролика:

  1. Оттепель сывороткой кролика ON при 4 ° С, смешать 1:1 с 1xPBS (работает буфер) и центрифугируют ее при 1260 х г в течение 10 мин при 20 ° C. При необходимости фильтрации шаг с фильтровальной бумаги могут быть включены после центрифугирования в случае жирной сыворотки.
  2. Между тем, мыть белка G матрица заполнена колонка с 10 объемов слоя (объем слоя = матрица объема) 1XPBS (работает буфер).
  3. Применить разбавляют и фильтруют сыворотки в колонну и инкубировать 1 час на качающейся платформе при комнатной температуре (RT).
  4. Сбор проточные (FT) в 50 мл Флакон трубки. Не выбрасывайте его до концентрациии титра IgG очищенный известно.
  5. Вымойте матрицы с 5 объемами слоя 1XPBS и в то же время подготовить 50 мл Сокол труб для сбора Элюированную фракцию IgG. Внесите 1 мл рН нейтрализующей буфер: 1 M Трис рН 10 в каждой пробирке (в противном случае доля 1:20 буфере TRIS по отношению к количеству элюата должны быть собраны).
  6. Нанесите 100-150 мл буфера элюирования: 0,1 М глицина рН 2,5-3 в колонну и собирают 50 мл фракции (ы). Переверните трубку 2-3x, измерения рН и добавляют нейтрализующие буфер, пока вы не достигли рН 7,2-7,4.
  7. Соберите несколько капель элюата IgG и использование буфера элюирования в качестве эталона измерения ОП при 280 нм. Если диаметр составляет <0,1 прекратить сбор.
  8. Восстановить матрицу белка G и хранить его в соответствии с инструкциями производителя.

Концентрация путем ультрафильтрации с Amicon труб:

  1. Вымойте Amicon Ультра (15 мл / 30KDa) ультрафильтрации труб с 1XPBS путем центрифугирования 15-20 минв 3220 мкг при 4 ° C. Откажитесь от FT от Amicon.
  2. Заполните Amicons с 15 мл Элюированную фракцию IgG и центрифуги в течение 25-30 мин при 3220 мкг и 4 ° C; время центрифугирования всегда зависит от содержания белка в элюате.
  3. Откажитесь FT и повторить ультрафильтрации, пока вы не Элюированную фракции осталось.
  4. Вымойте концентрированной IgG широко, в два раза, с 1XPBS 25-30 мин путем центрифугирования.
  5. Соберите "липкие", желтоватый раствор антитела из Amicon фильтр в конечном объеме 1500-2000 мкл 1XPBS.
  6. Измерение концентрации IgG подготовки с использованием спектрофотометра или NanoDrop:
    Конц. (Мг / мл) = A (280 нм) х коэффициент разбавления / 1,4
  7. Вымойте и хранить Amicons в соответствии с инструкциями производителя.

2. Инъекции коллагена VII конкретных IgG в мышах

Перед началом фактической экспериментальной процедуры, убедитесь, что экспериментальная пропротокол написан и все материалы готовы к эксперименту.

  1. Подготовка данных листов для болезни забил, ИФА, иммунофлюоресценции (ИФ) анализ и миелопероксидазы (МПО) анализ 4.
  2. Этикетка труб для крови и органах, cryomolds, а также гистология обработки и вложения кассет.
  3. Антитела решения должны быть подготовлены свежие или талой от акций и характеризуется с точки зрения их реактивность (титр И.Ф. микроскопии и / или ИФА). Стерильной фильтрации раствора антител следует развести в PBS таким образом, что необходимую дозу для инъекций колеблется в пределах 250-1000 мкл. Убедитесь, что у вас есть достаточно IgG для выполнения всего эксперимента.
  4. Подготовка свежих антикоагулянта: гепарин 20 ЕД / мл и 8,7 мг / мл кетамина / 1,3 мг / мл ксилазина смеси для наркоза. Когда ущерба для мышей назвали труб с 3,7% формальдегида подготовлен.
  5. Стерилизовать хирургические инструменты (скальпель, ножницы, тонкость и Curvред forcipes) и подготовить шприцы (инсулиновые шприцы, 1 и 2 шприца мл), иглами, цифровая камера и дополнительная карта памяти.

Примечание: Выполните все процедуры по кетамин / ксилазина или изофлурана наркотизированных мышей Isoflurane является предпочтительным вариантом анестезии для ежедневных проверок кожи, как мыши быстро восстанавливаться.. Тем не менее, при съемке, 87 мг / кг кетамина и 13 мг / кг ксилазина, как правило, вводят подкожно. Для эвтаназии кетамин / ксилазина дозу увеличивают до 130 мг / кг кетамина и 20 мг / кг ксилазина.

  1. Проверьте уже отмечалось животных для их общее состояние здоровья, кожи и меха внешний вид, взвесить их и измерять их толщину уха (всегда придерживаться того же уха).
  2. Регистрация наблюдаемых значений и изменения в клиническом лист оценки.
  3. Сбор 20-30 мкл (2-3 капли) крови из хвостовой вены в шприц, содержащий тот же объем антикоагулянта.
  4. Лечить меха икожи с использованием 80% этанола.
  5. Вводят раствор антитела подкожно в заднюю использованием инсулинового шприца. (Для некоторых сайтов (например, ушей) лишь небольшие объемы (10-50 мкл) возможны для инъекций).

Инъекции следует повторять каждый второй день, 4 раза. BALB / C и C57BL6 мышах массой тела около 20 г начинают развиваться болезни 3-4 дней после первого введения 400-500 до 750 мкг / г веса тела / инъекция антител.

При завершении эксперимента:

  1. Положить мышей под глубоким наркозом путем введения 130 мг / кг и 20 мг / кг кетамина / ксилазина подкожно, обескровить их от задней полой вены и перерезал сердце.
  2. Сбор органов / образцы тканей, таких как кожа: хвост, уши, кровь и пищевод и положить их в предварительно помечены и PBS, или на 3,7% формальдегида заполнить трубы.

При возвращении влаборатории:

  1. Центрифуга крови в 1200 XG, 10 мин при комнатной температуре в отдельной плазмы, передает плазмы должны иметь соответствующую маркировку труб и хранить их соответствующим образом.
  2. Вставить биопсии кожи в оптимальном средней температуры Cut использованием cryomolds, правильно этикетке, и хранить их при температуре -80 ° C.
  3. Поместите образцы тканей, предназначенных для гистологии в мечеными форм вложения и держать их в 3,7% формальдегида до парафин вложения.

3. Клиническая оценка тяжести заболевания

Мыши должны быть рассмотрены в день в течение поражения кожи и слизистых оболочек, а результаты должны быть записаны с использованием соответствующей формы. Критерии для раннего эвтаназии поражения кожи, затрагивающие более что 20% поверхности тела и потеря веса на 5-10% от общей массы тела в течение трех дней подряд, рассчитывая на болезнь счетом 5 (табл. 1).

  1. Наведите на животе. Начните с главой области, а именно с правойухо и проверить пузыри, эрозии, корочки на внутреннем, так и на внешней стороне. Продолжайте так же с левым ухом.
  2. Правый и левый глаз контролируется на наличие признаков эритема, алопеция, эрозий и / или коры.
  3. Лоб и морда области чистят через следующий, продолжая с вентральной части морды, губ и слизистой оболочки полости рта.
  4. Изучите правой ноге, начиная от передней лапы, двигаясь вверх; переключения в левой передней ноги. То же процедуру с правой и левой задних ног.
  5. Кисть через меха на шее и спине области с изогнутым пинцетом штрафа точки.
  6. Включите мышь на спину и проверить вентральной части, а также брюшной стороны конечностей же, как и ранее.
  7. Проверьте хвост.
  8. Сфотографируйте соответствующих частях тела, где мышей развиваются болезни. Внимание должно быть обращено на качество и количество фотографий.
  9. Рассчитать клинические показатели заболевания.

4. Анализ кожи и образцы плазмы

  1. Подготовка, хранения и / или обработки всех собранных тканей в соответствии с планом.
  2. Вырезать замороженных срезов ткани для IF обнаружение антител кролика и мыши компонентов системы комплемента.
  3. Анализ различным содержанием белков и ферментов (MPO анализ) замороженной ткани и / или органов экстрактов.
  4. Раздел парафин ткани и пятно с H & E для визуализации степени повреждения тканей.
  5. Анализ плазмы методом ИФА, иммуноблот.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Пассивный перенос антигена конкретных результатов антител в полномасштабную болезни у мышей, напоминающее на клинических, гистологических и иммунопатологические уровни человеческого EBA. Пузыри, корок, эрозий и алопеция развивается на уши, мордочка, лапы, ноги, спину и вокруг глаз мышей. Первые клинические признаки заболевания, скорее всего, появится на ушах и / или область головы. Нанесение конкретных кролика IgG и мыши комплемента С3 определяется по прямой, если в кожных эпидермального соединения в cryosections от пов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Пассивного переноса антител в экспериментальных животных является одним из основных подхода для демонстрации их патогенности 7, -12. Животные модели, полученные с помощью этого метода, помимо того, что косвенным свидетельством аутоиммунных 13, позволяют исследование эфферентной этап патогенеза. Пассивная модель передачи антител индуцированные гранулоцитов зависит от кожи пузырей эпидермолиз буллезной acquisita (EBA) была использована, чтобы анализировать механизмы повреждения тканей при аутоиммунны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы признают поддержки за счет субсидий из Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 и БИОСС из медицинского факультета Университета Фрайбурга (для CS).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии
рекомбинантного антигена Плазмиды, кодирующие для рекомбинантных форм мышиного коллагена VII доступны из соответствующего автора.
иммунной сыворотки кролика www.eurogentec.com У нас были новозеландских белых кроликов, иммунизированных 200 мкг антигена, 3 раза с интервалом в 2 недели. Для этого мы воспользовались услугами Eurogentec SA, Бельгия.
Белки G агарозы Roche Applied Science 11243233001
BALB / C мышей Charles River Laboratories
Октябрь соединение, Tissue-Tek Сакура Finetek 4583 Октябрь, оптимальная температура резки
Cryomold стандартных Сакура Finetek 4557 25 мм × 20 мм × 5 мм
Cryomold промежуточного Сакура Finetek 4566 15 мм × 15 мм × 5 мм
Uni-Link-Einbettkassette Р. Langenbrinck 09-0503 Гистология обработки и вложение кассеты
Spezial-Tatowierfarbe Schwarz H. Hauptnerund и Ричард Herberholz GmbH & Ко КГ 71492000 татуировки пасты
Tatowierzange TZ1 EBECO E. Becker & Co GmbH татуировки устройства
Гепарин Carl Roth GmbH & Ко 7692,1
Формальдегид 37% Carl Roth GmbH & Ко 7386
Кетамин гидрохлорид Sigma-Aldrich Chemie GmbH K2753-1G
Ксилазин гидрохлорид Sigma-Aldrich Chemie GmbH X1251-1G
стерильной PBS Biochrom L182-50
цифровой фотоаппарат Nikon Coolpix 5400
Шприц приводом фильтр 0,45 мкм Millipore
Каверномер Mitutoyo 7309 1667338 Farnell (дистрибьютор)
Лист болезни скоринг Например шкафаСЭД

Ссылки

  1. Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen. J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).
  2. Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 225, 401-413 (2011).
  3. Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. PI3Kβ plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes. Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).
  4. Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage. J. Pathol. 212, 56-65 (2007).
  5. Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).
  6. Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).
  7. Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).
  8. Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme. Science. 286, 1732-1735 (1999).
  9. Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., Wölfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. The flavonoid luteolin inhibits Fcγ-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice. PLoS One. 7, e31066(2012).
  10. Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180. J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).
  11. Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease. N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).
  12. Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse. Science. 190, 397-399 (1975).
  13. Rose, N. R., Bona, C. Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited. Immunol. Today. 14, 426-430 (1993).
  14. Sitaru, C. Experimental models of epidermolysis bullosa acquisita. Exp. Dermatol. 16, 520-531 (2007).
  15. Sitaru, C., Kromminga, A., Hashimoto, T., Bröcker, E. B., Zillikens, D. Autoantibodies to type VII collagen mediate Fcgamma-dependent neutrophil activation and induce dermal-epidermal separation in cryosections of human skin. Am. J. Pathol. 161, 301-311 (2002).
  16. Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice. Immunol. Lett. , (2012).
  17. Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 224, 234-244 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

VII
Гранулоцитов зависит от аутоантител вызванных кожи пузырей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.