Итерационные Оптимизация дуплексов ДНК для кристаллизации SeqA ДНК-комплексов

Summary

Кристаллическая структура белка-ДНК может дать представление о функции белка, механизма, а также, характера конкретного взаимодействия. Здесь мы сообщаем о том, как оптимизировать длину, последовательность и концы ДНК-дуплекса для совместной кристаллизации с Кишечной палочки SeqA, негативный регулятор инициации репликации.

Abstract

Кишечная палочка SeqA является негативным регулятором репликации ДНК, что предотвращает преждевременное возобновление событий изолирующих hemimethylated GATC кластеров в начало репликации ^1. Помимо происхождения, SeqA находится на репликацию вилки, где он организует новореплицированные ДНК в более упорядоченной структуры ^2. SeqA ассоциируется только с одним слабо GATC последовательностей, но он образует комплексы высокого сходства с ДНК-дуплексов, содержащих несколько GATC сайтов. Минимальные функциональные и структурные единицы SeqA представляет собой димер, тем самым объясняя требование по крайней мере два GATC последовательности, чтобы сформировать высоким сродством комплексе с ДНК hemimethylated ^3. Кроме того, архитектура SeqA, с олигомеризации и ДНК-связывающих доменов, разделенных гибкий линкер, позволяющий привязки к GATC повторов, разделенных до трех винтовых поворотов. Таким образом, понимание функции SeqA на молекулярном уровне требует структурного Anaлизис SeqA связан с несколькими GATC последовательности. В белок-ДНК кристаллизации, ДНК может иметь никто не исключительный эффект на упаковке взаимодействий в зависимости от относительных размеров и архитектуры белков и ДНК. Если белка больше, чем ДНК или отпечатки большая часть ДНК, кристаллической упаковки в первую очередь опосредовано белок-белковых взаимодействий. И наоборот, когда белка такое же или меньшего размера, чем ДНК или она покрывает лишь часть ДНК, ДНК-ДНК и ДНК-белковых взаимодействий доминировать кристаллической упаковки. Таким образом, кристаллизация белок-ДНК комплексов требует систематического скрининга ДНК ⁴ длины и ДНК концами (тупым или навес) ^5-7. В этом докладе мы опишем, как разрабатывать, оптимизировать, очистить и кристаллизуются hemimethylated дуплексов ДНК, содержащий тандем GATC повторяется в комплексе с димерный вариант SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R), чтобы получить кристаллы подходят для определения структуры.

Protocol

1. Очистки белков

Гибкий линкер подключения N-(олигомеризации) и C-терминал (связывание ДНК) областях SeqA средствами признание hemimethylated GATC повторяет отделена от одного до трех поворотов на ДНК. Для этого исследования мы использовали димерный вариант SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) с точечной мутации в N-концевой домен, который предотвращает дальнейшее олигомеризации и сокращенный линкера, который ограничивает связывания ДНК в тандеме GATC повторяет отделена исключительно один оборот на ДНК (рис. 1) ^2,8.

1. Преобразование BL21 (DE3) с плазмидой SeqA кодирования под контролем промотора T7,
2. Плита преобразования реакции в LB-агаром в том числе 100 мкг / мл ампициллина,
3. Возьмите смешанные колонии привить мелким ночной культуры (LB среды с 100 мкг / мл ампициллина),
4. На следующее утро привить 1 л массовой информации, использующих разведении 1:100 из ОверниGHT культуры,
5. Рост клеток к OD ₆₀₀ ~ 0,7 и вызывает производство белка добавлением изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ,
6. Продолжить инкубации в течение 3 часов при 37 ° C с орбитальной встряхивании, а затем собрать клеток путем центрифугирования (10 мин при 3300 г),
7. Ресуспендируют осадок клеток в очистку буфера и лизируют с помощью ультразвука,
8. Снимите лизата центрифугированием (40 мин при 39000 г) и загрузить супернатанта на гепарин, уравновешенную очистки буфера,
9. Elute SeqA с использованием линейного градиента до 1 М NaCl (SeqA элюируется ~ 0,7 М NaCl)
10. Бассейн SeqA Фракции, содержащие вместе, развести, чтобы снизить ионной силы образца и нагрузки на катион-обменной хроматографии, уравновешенную очистки буфера,
11. Использование линейного градиента соль, чистый SeqA элюируется на ~ 0,4 М NaCl,
12. Бассейн SeqA Фракции, содержащие вместе, concentratе (3 мг / мл) и хранят в памяти буфера.

2. Очистки ДНК

1. Заказ дополнительных неметилированный и метилированных олигонуклеотидов из ваших любимых компаний,
2. Растворите 1 мкмоль лиофизированные одной нити ДНК в 800 мкл из автоклавного DDH ₂ O, вихрь и оставьте на 10-20 мин,
3. Добавить 800 мкл предварительно нагретого 2X буфером загрузки каждого олигонуклеотида,
4. За 20-30 нуклеотидов олигонуклеотиды, подготовить большую 10% денатурации гель (160 х 250 х 1 мм):
   * Тщательно перемешайте 80 мл 10% PAGE смеси, 80 мкл TEMED и 800 мкл персульфата аммония в гель и залить,
   * После полимеризации удалите гребень и промыть лунки с DDH ₂ O тщательно,
   * Соберите гелей на гель литья в том числе охлаждающей пластиной, а затем заполнить верхний и нижний резервуары проточной буфера (1X TBE),
   * Предварительно запуск геля на 700-750 V, чтобы нагреть гель до 55 ° C,
   * Остановите перспективе и промыть лунки Thoroughly работает с буфером.
5. Нагрейте олигонуклеотидов до 90 ° C в течение 2 мин,
6. Vortex и спина образцов и непосредственно перед загрузкой гель,
7. Выполнить геля при ~ 700 В и остановить его, как только ваш олигонуклеотида перекочевал на полпути. (Заметим, что на 10% полиакриламидном геле бромфеноловый синий совместного мигрирует с олигонуклеотиды ~ 20 баз долго и ксилол cyanol FF с ~ 60 баз в длину),
8. Остановить геля, разобрать его из геля и снимите распорки,
9. На плоской поверхности, удалить одну стеклянную пластину и покрывают гелем полиэтиленовой пленкой,
10. Поверните гель вокруг, удалить другие стеклом и накройте ее полиэтиленовой пленкой,
11. Отметить полос с использованием УФ-светом и флуоресцентным пластине за гелем, чтобы увидеть ДНК тень,
12. Отрежьте полосу с лезвием бритвы на небольшие куски и передавать их в стерильные 15 мл трубки,
13. Добавить 9 мл буфера элюирования и элюирования в течение ночи при 37 ° C при перемешивании,
14. Осторожно передать решениедля автоклавного трубки центрифуги помощью гель-загрузки пипетки, чтобы избежать переноса части акриламида и добавить 1 мл 3 М ацетата натрия при рН 7 (1:10) плюс 25 мл охлажденной 100% этанола (2,5 объема),
15. Инкубировать при -20 ° C в течение 3 ч,
16. Спином вниз и передать супернатанта в отдельную трубу,
17. Сухой осадок на скорости переменного тока на среднем огне,
18. Ресуспендируют осадок в 400 мкл из автоклавного DDH ₂ O и перенести в новую пробирку,
19. Добавить 40 мкл 3 М ацетата натрия при рН 7 и 1 мл 100% этанола, хорошо перемешать (вихрь) и инкубировать 30 минут при комнатной температуре, затем 30 мин при -20 ° C,
20. Побочные в течение 15 мин при 18000 г и отбросить супернатант,
21. Промойте осадок 100 мкл 70% холодного этанола для удаления остатков соли из гранул и спина в течение 6 мин при 18000 г. Откажитесь от этанола и сухой осадок на скорости переменного тока,
22. Ресуспендируют гранул в общей сложности 100 мкл из автоклавного DDH
23. Для отжига hemimethylated дуплексов ДНК, смешать эквимолярной концентрации дополнительного одной нити и нагреть смесь до 95 ° C на водяной бане в течение 5 мин и затем дайте им остыть медленно до комнатной температуры в водяной бане.

3. Белок-ДНК комплекса формирования и анализа

1. Смешать в равных объемах очищенных SeqAΔ (41-59)-A25 (81 мкМ) и hemimethylated ДНК (81 мкм),
2. Выдержите при комнатной температуре в течение 15 мин и хранят при 4 ° C, пока вы не готовы его использовать,
3. Экран для условий кристаллизации с использованием коммерческих разреженных матриц экранов,
4. После начальной приводит кристаллизации были выявлены, оптимизацию условий для выращивания кристаллов дифракция качества,
5. Cryoprotect в результате SeqA-ДНК кристаллов путем увеличения количества PEG 400 присутствующих в кристаллизации решение до конечной концентрации 25% (V / V) или добавлением 20% глицерина (V / V) к кристаллизации раствора,
6. Совок отдельные кристаллы с нейлоновой петлей, и флэш-заморозить их в жидком азоте,
7. Проверьте дифракционный предел каждого кристалла при 100 К.

4. Представитель Результаты

Для получения кристаллической структуры SeqAΔ (41-59)-A25R связаны с hemimethylated ДНК, мы последовательно оптимизированы трех параметров на ДНК: (I) расстояние между hemimethylated GATC последовательности; (II) длиной дуплекс, и (III) отсутствие / наличие 5 'свесы.

Электро-подвижности анализы показывают, что сдвиг SeqAΔ (41-59)-A25R преимущественно связывается GATC повторяет разделенные на 9-10 пар оснований (рис. 1). Таким образом, мы изначально скрининг дуплексы 23-24 пар оснований (бит) длиной, содержащий два hemimethylated GATC последовательностей, разделенных либо 9 или 10 бит. Три дуплексы дали красиво формы кристаллов (рис. 2). Alхотя ни один из кристаллов дифрагированного с высоким разрешением, 23-бит долго дуплекс с двумя GATC сайтов разделенных на 9 б.п. дифрагированных рентгеновских лучей лучше, чем остальные, указывая, что GATC отделение из 9 бит был предпочтительнее для кристаллизации. Таким образом, мы установили между GATC расстоянии до 9 бит для всех последующих экранах.

Как правило, ДНК кристаллизации благоприятствует для двусторонней длины соответствующих точных винтовых поворотов, потому что несколько молекул ДНК может сложить головы к хвосту, образуя непрерывную B-ДНК внутри кристалла ^9. Таким образом, мы сократили общую длину дуплексов на 21 базисных пунктов (то есть два спиральных витков). В то время как 21-бит дуплекс с тупыми концами не дал дифракционного качества кристаллов (данные не приводятся), что на 21 б.п. дуплекс с одной 5 'навеса нуклеотидной на каждом конце же дают кристаллы, которые дифрагированного до 5 А в нашем доме источник. Улучшение на дифракционный предел предположил, что из конца в конец дуплекс ассоциация была действительно способствуютния кристаллической упаковки.

С SeqA взаимодействует с GATC последовательностей, которые находятся на том же лице ДНК, противоположной стороне ДНК-дуплекса должно подвергаться воздействию растворителей. Для дальнейшего улучшения кристаллов комплекса, мы тогда изменение последовательности дуплекс включить динуклеотид CG между двумя GATC сайтов для продвижения паз-основа взаимодействия с соседними молекулами ДНК в кристалл на противоположной стороне дуплекса, метод , которые были использованы для повышения ДНК кристаллизации в прошлом ^10. Тем не менее, дифракционный предел кристаллов, выращенных с CG-содержащих дуплекс было идентичны тем, которые выросли с аналогичным дуплексной ДНК, которые не содержат динуклеотид CG (рис. 3). Этот результат показал, что паз-основы взаимодействия не важно в данном случае. Впоследствии мы оптимизировали длина свесов, сравнивая кристаллов, выращенных с помощью ДНК-дуплекс, что было два дополнительных нуклеотидов в каждом5 'конца. Это изменение было резкое влияние на морфологию кристаллов, а также, дифракционный предел о том, что дополнительный нуклеотид резко изменилась молекулярных контактов и расширения организации кристалла (рис. 3).

Кристаллическая структура SeqAΔ (41-59)-A25R связаны с этим последним дуплексной ДНК подтвердил, что свободные лицо ДНК-дуплекса не участвует в кристалле контактов, как и ожидалось от ограниченного эффект от внедрения CG-динуклеотид. Несмотря на относительный размер белков и ДНК, большинство взаимодействий между симметрией товарищей опосредованы белок-белковых и белок-ДНК взаимодействия (рис. 4). Интересно, что в данном конкретном случае, положительный эффект динуклеотид свес 5 'не связано с формированием псевдо-непрерывные ДНК. Вместо этого, 5 'конца метилированных проектов пряди от оси ДНК и взаимодействует с молекулой проксимального SeqA комплекса, объясняя, почему два нуклеотида W прежде чем строго необходимо для изменения кристаллической упаковки ^8,11.

Рисунок 1. Связывание SeqAΔ (41-59)-A25R в hemimethylated ДНК. (А) Схематическое изображение областей SeqA, что промежуточное олигомеризации белка и ДНК-связывающего. (B) методом сдвига электрофоретической подвижности SeqAΔ (41-59)-A25R с ДНК, содержащей два hemimethylated GATC последовательностей, разделенных большее число пар оснований ( X). Самая левая полоса (помеченный пустой) содержит эквимолярной смеси ДНК с 5, 7, 12, 21, 25 и 34 пар оснований между двумя GATC последовательности в отсутствие SeqAΔ (41-59)-A25R. (C) схему, изображающую трех переменных оптимизированы на дуплексов ДНК для получения кристаллов дифракция качества.

upload/4266/4266fig2.jpg "FO: содержание ширина =" 6in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg "/>
Рисунок 2. Влияние изменения между GATC расстояния. Резюме олигонуклеотидов, используемых и полученных кристаллов с 23-24 б.п. долго дуплексов, содержащих два hemimethylated GATC сайтов, разделенных 9 или 10 пар оснований. Все фотографии кристаллов были сделаны в то же увеличением и шкалы указывает 100 мкм. Предел разрешающей способности каждого SeqAΔ (41-59)-A25R ДНК-кристалл на основе дифракционных картин, собранных на Rigaku RU-300 генератор рентгеновского излучения системы. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 3. Влияние изменения ДНК заканчивается. Резюме тОн олигонуклеотидов, используемых и полученных кристаллов с 21 бит долго дуплексов, содержащих два hemimethylated GATC сайтов разделенных на 9 пар оснований и в том числе 0, 1 или 2 нуклеотидных 5 'свесы конца. Все фотографии кристаллов были сделаны в то же увеличением и шкалы указывает 100 мкм. Предел разрешающей способности каждого SeqAΔ (41-59)-A25R ДНК-кристалл на основе дифракционных картин, собранных на beamlines X12C и X29 (NSLS, BNL). Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 4. Кристаллической упаковки SeqAΔ (41-59)-A25R связывается с ДНК с динуклеотид навеса: При осмотре (A) сверху и сбоку (B). Асимметричный блок содержит два SeqAΔ (41-59)-A25R ДНК-комплексов, где белок представлен на сером в то время как ДНК показано оранжевым цветом. Симметричныхры связанных SeqAΔ (41-59)-A25R-молекул ДНК, приведены в белый для белка и желтый для ДНК. Эта цифра была подготовлена ​​с использованием PyMOL ^12. Этот показатель связан с Фильм 1. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Фильм 1. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Discussion

Одна из самых больших проблем в макромолекулярных рентгеновской кристаллографии является получение кристаллов дифракция качества. В случае белок или белок-ДНК комплексов, эта задача осложняется из-за дополнительных переменных, которые должны быть оптимизированы. Широко распространено мнение, что длина ДНК и наличия липкие выступы для повышения объединение соседних молекул ДНК в более псевдо-дуплекс являются основными параметрами для оптимизации. Тем не менее, мы показали, что характер и продолжительность этих выступов м...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Catalogue #	Комментарии (по желанию)
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500
Dithiotheitrol (DTT)	Bio Basic Инк	DB0058
NaCl	Bioshop	SOD002.10
Глицерин	Caledon	5350-1
Сахароза	Sigma-Aldrich	S5016-500G
Додецилсульфата натрия (SDS)	Bioshop	SDS001.500
Мочевина	Bioshop	URE001.5
40% 29:1 Bis / акриламида	Bio Basic Инк	A0007-500мл	Хранить при температуре 4 ° C
Борная кислота	EMD	BX0865-1
Ксилол cyanol FF	Bio-Rad	161-0423
Bromophenol синий	Bioshop	BR0222
Двойной регулируемый Вертикальная система Gel	CBC Научно Компания Инк	Препарат-250
Экран Индекс кристаллизации	Hampton исследований	HR2-144	Хранить при температуре 4 ° C
Мастер I кристаллизации экран	Emerald BioSystems	EBS-Wiz-1	Хранить при температуре 4 ° C
Мастер II кристаллизации экран	Emerald BioSystems	EBS-Wiz-2	Хранить при температуре 4 ° C
Классика кристаллизации экран	Qiagen	130701	Хранить при температуре 4 ° C
Intelliplate лотков	Искусство Robbins Instruments	102-0001-00
			Решения Белки очистки буфера: 100 мМ Трис, рН 8, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ DTT и 5% глицерина. Белки хранения буфер: 20 мМ Трис рН 8, 150 мМ NaCl, 5 мМ ДТТ, 0,5 мМ ЭДТА и 5% глицерина. Гель для загрузки смеси добавить 20 г сахара, 25 мг бромфеноловый синий, 25 мг ксилола cyanol FF, 1 мл 10% в / SDS и 10 мл 10X TBE до 70 мл автоклавного DDH 2 O. Перемешать с легкой нагревание до сахарозы растворяют и отрегулировать окончательноеобъем до 100 мл автоклавного DDH 2 O. Хранить при температуре 4 ° C. 2X буфером загрузки: добавить 11 г мочевины на 10 мл геля смесь нагрузки. Движение на горячей плите, пока мочевина растворяется. Алиготе в 2 мл пробирки и хранят при 4 ° C. 10X смесь PAGE: Mix 420,4 г мочевины, 100 мл 10X TBE (автоклавного), 250 мл 40%-бис 29:1 / акриламида в DDH 2 O. Перемешать, пока полностью растворяется и регулировать громкость до 1 литра. Хранить в темной бутылке при температуре 4 ° C. 10X КЭ: Растворите 108 г Трис, 55 г борной кислоты и 9,3 г ЭДТА в 1 литре DDH 2 O. Автоклав и хранить при комнатной температуре. Элюции буфером: развести 8 мл 5 М NaCl, 2 мл 1 М Трис, рН 7,5, 0,4 мл 0,5 М ЭДТА рН 8 на 200 мл DDH 2 O. Автоклав и хранить при комнатной температуре.