Итерационные Оптимизация дуплексов ДНК для кристаллизации SeqA ДНК-комплексов

Summary

Кристаллическая структура белка-ДНК может дать представление о функции белка, механизма, а также, характера конкретного взаимодействия. Здесь мы сообщаем о том, как оптимизировать длину, последовательность и концы ДНК-дуплекса для совместной кристаллизации с Кишечной палочки SeqA, негативный регулятор инициации репликации.

Abstract

Кишечная палочка SeqA является негативным регулятором репликации ДНК, что предотвращает преждевременное возобновление событий изолирующих hemimethylated GATC кластеров в начало репликации ^1. Помимо происхождения, SeqA находится на репликацию вилки, где он организует новореплицированные ДНК в более упорядоченной структуры ^2. SeqA ассоциируется только с одним слабо GATC последовательностей, но он образует комплексы высокого сходства с ДНК-дуплексов, содержащих несколько GATC сайтов. Минимальные функциональные и структурные единицы SeqA представляет собой димер, тем самым объясняя требование по крайней мере два GATC последовательности, чтобы сформировать высоким сродством комплексе с ДНК hemimethylated ^3. Кроме того, архитектура SeqA, с олигомеризации и ДНК-связывающих доменов, разделенных гибкий линкер, позволяющий привязки к GATC повторов, разделенных до трех винтовых поворотов. Таким образом, понимание функции SeqA на молекулярном уровне требует структурного Anaлизис SeqA связан с несколькими GATC последовательности. В белок-ДНК кристаллизации, ДНК может иметь никто не исключительный эффект на упаковке взаимодействий в зависимости от относительных размеров и архитектуры белков и ДНК. Если белка больше, чем ДНК или отпечатки большая часть ДНК, кристаллической упаковки в первую очередь опосредовано белок-белковых взаимодействий. И наоборот, когда белка такое же или меньшего размера, чем ДНК или она покрывает лишь часть ДНК, ДНК-ДНК и ДНК-белковых взаимодействий доминировать кристаллической упаковки. Таким образом, кристаллизация белок-ДНК комплексов требует систематического скрининга ДНК ⁴ длины и ДНК концами (тупым или навес) ^5-7. В этом докладе мы опишем, как разрабатывать, оптимизировать, очистить и кристаллизуются hemimethylated дуплексов ДНК, содержащий тандем GATC повторяется в комплексе с димерный вариант SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R), чтобы получить кристаллы подходят для определения структуры.

Protocol

1. Очистки белков

Гибкий линкер подключения N-(олигомеризации) и C-терминал (связывание ДНК) областях SeqA средствами признание hemimethylated GATC повторяет отделена от одного до трех поворотов на ДНК. Для этого исследования мы использовали димерный вариант SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) с точечной мутации в N-концевой домен, который предотвращает дальнейшее олигомеризации и сокращенный линкера, который ограничивает связывания ДНК в тандеме GATC повторяет отделена исключительно один оборот на ДНК (рис. 1) ^2,8.

1. Преобразование BL21 (DE3) с плазмидой SeqA кодирования под контролем промотора T7,
2. Пл....

Discussion

Одна из самых больших проблем в макромолекулярных рентгеновской кристаллографии является получение кристаллов дифракция качества. В случае белок или белок-ДНК комплексов, эта задача осложняется из-за дополнительных переменных, которые должны быть оптимизированы. Широко распространено мнение, что длина ДНК и наличия липкие выступы для повышения объединение соседних молекул ДНК в более псевдо-дуплекс являются основными параметрами для оптимизации. Тем не менее, мы показали, что характер и продолжительность этих выступов м.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Catalogue #	Комментарии (по желанию)
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500
Dithiotheitrol (DTT)	Bio Basic Инк	DB0058
NaCl	Bioshop	SOD002.10
Глицерин	Caledon	5350-1
Сахароза	Sigma-Aldrich	S5016-500G
Додецилсульфата натрия (SDS)	Bioshop	SDS001.500
Мочевина	Bioshop	URE001.5
40% 29:1 Bis / акриламида	Bio Basic Инк	A0007-500мл	Хранить при температуре 4 ° C
Борная кислота	EMD	BX0865-1
Ксилол cyanol FF	Bio-Rad	161-0423
Bromophenol синий	Bioshop	BR0222
Двойной регулируемый Вертикальная система Gel	CBC Научно Компания Инк	Препарат-250
Экран Индекс кристаллизации	Hampton исследований	HR2-144	Хранить при температуре 4 ° C
Мастер I кристаллизации экран	Emerald BioSystems	EBS-Wiz-1	Хранить при температуре 4 ° C
Мастер II кристаллизации экран	Emerald BioSystems	EBS-Wiz-2	Хранить при температуре 4 ° C
Классика кристаллизации экран	Qiagen	130701	Хранить при температуре 4 ° C
Intelliplate лотков	Искусство Robbins Instruments	102-0001-00
			Решения Белки очистки буфера: 100 мМ Трис, рН 8, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ DTT и 5% глицерина. Белки хранения буфер: 20 мМ Трис рН 8, 150 мМ NaCl, 5 мМ ДТТ, 0,5 мМ ЭДТА и 5% глицерина. Гель для загрузки смеси добавить 20 г сахара, 25 мг бромфеноловый синий, 25 мг ксилола cyanol FF, 1 мл 10% в / SDS и 10 мл 10X TBE до 70 мл автоклавного DDH 2 O. Перемешать с легкой нагревание до сахарозы растворяют и отрегулировать окончательноеобъем до 100 мл автоклавного DDH 2 O. Хранить при температуре 4 ° C. 2X буфером загрузки: добавить 11 г мочевины на 10 мл геля смесь нагрузки. Движение на горячей плите, пока мочевина растворяется. Алиготе в 2 мл пробирки и хранят при 4 ° C. 10X смесь PAGE: Mix 420,4 г мочевины, 100 мл 10X TBE (автоклавного), 250 мл 40%-бис 29:1 / акриламида в DDH 2 O. Перемешать, пока полностью растворяется и регулировать громкость до 1 литра. Хранить в темной бутылке при температуре 4 ° C. 10X КЭ: Растворите 108 г Трис, 55 г борной кислоты и 9,3 г ЭДТА в 1 литре DDH 2 O. Автоклав и хранить при комнатной температуре. Элюции буфером: развести 8 мл 5 М NaCl, 2 мл 1 М Трис, рН 7,5, 0,4 мл 0,5 М ЭДТА рН 8 на 200 мл DDH 2 O. Автоклав и хранить при комнатной температуре.