Method Article

Экспертиза тимуса позитивной и негативной селекции с помощью проточной цитометрии

DOI:

10.3791/4269

⸱

October 8th, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем проточной цитометрии на основе метода для изучения Т-клеточного развития В естественных условиях С использованием генетически модифицированных мышей дикого типа или Т-клеточного рецептора трансгенных фоне.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здоровая иммунная система требует, чтобы Т-клетки реагировали на чужеродные антигены, оставаясь при этом толерантными к аутоантигенам. Случайная перестройка локусов α и β рецептора Т-клеток (TCR) генерирует репертуар Т-клеток с огромным разнообразием специфичности антигенов, как собственных, так и чужеродных. Выбор репертуара во время развития тимуса имеет решающее значение для создания безопасных и полезных Т-клеток. Дефекты отбора тимуса способствуют развитию аутоиммунных и иммунодефицитных расстройств1-4.

Т-клетки-предшественники входят в тимус в виде двойных отрицательных (DN) тимоцитов, которые не экспрессируют CD4 или CD8 ко-рецепторы. Экспрессия αβTCR и обоих корецепторов происходит на двойной положительной (DP) стадии. Взаимодействие αβTCR с аутопептидом-MHC (pMHC), представленным клетками тимуса, определяет судьбу тимоцита DP. Высокоаффинные взаимодействия приводят к отрицательному отбору и элиминации самореактивных тимоцитов. Низкоаффинные взаимодействия приводят к положительному отбору и развитию CD4 или CD8 одиночных положительных (SP) Т-клеток, способных распознавать чужеродные антигены, представленные собственным MHC5.

Положительный отбор можно изучить у мышей с поликлональным (диким типом) репертуаром TCR, наблюдая за генерацией зрелых Т-клеток. Тем не менее, они не идеальны для изучения отрицательного отбора, который включает в себя делецию небольших антиген-специфических популяций. Многие модельные системы использовались для изучения отрицательного отбора, но различаются по своей способности повторять физиологические события6. Например, при стимуляции тимоцитов in vitro отсутствует среда тимуса, которая принимает непосредственное участие в отборе, в то время как введение экзогенного антигена может привести к неспецифической делеции тимоцитов7-9. В настоящее время лучшим инструментом для изучения in vivo отрицательного отбора являются мыши, экспрессирующие трансгенный TCR, специфичный к эндогенному аутоантигену. Однако многие классические трансгенные модели TCR характеризуются преждевременной экспрессией трансгенной цепи TCRα на стадии DN, что приводит к преждевременному отрицательному отбору. В нашей лаборатории разработана модельHY cd4, в которой трансгенный HY TCRα условно экспрессируется на стадии DP, что позволяет осуществлять отрицательный отбор при переходе от DP к SP, как это происходит у мышейдикого типа 10.

Здесь мы описываем протокол, основанный на проточной цитометрии, для изучения положительного и отрицательного отбора тимуса в мышиной модели HYcd4. В то время как отрицательный отбор у мышей HYcd4 является высокофизиологическим, эти методы также могут быть применены к другим трансгенным моделям TCR. Мы также представим общие стратегии анализа положительного отбора в поликлональном репертуаре, применимом к любым генетически манипулированным мышам.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

См. рисунок 1 для общей схемы экспериментальных протоколов.

1. Диссекция

  1. Место стерильной сито стали в 60 х 15 мм блюдо Петри. Одна единица необходима в образце ткани.
  2. Добавить 5 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) к каждому блюду. Держите блюда на льду.
  3. Усыпить мышей с CO 2.
  4. Безопасность мыши, чтобы вскрытие поверхности, брюшной стороной вверх. Спрей мышь с 70% этанола для стерилизации и для того, чтобы мех спутанными вниз.
  5. Использование хирургических ножниц, начать вскрытие, сделав вентральный разрез в брюшной кожу чуть выше половых органов. Расширить разрез вверх к подбородку.
  6. Из средней линии, расширить разрез вниз вдоль всех конечностей. Отойдите назад дряблая кожа и пин-код его до вскрытия поверхности.
  7. Урожай тимуса:
    1. Поднимите нижний кончик грудной кости, чтобы сделать разрез.
    2. Избежать печени, сократить диафрагму, чтобы отсоединить грудную клетку, а затем сократить грудной клетки с каждой стороны. Вырезать грудной клетки вверх на каждой стороне, избегая легких и сердца.
    3. Осторожно вытяните грудную клетку обратно щипцами. Тимус является белым, двухлопастный орган, расположенный над сердцем. Использование плоских края щипцы, чтобы понять, в нижней части доли, осторожно потяните тимуса и разместить его на сито.
  8. Урожай селезенки:
    1. Селезенка является красный, доска для серфинга формы орган, расположенный в левой части брюшной полости мыши, ниже печень.
    2. Сделайте разрез в брюшной полости. Осторожно выньте селезенки с одной парой щипцов, используя вторую пару, чтобы дразнить от соединительной ткани. Поместите селезенки на отдельном экране сетку.

2. Сотовые подготовка

  1. Использование поршня от 3 шприца мл, молотьорганов в сито, пока только соединительная ткань и жир остается. Промойте сетку с HBSS от тарелки в три раза. Используйте новый поршень для каждого образца ткани.
    1. Другие опции для гомогенизации тканей может быть использован вместо этого метода.
  2. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
  3. Гранул клеток путем центрифугирования при 335 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
  4. Ресуспендируют спленоцитов в 500 мкл буфера для лизиса ACK (0,15 М NH 4 Cl, 10 ммоль KHC0 3, 0,1 мМ Na 2 ЭДТА, рН 7,2) в течение 10 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют тимоцитов при 20 х 10 6 клеток / мл в FACS буфере (PBS, 1% FCS, 0,02% азида натрия) и отложите на льду.
  5. Вернуться к спленоцитов изотоничность добавлением 5 мл HBSS. Гранул спленоцитов путем центрифугирования и ресуспендируют при 20 х 10 6 клеток / мл в буфере FACS. Если клетки должны оставаться стерильным, вы можете использовать стерильные RPMI + 10% FCS.

3.Окрашивание Клетки для проточной цитометрии

Цель этого протокола заключается в определении стратегии для анализа положительного и отрицательного отбора с использованием дикого типа (WT) и HY CD4 мышей. Для общего соображения, касающиеся проточной цитометрии опытно-конструкторских, приобретение и анализ, мы отсылаем читателя прекрасный обзор Тун и др. 11.

  1. Алиготе 4 х 10 6 тимоцитов в поток пробы цитометрии в каждую лунку 96-луночный планшет, а также 1 х 10 6 WT спленоцитов на компенсацию управления. При использовании трансгенных мышах, вы должны включить WT мыши в качестве контроля в эксперименте.
  2. Блок Fc рецепторов путем инкубации клеток с anti-CD16/32 (клон 2.4G2) в течение 10 мин на льду.
  3. Побочные пластины при 335 мкг при 4 ° С в течение 5 мин. Снимите крышку и развеять жидкости из скважин, щелкая пластины один раз, лицом вниз в раковину. Ресуспендируют каждую лунку в 200 мкл буфера FACS. Повторите мыть.
  4. Подготовка антител коктейли, которые перечислены ниже, используя оптимальную концентрацию каждого антитела при разведении в 200 мкл FACS буфера на лунку. Оптимальная концентрация каждого антитела определяется как самая низкая концентрация необходима, чтобы дать крупнейших разделению положительных и отрицательных населения. Если нет отрицательных населения для данного антитела, антитела изотипа должны быть включены. Общий объем в скважине может быть уменьшено (например, до 100 мкл на лунку), если это необходимо.
    1. WT тимуса: анти-TCRβ, анти-CD4, CD8 анти-, анти-CD69 или анти-CD5, анти-CD24
    2. HY CD4 тимуса: анти-HY TCR (T3.70), анти-CD4, CD8 анти-, анти-CD69 или анти-CD5, анти-CD24
      Для получения лучшего разделения CD69 и CD69 вот привет населения в тимоцитов, рекомендуется биотинилированного анти-CD69 антитела первичного быть использованы, а затем вторичное пятно содержащие флуорохромом сопряженных стрептавидином. Мы ŭсебе ту же стратегию для CD5 окрашивания.
  5. Инкубируйте клеток с 200 мкл антител коктейль в буфер FACS в течение 30 минут на льду в темноте.
  6. Одновременно с антителом окрашивания коктейль, пятно каждый компенсацию управления с одной флуорохромом-конъюгированных антител. В идеале, компенсация окрашивания включает те же антитела, используемые в смесь антител. Тем не менее, окрашивание для каждого отдельного антигена не может быть возможным для больших экспериментов, когда многие антигенов в настоящее время анализируют. Таким образом, окрашивание или для анти-CD4 или анти-CD8 рекомендуется из-за высокой экспрессии этих антигенов, или использование компенсации бисера. Пятно в буфере FACS в течение 30 минут на льду в темноте. Оставьте одну компенсацию контроля незапятнанным.
  7. Вымойте клетки дважды с буфером FACS.
  8. Ресуспендируют клеток в FACS буфера и передача FACS труб.
  9. Получить образцы на проточной цитометрии. Включая приобретение FSC-и FSC-Зllow для дублета дискриминации.

4. Анализ данных проточной цитометрии - Non-TCR трансгенных мышей

Мы используем FlowJo для анализа потока цитометрии данных. См. рисунок 2А для стробирования стратегия для не-TCR трансгенных мышей.

  1. Использование FSC-на SSC, электронным затвором на «лимфоцитов» населения.
  2. В "лимфоцитов" населения, использование FSC-ЛПС-W в электронном ворота FSC-W население вот, чтобы исключить ячейки дублетов и aggregrates. Это "синглетно" ворот.
  3. Использование событий в «синглетных» ворота, участок CD8 на CD4. Ничья ворота для DN, DP скучно, DP яркие, CD4 + CD8 вот, CD4SP и CD8SP населения как показано на рисунке 2B.
  4. Под CD4SP и CD8SP ворота, создать TCRβ по CD24 участков. Используйте инструмент квадрант стробирования сделать ворота, как показано на рисунке 2C.
  5. Создать пеW сюжет из "синглетно" ворот: TCRβ по CD69. Ничья ворот A, B, C, D, как показано на рисунке 2D.
  6. Создайте еще один сюжет из "синглетно" ворот: TCRβ по CD5. Ничья ворота I, II, III, IV, как показано на рисунке 2E. Это еще одна стратегия для изучения положительного отбора.
  7. Применить DN, DP скучно, DP яркие, CD4 INT, CD4SP и CD8SP ворота из-под «синглетных» к воротам I, II, III, IV, A, B, C, D (рис. 2Д, Е).
  8. Подсчитайте количество клеток в определенное подмножество путем умножения органа клеточности на частоту каждого последующего ворот, пока не достигнете целевых групп населения. Например, число TCRβ привет CD69-CD8SP тимоцитов будет определяться тимуса клетками х% TCR BHI CD69-(фракция Д) х% CD8SP.
    1. Подсчет уже учитывает живых и мертвых клеток, поэтому не включать "lymphocyte "воротами в своих расчетах.

5. Анализ данных проточной цитометрии - TCR трансгенных мышей

См. Рисунок 3A для стробирования стратегии TCR трансгенных мышей.

  1. Выполните шаги 4.1 и 4.2, как и в предыдущем разделе.
  2. Под "синглетно" ворот, создать T3.70 по SSC сюжет и ворота на T3.70 + популяции клеток для анализа антиген-специфические Т-клетки (рис. 3В). В некоторых случаях, это может быть интересно сравнить это население не-антиген специфический (T3.70-) населения Т-клеток.
  3. В T3.70 + населением, ничья DN, DP, CD4SP и CD8SP ворота (рис. 3).
    1. Для WT контрольные образцы, сделать эти ворота под "синглетно" ворот или создать T3.70 ворота, как там будет очень мало T3.70 + клеток.
  4. Под воротами CD8SP, создатьT3.70 по CD24 сюжет. Используйте инструмент квадрант стробирования разделить клеток в четырех популяций (рис. 3F).
  5. Создание наложения гистограммы изображающие CD69 выражение в отделении ДП WT мышей и T3.70 + DP отсек HY CD4 мыши (рис. 4а). Повторите для изучения CD5 выражении (рис. 4В).
  6. Рассчитать абсолютное количество клеток в каждом подмножестве интерес как в 4.8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В физиологических TCR модели трансгенных мышей дикого типа и, положительный отбор начинается с DP яркий этап перед переходом в DP скучным этапом после встречи антигена. DP скучно тимоцитов затем ввести переходный CD4 + CD8 вот этапе, прежде чем стать CD4SP или CD8SP тимоцитов (рис. 2В). Пожилые тимоцитов SP характеризуются высокой экспрессией TCR и потеря CD24 (рис. 2С). В то время как CD8 CD4 по профилю можно выявить дефекты в пози...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, представленные здесь может быть использован для изучения положительного и отрицательного отбора в не-TCR трансгенных и TCR трансгенных мышей. Этот протокол описывает окрашивания поверхностных антигенов. Для дальнейшего анализа молекулярных механизмов, часто бывает необходимо выполнить внутриклеточного окрашивания. Мы используем BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit для большинства внутриклеточных белков и Foxp3 BD Biosciences Окрашивание Kit для транскрипционных факторов. Мы обычно приобретают наши образцы сра...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Bing Zhang за техническую помощь. Эта работа финансировалась Канадский институт исследований в области здравоохранения (MOP-86595). TAB является следователь CIHR новые и AHFMR Scholar. QH поддерживается CIHR Канаде Высшее Стипендия - докторских и AIHS Полный рабочий день студенчества. SAN при поддержке королевы Елизаветы II Высшее стипендии. AYWS поддерживается NSERC последипломного Стипендия - докторантуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
Сбалансированный солевой HyClone Хэнка решение Thermo Scientific SH30030.02
Экраны Металлическая сетка Cedarlane CX-0080-E-01
Чашки Петри (60 х 15 мм) Fisher Scientific 877221
Шприцы (3 мл) BD Biosciences 309657
Конических труб (15 мл) Sarstedt 62.554.205
Микроскоп Zeiss - Primo Star 415500-00xx-000
Гемоцитометр HausserНаучный 3110
96-луночный планшет Sarstedt 82.1582.001
Многоканальные пипетки Fisherbrand 21-377-829
Эмбриональной телячьей сыворотки PAA A15-701
Фосфатным буферным раствором Fisher Scientific SH3025802
Азид натрия IT Baker химической Co V015-05
FcR блокирующий реагент Клон 2.4G2
Anti-мышь HY TCR eBioscience XX-YY-9930 * Клон T3.70
Anti-мышь CD4 eBioscience XX-0042-год * Клон RM4-5
NTI-мышь CD8α eBioscience XX-0081-YY * Клон 53-6.7
Анти-CD24 мыши eBioscience XX-0242-YY * Клон M1/69
Anti-мышь TCRβ eBioscience XX-YY-5961 * Клон H57-597
Анти-CD69 мыши биотинилированного eBioscience 13-0691-YY * Клон H1.2F3
Anti-мышь CD5 биотинилированного eBioscience 13-0051-год * Клон 53-7.3
Стрептавидин eBioscience XX-4217-год *
Проточный цитометр BD Biosciences - FACS песни 338962
FACS труб BD Biosciences 352052
Проточной цитометрии анализа программного обеспечения TreeStar - Flowjo FlowJo v7 / 9
HyClone RPMI - 1640, Thermo Scientific SH30027.01

* XX варьируется в зависимости от флуорохромом и YY варьируется в зависимости от размера флакона.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
  2. Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
  3. Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
  4. Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
  5. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
  6. McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
  7. Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
  8. Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
  9. Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
  10. Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
  11. Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
  12. Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
  13. Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
  14. Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
  15. Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
  16. Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
  17. Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23(2010).
  18. Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
  19. Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
  20. McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
  21. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  22. Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
  23. Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
  24. Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
  25. Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
  26. Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
  27. Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
  28. Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
  29. Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  30. Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
  31. Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
  32. Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Thymic SelectionFlow CytometryT Cell DevelopmentPositive SelectionNegative SelectionDouble Positive ThymocytesSingle Positive T CellsTCR Transgenic ModelsAntibody Cocktail StainingHYcd4 Mouse Model

Related Articles