Экспертиза тимуса позитивной и негативной селекции с помощью проточной цитометрии

Summary

Мы представляем проточной цитометрии на основе метода для изучения Т-клеточного развития В естественных условиях С использованием генетически модифицированных мышей дикого типа или Т-клеточного рецептора трансгенных фоне.

Abstract

Здоровая иммунная система требует, чтобы Т-клетки реагировали на чужеродные антигены, оставаясь при этом толерантными к аутоантигенам. Случайная перестройка локусов α и β рецептора Т-клеток (TCR) генерирует репертуар Т-клеток с огромным разнообразием специфичности антигенов, как собственных, так и чужеродных. Выбор репертуара во время развития тимуса имеет решающее значение для создания безопасных и полезных Т-клеток. Дефекты отбора тимуса способствуют развитию аутоиммунных и иммунодефицитных расстройств^1-4.

Т-клетки-предшественники входят в тимус в виде двойных отрицательных (DN) тимоцитов, которые не экспрессируют CD4 или CD8 ко-рецепторы. Экспрессия αβTCR и обоих корецепторов происходит на двойной положительной (DP) стадии. Взаимодействие αβTCR с аутопептидом-MHC (pMHC), представленным клетками тимуса, определяет судьбу тимоцита DP. Высокоаффинные взаимодействия приводят к отрицательному отбору и элиминации самореактивных тимоцитов. Низкоаффинные взаимодействия приводят к положительному отбору и развитию CD4 или CD8 одиночных положительных (SP) Т-клеток, способных распознавать чужеродные антигены, представленные собственным MHC⁵.

Положительный отбор можно изучить у мышей с поликлональным (диким типом) репертуаром TCR, наблюдая за генерацией зрелых Т-клеток. Тем не менее, они не идеальны для изучения отрицательного отбора, который включает в себя делецию небольших антиген-специфических популяций. Многие модельные системы использовались для изучения отрицательного отбора, но различаются по своей способности повторять физиологические события⁶. Например, при стимуляции тимоцитов in vitro отсутствует среда тимуса, которая принимает непосредственное участие в отборе, в то время как введение экзогенного антигена может привести к неспецифической делеции тимоцитов^7-9. В настоящее время лучшим инструментом для изучения in vivo отрицательного отбора являются мыши, экспрессирующие трансгенный TCR, специфичный к эндогенному аутоантигену. Однако многие классические трансгенные модели TCR характеризуются преждевременной экспрессией трансгенной цепи TCRα на стадии DN, что приводит к преждевременному отрицательному отбору. В нашей лаборатории разработана модель^{HY cd4}, в которой трансгенный HY TCRα условно экспрессируется на стадии DP, что позволяет осуществлять отрицательный отбор при переходе от DP к SP, как это происходит у мышей^{дикого типа 10}.

Здесь мы описываем протокол, основанный на проточной цитометрии, для изучения положительного и отрицательного отбора тимуса в мышиной модели HY^cd4. В то время как отрицательный отбор у мышей HY^cd4 является высокофизиологическим, эти методы также могут быть применены к другим трансгенным моделям TCR. Мы также представим общие стратегии анализа положительного отбора в поликлональном репертуаре, применимом к любым генетически манипулированным мышам.

Protocol

См. рисунок 1 для общей схемы экспериментальных протоколов.

1. Диссекция

1. Место стерильной сито стали в 60 х 15 мм блюдо Петри. Одна единица необходима в образце ткани.
2. Добавить 5 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) к каждому блюду. Держите блюда на льду.
3. Усыпить мышей с CO _2.
4. Безопасность мыши, чтобы вскрытие поверхности, брюшной стороной вверх. Спрей мышь с 70% этанола для стерилизации и для того, чтобы мех спутанными вниз.
5. Использование хирургических ножниц, начать вскрытие, сделав вентральный разрез в брюшной кожу чуть выше половых органов. ....

Results

В физиологических TCR модели трансгенных мышей дикого типа и, положительный отбор начинается с DP ^яркий этап перед переходом в DP ^{скучным} этапом после встречи антигена. DP ^скучно тимоцитов затем ввести переходный CD4 ⁺ CD8 ^вот этапе, прежде чем стать CD4SP или CD8SP тимоцитов (рис. 2В). Пожилые тимоцитов SP характеризуются высокой экспрессией TCR и потеря CD24 (рис. 2С). В то время как CD8 CD4 по профилю можно выявить дефекты в пози.......

Discussion

Протокол, представленные здесь может быть использован для изучения положительного и отрицательного отбора в не-TCR трансгенных и TCR трансгенных мышей. Этот протокол описывает окрашивания поверхностных антигенов. Для дальнейшего анализа молекулярных механизмов, часто бывает необходимо выполнить внутриклеточного окрашивания. Мы используем BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit для большинства внутриклеточных белков и Foxp3 BD Biosciences Окрашивание Kit для транскрипционных факторов. Мы обычно приобретают наши образцы сра.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Сбалансированный солевой HyClone Хэнка решение	Thermo Scientific	SH30030.02
Экраны Металлическая сетка	Cedarlane	CX-0080-E-01
Чашки Петри (60 х 15 мм)	Fisher Scientific	877221
Шприцы (3 мл)	BD Biosciences	309657
Конических труб (15 мл)	Sarstedt	62.554.205
Микроскоп	Zeiss - Primo Star	415500-00xx-000
Гемоцитометр	HausserНаучный	3110
96-луночный планшет	Sarstedt	82.1582.001
Многоканальные пипетки	Fisherbrand	21-377-829
Эмбриональной телячьей сыворотки	PAA	A15-701
Фосфатным буферным раствором	Fisher Scientific	SH3025802
Азид натрия	IT Baker химической Co	V015-05
FcR блокирующий реагент			Клон 2.4G2
Anti-мышь HY TCR	eBioscience	XX-YY-9930 *	Клон T3.70
Anti-мышь CD4	eBioscience	XX-0042-год *	Клон RM4-5
NTI-мышь CD8α	eBioscience	XX-0081-YY *	Клон 53-6.7
Анти-CD24 мыши	eBioscience	XX-0242-YY *	Клон M1/69
Anti-мышь TCRβ	eBioscience	XX-YY-5961 *	Клон H57-597
Анти-CD69 мыши биотинилированного	eBioscience	13-0691-YY *	Клон H1.2F3
Anti-мышь CD5 биотинилированного	eBioscience	13-0051-год *	Клон 53-7.3
Стрептавидин	eBioscience	XX-4217-год *
Проточный цитометр	BD Biosciences - FACS песни	338962
FACS труб	BD Biosciences	352052
Проточной цитометрии анализа программного обеспечения	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7 / 9
HyClone RPMI - 1640,	Thermo Scientific	SH30027.01
			* XX варьируется в зависимости от флуорохромом и YY варьируется в зависимости от размера флакона.