Tissue Engineering кишечника в мышиной модели

Erik R. Barthel; Allison L. Speer; Daniel E. Levin; Frédéric G. Sala; Xiaogang Hou; Yasuhiro Torashima; Clarence M. Wigfall; Tracy C. Grikscheit

doi:10.3791/4279

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Tissue Engineering кишечника в мышиной модели

15.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4279

⸱

1 декабря 2012 г.

Erik R. Barthel¹ , Allison L. Speer¹ , Daniel E. Levin¹ , Frédéric G. Sala¹ , Xiaogang Hou¹ , Yasuhiro Torashima¹ , Clarence M. Wigfall¹ , Tracy C. Grikscheit¹

¹Children's Hospital Los Angeles, Division of Pediatric Surgery, Saban Research Institute, Keck School of Medicine of the University of Southern California

В этой статье

Краткое содержание

Эта статья и сопровождающие видео представляем наш протокол для создания тканевой инженерии кишечника у мышей, используя органоид единиц-на-эшафот подход.

Аннотация

Тканевой инженерии тонкой кишки (ТЭСИ) был успешно использован, чтобы спасти Льюиса крыс после массивной резекции тонкой кишки, что приводит к возвращению в предоперационном веса в течение 40 дней. ¹ В людях, массивные резекции тонкой кишки может привести синдром короткой кишки, функциональная malabsorptive состоянии, что дает значительную заболеваемость, смертность и расходы на здравоохранение в том числе парентерального питания зависимости, печеночная недостаточность и цирроз печени, и необходимость multivisceral трансплантации органов. ² В этой статье мы описываем и документировать наш протокол для создания тканевой инженерии кишечника в мышиной модели с многоклеточных единиц органоид-на-эшафот подход. Органоид единиц многоклеточные агрегаты, полученные из кишечника, которые содержат оба слизистой оболочки и мезенхимальных элементов, ³ отношениях между которыми сохраняется кишечного ниша стволовых клеток. ⁴ в текущих и будущих исследований, переход нашей техники вмышь позволит исследование процессов при формировании TESI с использованием трансгенных инструменты, доступные в этом виде. ⁵ наличие иммунитета линий мышей также позволит нам применить этот метод для человеческой ткани кишечника и оптимизации формирования человека как TESI мышь ксенотрансплантата до его перехода в людях. Наш метод использует надлежащей производственной практики (GMP) реактивы и материалы, которые уже были одобрены для использования в человеческих пациентов, и поэтому предлагает значительные преимущества по сравнению с подходами, которые полагаются на decellularized тканях животных. Конечной целью этого метода является его перевод на людей, как регенеративная медицина терапевтические стратегии синдром короткой кишки.

Протокол

1. Органоид Подготовка единиц

Приборы подходят для мыши рассечение (ножницы и щипцы) следует стерилизовать в автоклаве.
Гуманно усыпить мышей-доноров в соответствии с местными IACUC протоколов. Убедитесь, что животное мертво, прежде чем приступить.
Сделайте срединный разрез, чтобы получить доступ к брюшной полости. Кожных лоскутов может быть отражено, сколько необходимо для улучшения экспозиции.
Потрошение тонкой кишки и разделить его просто дистальнее связки Treitz. Отделите тонкую кишку от брыжейки с помощью острых и нежный тупой диссекции. Определить илеоцекального соединения и разделить тонкой кишки 5 мм проксимальнее этого.
Используя ножницы, открыть кишки продольно вдоль границы antimesenteric в чашку Петри с 10 мл 4 ° C, буферный раствор стерильно Хэнкса (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X антибиотиками противогрибковых (анти-анти, Invitrogen) решение. Очистить фекалии из открытых кишки состорожном перемешивании затем передать открыл кишечника в 15 мл центрифужные пробирки с 10 мл 4 ° C, стерильные HBSS / 1X анти-анти.
Вымойте открыл кишечника в три раза по 10 мл 4 ° C, стерильные HBSS / 1X анти-анти в пробирке. Каждое мытье может быть выполнен с мягкой встряхивания 15 мл трубки на 30 сек. После встряхивания ткани кишечника опускается на дно пробирки. Откажитесь плавучего материала, который является мезенхимальных мусора. Удалите моющий раствор тщательно с пипеткой.
Фарш промытые кишки в чашку Петри с 10 мл 4 ° C, стерильные HBSS / 1X анти-анти менее 1 мм квадратной части, используя ножницы. Сбор фарш материала с автоматической пипеткой и поместите его в пробирку.
Центрифуги трубы на 500 оборотов в минуту в течение 8 мин. Удалите супернатант, который содержит жиров и мезенхимы.
Дайджест фарш, промытый материал с 10 мл стерильного HBSS / 1X анти-анти плюс 0,125 мг / мл диспазы (Invitrogen) и 800 единиц / мл коллагеназы типа 1 (Worthington, Lakewood Нью-Джерси). Для подготовки 40 мл пищеварения решение, взвесить 5 мг диспазы, 142 мг коллагеназы, а также добавить стерильную HBSS до объема 40 мл. Подготовка этого решения недавно каждого единиц времени органоид готовы, и хранить при температуре 4 ° С до готовности к использованию. Добавить пищеварения решение непосредственно в гранулах, начиная с шага 1.8.
Инкубируйте пробирку с фаршем, промытого материала с пищеварением раствора при 37 ° С в течение 20 мин.
Получить пробирку и дальше нарушать переваривается ткани растиранием с 10 мл пипетки. Повторить от 20 до 50 раз, пока не однородный вид получается.
Центрифуга пробирку в течение 5 мин при 800 оборотах в минуту. Удалите супернатант, содержащий отдельные клетки.
Остановить пищеварения реакции с 10 мл 4 ° C, стерильные Дульбекко изменения Eagle Medium (DMEM, Invitrogen) плюс 10% об / об инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (HI-FBS, Invitrogen). Ресуспендируют Pelleт и встряхните пробирку.
Центрифуга пробирку в течение 5 мин при 800 оборотах в минуту. Удалить супернатант тщательно с автоматической пипеткой до последних нескольких капель. Используйте одноразовые пластиковые пипетки в течение последних нескольких капель, чтобы избежать ресуспендированием гранул.

2. Загрузка полигликолевой кислоты Эшафот

Форму 2-мм, 5-мм наружный диаметр цилиндрической леса из нетканых полигликолевой кислоты (2-мм толщины листа, 60 мг см-3 объемная плотность, пористость> 95%, Concordia волокна, Ковентри, Род-Айленд), как описано в работе. 4.
Обрежьте дистальных 2 мм одноразовых 1000 мкл пипетки наконечник с ножницами подготовлены с 70% этанола в дистиллированной воде.
Поместите на эшафот в 4-культуры и пластины. Загрузите органоид единиц на эшафот с 1000 мкл пипетки, сначала в просвет, а затем на внешней поверхности. Используйте пинцет, чтобы обеспечить покрытие просвета. Не нарушать или взломать цилиндрической формы полимера.

3. Имплантация в хост мышь

Используйте сингенных мышей хозяин на том же фоне, как донор, если доступно. В противном случае, используется ослабленным иммунитетом ожирения диабетической / тяжелым комбинированным иммунодефицитом или NOD / SCID животных (Jackson Laboratories, Sacramento, CA).
Вызвать общей анестезии с изофлурана. Бритье, подготовки и драп живота мыши.
Сделайте 5 мм срединный разрез, чтобы получить вход в брюшную полость. Выявление и тщательно потрошить большого сальника. Поместите загруженный полимера на сальника и заверните его в ткань. Не рвите сальника.
Закрепить полимера сальника с 5-0 шва Monocryl. Аккуратно поставьте сальник с обернутые полимера в свое анатомическое положение.
Закройте разрез брюшной стенки в 4-0 слоев с помощью Викрил швов. Запустите мышцы закрытия и заботиться, чтобы не травмировать брюшной полости ниже разреза. Используйте узловыми швами для кожи.
Администрирование послеоперационного обезболивания с 2 мг / кг кетопрофен (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) в стерильной воде, как волдырь подкожной рядом с разрезом. Животные должны быть оценены ежедневно, и если животное демонстрирует признаки боли или страдания, дополнительные дозы кетопрофена могут быть введены на пост операционного дня 2. На третий день после операции животное должно быть полностью выздоровели без признаков боли или страданий. Если боль или страдание продолжается послеоперационный 3-й день, это считается ненормальным и должны быть рассмотрены в соответствии с IACUC и животных протоколов учреждение.
Разрешить мыши, чтобы восстановиться и тканевой инженерии кишечника расти в течение четырех недель. Дайте животным без ограничений объявление доступ к грызунов (лабораторных Диета 5001, PMI питания, Сент-Луис MO) и воды с Septra 200 мг / 40 мг в 5 мл (Привет-Tech Pharmacal, Amityville Нью-Йорк) в разведении 1:100.

4. Урожай

HumaНели усыпить животное-хозяина через четыре недели после имплантации.
Вновь оригинальный разрез и отражают кожи краниально для облегчения доступа к брюшной полости.
Откройте мышечного слоя и определить тканевой инженерии конструкции, как шар ткани.
Снимать спаек в конструкцию, внутрибрюшное внутренностей с помощью острых рассечение.
Закрепить конструкцию в формалине для последующего монтажа парафин, или использовать ткани свежей для биохимических анализов, таких как ПЦР в реальном времени или белки изоляции.