Количественный анализ хроматина протеомов в болезнь

Emma Monte; Haodong Chen; Maria Kolmakova; Michelle Parvatiyar; Thomas M. Vondriska; Sarah Franklin

doi:10.3791/4294

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественный анализ хроматина протеомов в болезнь

12.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4294

⸱

28 декабря 2012 г.

Emma Monte¹ , Haodong Chen¹ , Maria Kolmakova¹ , Michelle Parvatiyar¹ , Thomas M. Vondriska¹^,²^,³ , Sarah Franklin¹^,⁴

¹Department of Anesthesiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, ²Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at UCLA, ³Department of Physiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, ⁴Department of Internal Medicine, Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah

Авторы для переписки: Sarah Franklin <franklin@cvrti.utah.edu>

В этой статье

Краткое содержание

Достижения в области масс-спектрометрии позволило высокой пропускной анализ экспрессии белка и изменения в целый ряд тканей. В сочетании с субклеточных фракционирования и болезни модели, количественные масс-спектрометрии и биоинформатика может выявить новые свойства в биологических системах. Метод, описанный здесь анализ хроматин-ассоциированных белков в условиях болезни сердца и легко применим и к другим В естественных условиях Моделей человеческих заболеваний.

Аннотация

В ядре находятся протеомов, функции которых наиболее тесно связана с генной регуляции. Взрослых млекопитающих ядер кардиомиоцитов являются уникальными в связи с высоким процентом двуядерных клеток, ¹ преимущественно гетерохроматиновых состояния ДНК, и без деления характера кардиомиоцитов взрослого, который оказывает ядер в постоянном состоянии интерфазы ^2. Регуляция транскрипции в процессе разработки и Болезнь была хорошо изучена в этом органе, ^3-5, а то, что остается относительно неисследованной является роль, которую играют ядерные белки, отвечающие за упаковку ДНК и экспрессии, и как эти белки контролировать изменения в транскрипционной программы, которые происходят во время болезни. ⁶ В развитых мира, болезнь сердца является причиной номер один смертности для мужчин, так и женщин. ⁷ Insight о том, как ядерные белки сотрудничать регулировать прогрессирование этого заболевания имеет решающее значение для продвижения современного лечения Options.

Масс-спектрометрия является идеальным инструментом для решения этих вопросов, поскольку оно позволяет объективно аннотации ядерного протеома и относительное количественное о том, как обилие этих белков изменяется с болезнью. Хотя было несколько протеомных исследований для млекопитающих ядерные белковые комплексы, ^8-13 до недавнего времени ¹⁴ было только одно исследование изучения сердечных ядерной протеома, и это считается всего ядра, а не изучения протеома на уровне отсеков АПЛ ^15. В значительной степени этот недостаток работы связано с трудностью выделения сердечной ядер. Сердечная ядер происходит в жесткой и плотной актин-миозин аппарат, к которому они подключены через несколько расширений эндоплазматической сети, в той степени, миоцитов изменяет сокращение их общей форме ^16. Кроме того, кардиомиоцитов на 40% митохондрий по объему ^17, который necessitaTES обогащения ядро отдельно от других органелл. Здесь мы опишем протокол для сердечной обогащению урана и дальнейшего фракционирования в биологически соответствующие отсеки. Кроме того, мы подробно методы этикетки без количественного масс-спектрометрического рассечение этих фракций, методы поддаются в естественных условиях эксперименты в различных животных моделях и систем органов, где метаболические маркировке не представляется возможным.

Протокол

Экспериментальные рабочий процесс содержит семь основных этапов (рис. 1). Для любых работ, связанных с образцами, которые будут работать на масс-спектрометре, экспериментатор должен носить халат, перчатки и волосы чистые и заботиться, чтобы избежать загрязнения от пыли и личных пролития кератина.

1. Усреднение сердца и ядерной изоляции

Мышь сердца гомогенизируют и нетронутой ядер гранул выделяется (рис. 2).

Жертва взрослой мыши, акцизы сердце, промыть в ледяной PBS, и гомогенизируют на льду в стеклянной Dounce (мы предпочитаем Grinder Wheaton Ткань из Фишера, № 08-4....