Выращивание и инъекции<em&gt; Manduca Sexta</em&gt; Личинки для оценки бактериальной вирулентности

Elizabeth Hussa; Heidi Goodrich-Blair

doi:10.3791/4295

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выращивание и инъекции

12.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4295

⸱

11 декабря 2012 г.

Elizabeth Hussa¹ , Heidi Goodrich-Blair¹

¹Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison

В этой статье

Краткое содержание

Метод, описанный здесь используется непосредственный впрыск энтомопатогенных бактерий в hemocoel из Manduca Sexta Личинками насекомых. M. Sexta Является коммерчески доступным и хорошо изученных насекомых. Таким образом, этот метод представляет собой простой подход к анализу хост-бактериальных взаимодействий с точки зрения одного или обоих партнеров.

Аннотация

Manduca sexta, широко известная как табачный бражник, считается серьезным сельскохозяйственным вредителем, питающимся пасленовыми растениями, включая табак и томат. Восприимчивость личинок M. sexta к различным видам энтомопатогенных бактерий^1-5, а также большой объем доступной информации об иммунной системе этого насекомого^6-8 и ожидаемая последовательность генома⁹ делают этот вид подходящим модельным организмом для изучения взаимодействий между хозяином и микробом в процессе патогенеза. Кроме того, личинки M. sexta относительно крупного размера, их легче манипулировать и содержать в лабораторных условиях по сравнению с другими восприимчивыми видами насекомых. Большой размер также облегчает эффективное извлечение тканей/гемолимфы для анализа ответа хозяина на инфекцию.

В данном методе описывается прямое введение бактерий в гемоцель (кровеносную полость) личинок M. sexta. Этот подход может быть использован для анализа и сравнения характеристик вирулентности различных видов бактерий, штаммов или мутантов путем простого мониторинга времени до гибели насекомого после инъекции. Метод был разработан для изучения патогенности видов Xenorhabdus и Photorhabdus, которые обычно ассоциируются с нематодами-переносчиками для проникновения в организм насекомого. Энтомопатогенные нематоды обычно заражают личинок через естественные пищеварительные или дыхательные отверстия, после чего вскоре высвобождают свои симбиотические бактерии в гемолимфу (кровь) насекомого¹⁰. Описанный здесь метод инъекции исключает необходимость в нематоде-переносчике, тем самым разделяя эффекты воздействия бактерий и нематод на насекомое. Данный метод позволяет точно подсчитать количество инфекционного материала (клеток или белка) в инокуляте, что невозможно при использовании других существующих методов анализа энтомопатогенеза, включая метод надреза (nicking)¹¹ и тесты на пероральную токсичность¹². Кроме того, тесты на пероральную токсичность позволяют оценить вирулентность секретируемых токсинов, введенных в пищеварительную систему личинок, тогда как метод прямой инъекции позволяет оценить вирулентность инокулятов из целых клеток.

Полезность метода прямого введения, описанного здесь, заключается в анализе бактериального патогенеза путем мониторинга смертности насекомых. Однако данный метод может быть легко расширен для изучения влияния инфекции на иммунную систему M. sexta. Насекомое реагирует на инфекцию посредством как гуморальных, так и клеточных ответов. Гуморальный ответ включает распознавание бактериальных паттернов и последующую выработку различных антимикробных пептидов⁷; экспрессию генов, кодирующих эти пептиды, можно отслеживать после прямого заражения с помощью экстракции РНК и количественной ПЦР¹³. Клеточный ответ на инфекцию включает нодуляцию, инкапсуляцию и фагоцитоз инфекционных агентов гемоцитами⁶. Для анализа этих реакций подвергнутых инъекции насекомых можно препарировать и исследовать с помощью микроскопии^{13, 14}.

Протокол

1. Насекомое стерилизации яйцо и воспитания

Подготовка диета по первой автоклавирования 15 г при условии, агар в 900-1000 мл H ₂ O. Сразу же после автоклавирования, смешайте с 166 г пшеничного зародыша диеты и растушуйте в лаборатории блендере. Налейте в чашку (или блюд), чтобы охладиться, а затем перенести диету, чтобы алюминиевой фольги, плотно завернуть и хранить при 4 ° C.
Прибыв на место, стерилизовать M. Sexta яйца с 250 мл 0,6% раствором хлорной извести в течение 2-3 мин в стакане держатель фильтра и устройства термос с 90 мм фильтровальной бумаги, периодически помешивая.
Включите вакуум для слива раствором хлорной извести и мыть яйца 3-4 раза по 250 мл стерильной дистиллированной H ₂ O в стирке.
Передача яйца свежие 90 мм фильтровальной бумаги помещают в чашку Петри крышкой и дайте им высохнуть, пока они не слипаются (около 20-30 минут).
Передача яйца на нижнюю часть пластиковых контейнеров с насекомыми диеты, размещение около 40 яиц в каждом контейнере(Рис. 1А). Яйца отделить от диеты, чтобы предотвратить попадание влаги вызванных грибковыми загрязнения. Поддерживать яйца при температуре 26 ° C с 16 часов света: 8 часов темного фотопериода. Яйца будут гореть до желтовато-белого цвета до вылупления.
Когда инкубационное завершена, тщательно передать около 25 личинок каждый новый контейнеров с диетой на дне (рис. 1б). Важно, чтобы подобрать каждому личинки длинный черный рог с помощью щипцов, чтобы избежать причинения им вреда во время их хрупкие ранних стадиях развития. Выдержите в течение 2 дней, как указано выше. В то время как личиночная смерти необычным на этом этапе, некоторые мертвы, или, что более вероятно, связано с развитием чахлые личинки могут быть обнаружены. Такие насекомые должны быть исключены из дальнейшего исследования и пожертвовал при замораживании.
Чтобы избежать людоедских поведения, передача личинок отдельных контейнерах с небольшими кусочками пищи (рис. 1С) и инкубировать как указано выше. Мониторинг развития насекомых, заменяя пищи и чистки кал OÜт контейнеров каждый день, пока они проходят третьей линьки личиночной (обычно 6-9 дней после вылупления). Это ^4-го возраста личиночной стадии, характеризуется появлением черного крюка, как крючком на каждом proleg и повышение известности полосами вдоль тела насекомого (рис. 1D). Личинки могут значительно отличаться по размеру, но обычно весят 0,15-0,4 г при входе в ^4-й этап возраста. Личинки же размера должны быть выбраны для инъекций.

2. Подготовка Бактерии для инъекций

Расти бактериальный штамм (ы) должны быть испытаны в соответствии со стандартными процедурами в фазе роста вы хотите проверить.
Пелле 500 мкл каждого штамма бактерий должна быть протестирована на спиннинг в течение 2 мин в микроцентрифуге при 13000 оборотов в минуту при комнатной температуре.
Ресуспендируют клеток в 1 мл стерильной 1x фосфатным буферным раствором (PBS) и гранул снова, как и выше.
Ресуспендируют клеток в 0,5 мл стерильного 1x PBS и измеренияУбедитесь, что оптическая плотность (ОП) суспензии. Развести всех суспензий на тот же диаметр, если это необходимо. Стерильные питательные среды также может быть использован для ресуспендирования клеток и растворение в месте 1x PBS, если это необходимо.

3. Инъекции из ^4-й Личинки Instar

Подготовьте серийный 10-кратном разведении первого бактериального штамма в 6 скважинах 96-луночный планшет в стерильные 1x PBS, используя свежие кончика пипетки для каждого разведения (рис. 2A). Конечный объем клеточной суспензии в каждую лунку должно превышать объем, необходимый для инъекций (10 мкл на насекомых), а также 20 мкл к пластине посевной (см. шаги 3,2 и 3,7).
Пятно 10 мкл каждого разведения в течение 5 (10 ^-2 через 10 ^-6) в верхней части чашки Петри содержащие соответствующую среду роста. Наклоните пластину так, что пятна распространились в центре (рис. 2В).
Удалите насекомых диеты и кала и место насекомых в контейнерах на льдуоколо 5 мин.
Стерилизовать иглу шприца путем промывки 3 раза в каждом 2 трубки 70-100% этанола, после чего одна трубка стерильной H ₂ O (рис. 2). Объем жидкости должен быть достаточным, чтобы погрузить иглу.
Количественной разбавленных суспензий под микроскопом с помощью гемоцитометра. В зависимости от желаемого посевной, привлечь 10 мкл из соответствующей микропланшетным (рис. 2D).
Тампон насекомых поверхность с 95% этанола и вводят 10 мл клеточной суспензии в насекомое под углом (меньше 45 °) за одно из брюшных ног. Будьте осторожны, не прокол кишечника и вводить содержимое прямо под слой эпидермиса (рис. 2E). Хотя некоторые потери гемолимфы (ясно, зелено-голубой жидкости) это нормально, твердых частиц и желтая жидкость выходит из места инъекции указывают на кишечнике прокол. Если это произойдет, пожертвовать насекомых и получить новую личинку повторнопоместить его.
Повторите шаг 3,6 для каждой оставшейся насекомых в первой группе инъекций. Иглы стерилизация не нужна между насекомыми вводится с той же разбавления и штамм бактерий, если загрязнение происходит. Кроме того, повторяющиеся дозатор может быть использован для большей последовательности в объем впрыска среди образцов.
После введения каждого насекомого с первого штамма бактерий, повторите шаг 3.2, на этот раз кровянистые выделения клеточной суспензии в середине плиты и дать им потока в нижней (рис. 2F). Инкубируйте пластины при соответствующей температуре и рассчитывать колонии для перечисления посевной. Этот второй шаг покрытие используется для проверки того, что образцы не загрязнены во время процесса впрыска, так как это может привести к разрозненных номеров колонии между первым и вторым гальванопокрытия.
Повторите шаги с 3,1 по 3,8 для каждого штамма бактерий в эксперименте. И, наконец, вводят 3-5 насекомых стерильной 1x PBS использованием стерИль иглу в качестве отрицательной контрольной группы. Инкубируйте насекомых при 26 ° C с 16 часов света: 8 часов темного фотопериода.
Мониторинг насекомых выживание в течение долгого времени после инъекции. Насекомое смерти характеризуется как отсутствие произвольных движений при стимуляции. Насекомые часто демонстрируют потерю аппетита, диарея (водянистые, желтые экскрементов), и / или потери воды ("потение") во время инфекции до смерти, эти характеристики могут быть Стоит отметить также.