Визуализация Бактерии в Нематоды использованием флуоресцентной микроскопии

Summary

Для изучения взаимности между Xenorhabdus Бактерий и Steinernema Нематод, были разработаны методы для контроля бактериальной наличие и расположение в пределах нематод. Экспериментальный подход, который может быть применен к другим системам, влечет за собой инженерные бактерии, чтобы выразить зеленый флуоресцентный белок и визуализации, с помощью флуоресцентной микроскопии бактерий в прозрачном нематоды.

Abstract

Симбиозы, совместное проживание двух или более организмов, широко распространены во всех царствах жизни. Будучи двумя наиболее распространенными организмами на Земле, нематоды и бактерии образуют широкий спектр симбиотических ассоциаций, которые варьируются от полезных до патогенных ^1-3. Одной из таких ассоциаций является взаимовыгодная связь между бактериями Xenorhabdus и нематодами Steinernema, которая возникла в качестве модельной системы симбиоза ⁴. Нематоды Steinernema являются энтомопатогенами, использующими своего бактериального симбионта для уничтожения насекомых ⁵. Для передачи между насекомыми-хозяевами бактерии колонизируют кишечник заразной ювенильной стадии ^{нематоды 6-8} стадии. Недавно было показано, что несколько других видов нематод используют бактерии для уничтожения насекомых ^9-13, и начались исследования по изучению взаимодействия между нематодами и бактериями в этих системах ⁹.

Мы описываем метод визуализации бактериального симбионта внутри или на хозяине нематоды, используя преимущества оптической прозрачности нематод при наблюдении с помощью микроскопии. Бактерии спроектированы таким образом, чтобы экспрессировать флуоресцентный белок, что позволяет визуализировать их с помощью флуоресцентной микроскопии. Существует множество плазмид, которые несут гены, кодирующие белки, которые флуоресцируют на разных длинах волн (например, зеленом или красном), и конъюгация плазмид из донорского штамма Escherichia coli в бактериального симбионта является успешной для широкого спектра бактерий. Описанные методы были разработаны для изучения ассоциации между Steinernema carpocapsae и Xenorhabdus nematophila ¹⁴. Аналогичные методы были использованы для исследования других ассоциаций нематод и бактерий ^9,15-18, и поэтому этот подход является общеприменимым.

Метод позволяет охарактеризовать присутствие и локализацию бактерий среди нематод на разных стадиях развития, обеспечивая понимание природы ассоциации и процесса колонизации 14,16,19. Микроскопический анализ показывает как частоту колонизации в популяции, так и локализацию бактерий в тканях хозяина 14,16,19-21. Это является преимуществом по сравнению с другими методами мониторинга бактерий в популяциях нематод, такими как ультразвуковая обработка ²²или измельчение ²³, которые могут обеспечить средние уровни колонизации, но не могут, например, отличать популяции с высокой частотой низкой нагрузки симбионтов от популяций с низкой частотой высокой нагрузки симбионтов. Различение частоты и нагрузки колонизирующих бактерий может быть особенно важным при скрининге или характеристике бактериальных мутантов по фенотипам колонизации ^21,24. Действительно, флуоресцентная микроскопия использовалась для высокопроизводительного скрининга бактериальных мутантов на дефекты колонизации ^17,18 и является менее трудоемкой, чем другие методы, включая ультразвуковую обработку 22,25-27 и диссекцию отдельных нематод ^28,29.

Protocol

1. Строительство Флуоресцентные бактериальный штамм с помощью сопряжения

1. Расти получателя деформации (симбионт должны быть рассмотрены) и доноров штамм в течение ночи. Донор деформации, как правило, кишечная палочка, должны быть способны отдавать ДНК через сопряжение и должны быть трансформированы плазмидой (табл. 2), который несет ген, кодирующий флуоресцентный белок. В зависимости от плазмиды штамма сопряжения помощник может также потребоваться. Если так, то это напряжение должно быть также выращивали в течение ночи. Штамма донора и вспомогательные деформации должны быть выращены с антибиотиками, чтобы выбрать для поддержания пл....

Discussion

Протокол, описанный здесь, предоставляет метод для оптического обнаружения бактерий в нематодой хост (рис. 1). Этот метод использует оптическую прозрачность нематод и способности флуоресцентной меткой бактерий, что позволяет в естественных условиях анализа бактерий в нематодой хост (рис. 3). В частности, этот подход определяет бактериальной локализации в рамках своего хозяина. Путем подсчета населения нематод и очки для бактериального присутствия, частота бактериальной колониза.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Липидный Агар (Стерильные)			8 грамм питательного бульона, 15 г агара, 5 граммов экстракта дрожжей, 890 мл воды, 10 мл 0,2 г / мл MgCl 2. 6H 2 0, 96 мл кукурузного сиропа решение *, 4 мл кукурузного масла * Движение средств массовой информации при заливке плиты * Добавить стерильную ингредиента после автоклавирования
Решение кукурузный сироп (Стерильные)			7 мл кукурузного сиропа, 89 мл воды смеси и автоклава
Яйцо решение			16,6 мл 12% гипохлорит натрия, 5 мл 5М KOH, 80 мл воды
Отвар лизогении (Стерильные)			5 г дрожжевого экстракта, 10 г триптон, 5 г соли, 1 л воды смеси и автоклава
Микроцентрифуге	Рыбак	13-100-675	Любой микроцентрифужную, который держит микроцентрифуге трубы будет работать
Центрифугировать	Beckman	366802	Большой центрифуги верхней таблице, которая содержит 15 мл и 50 мл конические пробирки
Стерильные 60 мм X 15 мм чашку Петри	Рыбак	0875713
50 тюбиков мл центрифуги	Рыбак	05-539-6
15 ламп мл центрифуги	Рыбак	05-531-6
Стерильные 100 мм X 20 мм чашку Петри	Рыбак	0875711Z	Глубже, чем стандартные чашки Петри
24-луночный планшет	Greiner Bio-One	662000-06
Микроскоп			Микроскоп необходимо люминесцентные возможности совместима с вашей флуорофора
Параформальдегид	Электрон наук микроскопии	15710
PBS (Стерильные)			8 г NaCL 0,2 г хлорида калия 1,44 г Na 2 HPO 4 0,24 г KH 2 PO 4 1 л воды Отрегулируйте рН 7,4 и воды до 1 л и автоклав
Микроцентрифуге труб	Рыбак	05-408-138	2 мл или 1,5 мл пробирки
Шейкер			Любой шейкер, который вызывает жидкость осторожно двигаться будет работать
Диаминопимелиновой кислоты	Сигма	D-1377	При необходимости, дополнять средства массовой информации к концентрации или 1 мм