Для изучения взаимности между Xenorhabdus Бактерий и Steinernema Нематод, были разработаны методы для контроля бактериальной наличие и расположение в пределах нематод. Экспериментальный подход, который может быть применен к другим системам, влечет за собой инженерные бактерии, чтобы выразить зеленый флуоресцентный белок и визуализации, с помощью флуоресцентной микроскопии бактерий в прозрачном нематоды.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация Бактерии в Нематоды использованием флуоресцентной микроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Симбиозы — совместное проживание двух или более организмов — широко распространены во всех царствах живой природы. Нематоды и бактерии, являясь одними из самых повсеместно встречающихся организмов на Земле, образуют широкий спектр симбиотических ассоциаций: от взаимовыгодных до патогенных 1-3. Одной из таких ассоциаций являются взаимовыгодные отношения между бактериями Xenorhabdus и нематодами Steinernema, которые стали модельной системой изучения симбиоза 4. Нематоды Steinernema являются энтомопатогенными и используют своих бактериальных симбионтов для уничтожения насекомых 5. Для передачи между насекомыми-хозяевами бактерии колонизируют кишечник инвазионной личинки нематоды 6-8. Недавно было показано, что несколько других видов нематод также используют бактерии для уничтожения насекомых 9-13, и начались исследования взаимодействий между нематодами и бактериями в этих системах 9.
Мы описываем метод визуализации бактериального симбионта внутри или на поверхности нематоды-хозяина, используя оптическую прозрачность нематод при микроскопии. Бактерии модифицируют таким образом, чтобы они экспрессировали флуоресцентный белок, что позволяет визуализировать их с помощью флуоресцентной микроскопии. Доступно множество плазмид, несущих гены белков, флуоресцирующих на разных длинах волн (т. е. в зеленом или красном спектре), а конъюгация плазмид из донорного штамма Escherichia coli в бактериальный симбионт-реципиент проходит успешно для широкого спектра бактерий. Описанные методы были разработаны для изучения ассоциации между Steinernema carpocapsae и Xenorhabdus nematophila 14. Аналогичные методы использовались для изучения других ассоциаций нематод и бактерий 9,15-18, поэтому данный подход применим в целом.
Данный метод позволяет определить наличие и локализацию бактерий внутри нематод на разных стадиях развития, что дает представление о характере ассоциации и процессе колонизации 14,16,19. Микроскопический анализ позволяет выявить как частоту колонизации внутри популяции, так и локализацию бактерий в тканях хозяина 14,16,19-21. Это является преимуществом перед другими методами мониторинга бактерий в популяциях нематод, такими как соникация 22 или измельчение 23, которые позволяют определить средний уровень колонизации, но не позволяют, например, отличить популяции с высокой частотой низкой нагрузки симбионтов от популяций с низкой частотой высокой нагрузки симбионтов. Разграничение частоты и нагрузки колонизирующих бактерий может быть особенно важным при скрининге или определении характеристик бактериальных мутантов по фенотипам колонизации 21,24. Действительно, флуоресцентная микроскопия использовалась для высокопроизводительного скрининга бактериальных мутантов на наличие дефектов колонизации 17,18 и является менее трудоемкой, чем другие методы, включая соникацию 22,25-27 и индивидуальное препарирование нематод 28,29.
Протокол
1. Строительство Флуоресцентные бактериальный штамм с помощью сопряжения
- Расти получателя деформации (симбионт должны быть рассмотрены) и доноров штамм в течение ночи. Донор деформации, как правило, кишечная палочка, должны быть способны отдавать ДНК через сопряжение и должны быть трансформированы плазмидой (табл. 2), который несет ген, кодирующий флуоресцентный белок. В зависимости от плазмиды штамма сопряжения помощник может также потребоваться. Если так, то это напряжение должно быть также выращивали в течение ночи. Штамма донора и вспомогательные деформации должны быть выращены с антибиотиками, чтобы выбрать для поддержания пл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, описанный здесь, предоставляет метод для оптического обнаружения бактерий в нематодой хост (рис. 1). Этот метод использует оптическую прозрачность нематод и способности флуоресцентной меткой бактерий, что позволяет в естественных условиях анализа бактерий в нематодой хост (рис. 3). В частности, этот подход определяет бактериальной локализации в рамках своего хозяина. Путем подсчета населения нематод и очки для бактериального присутствия, частота бактериальной колониза.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Eugenio Vivas, Курт Heungens, Эрик Мартенс, Чарльз Cowles, Дарби Sugar, Eric Стабб, и Тодд Ciche за их вклад в развитие этого протокола и инструменты, используемые. KEM и СКМ при поддержке Национального института здоровья (NIH) Национального исследовательского Service Award T32 (AI55397 "микробы в норме и патологии»). СКМ при поддержке Национального научного фонда (NSF) Высшее Research Fellowship. Эта работа была поддержана грантами от Национального научного фонда (IOS-0920631 и IOS-0950873).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (по желанию) |
| Липидный Агар (Стерильные) | 8 грамм питательного бульона, 15 г агара, 5 граммов экстракта дрожжей, 890 мл воды, 10 мл 0,2 г / мл MgCl 2. 6H 2 0, 96 мл кукурузного сиропа решение *, 4 мл кукурузного масла * Движение средств массовой информации при заливке плиты * Добавить стерильную ингредиента после автоклавирования | ||
| Решение кукурузный сироп (Стерильные) | 7 мл кукурузного сиропа, 89 мл воды смеси и автоклава | ||
| Яйцо решение | 16,6 мл 12% гипохлорит натрия, 5 мл 5М KOH, 80 мл воды | ||
| Отвар лизогении (Стерильные) | 5 г дрожжевого экстракта, 10 г триптон, 5 г соли, 1 л воды смеси и автоклава | ||
| Микроцентрифуге | Рыбак | 13-100-675 | Любой микроцентрифужную, который держит микроцентрифуге трубы будет работать |
| Центрифугировать | Beckman | 366802 | Большой центрифуги верхней таблице, которая содержит 15 мл и 50 мл конические пробирки |
| Стерильные 60 мм X 15 мм чашку Петри | Рыбак | 0875713 | |
| 50 тюбиков мл центрифуги | Рыбак | 05-539-6 | |
| 15 ламп мл центрифуги | Рыбак | 05-531-6 | |
| Стерильные 100 мм X 20 мм чашку Петри | Рыбак | 0875711Z | Глубже, чем стандартные чашки Петри |
| 24-луночный планшет | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
| Микроскоп | Микроскоп необходимо люминесцентные возможности совместима с вашей флуорофора | ||
| Параформальдегид | Электрон наук микроскопии | 15710 | |
| PBS (Стерильные) | 8 г NaCL 0,2 г хлорида калия 1,44 г Na 2 HPO 4 0,24 г KH 2 PO 4 1 л воды Отрегулируйте рН 7,4 и воды до 1 л и автоклав | ||
| Микроцентрифуге труб | Рыбак | 05-408-138 | 2 мл или 1,5 мл пробирки |
| Шейкер | Любой шейкер, который вызывает жидкость осторожно двигаться будет работать | ||
| Диаминопимелиновой кислоты | Сигма | D-1377 | При необходимости, дополнять средства массовой информации к концентрации или 1 мм |
Ссылки
- Holterman, M., van der Wurff, A. Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).
- Lambshead, P. J. D., Boucher, G.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
