Оценка митохондриальной функции и жизнеспособности клеток в клетках почек гиперэкспрессией протеинкиназы С Изоферменты

Краткое содержание

Эффект активации протеинкиназы С (ПКС) изоферментов на митохондриальной функции, связанные с дыхания и окислительного фосфорилирования и на жизнеспособность клеток описаны. Подход адаптируется аденовирусной техники выборочно сверхэкспрессировать PKC изоферменты в первичной культуре клеток и различные анализы для определения функций митохондрий и энергетический статус клетки.

Аннотация

Семейство изоферментов протеинкиназы С (PKC) участвует в многочисленных физиологических и патологических процессах. Наши последние данные свидетельствуют о том, что PKC регулирует функцию митохондрий и энергетический статус клеток. Во многих отчетах было показано, что активация PKC-α и PKC-ε улучшает функцию митохондрий в ишемизированном сердце и опосредует кардиопротекцию. Напротив, мы продемонстрировали, что PKC-α и PKC-ε участвуют в нефротоксикант-индуцированной митохондриальной дисфункции и гибели клеток почек. Таким образом, целью данного исследования была разработка in vitro модель клеток почек, сохраняющая активные митохондриальные функции, в которой изоформы PKC могут быть селективно активированы или ингибированы для определения их роли в регуляции окислительного фосфорилирования и выживаемости клеток. Первичные культуры проксимальных канальцевых клеток почек (RPTC) культивировали в улучшенных условиях, что позволило достичь показателей митохондриального дыхания и активности митохондриальных ферментов, сходных с показателями в RPTC in vivoПоскольку традиционные методы трансфекции (Lipofectamine, электропорация) малоэффективны в первичных культурах и оказывают неблагоприятное воздействие на функцию митохондрий, доставка мДНК мутантного PKC-ε в проксимальные канальцевые клетки почек (RPTC) осуществлялась с помощью аденовирусных векторов. Данный подход позволяет трансфицировать более 90% культивируемых RPTC.

В данной работе представлены методы оценки роли PKC-ε в: 1. регуляции морфологии митохондрий и функций, связанных с синтезом ATP, и 2. выживаемости RPTC в первичной культуре. Активация PKC-ε осуществляется путем гиперэкспрессии конститутивно активного мутанта PKC-ε. Ингибирование PKC-ε достигается путем гиперэкспрессии неактивного мутанта PKC-ε. Функция митохондрий оценивается путем анализа дыхания, целостности дыхательной цепи, активности дыхательных комплексов и F₀F₁-ATPase, скорости продукции ATP и содержания ATP. Дыхание оценивается в RPTC, пермеабилизированных дигитонином, в состоянии 3 (максимальное дыхание в присутствии избытка субстратов и ADP) и при разобщенном дыхании. Целостность дыхательной цепи оценивается путем измерения активности всех четырех комплексов дыхательной цепи в изолированных митохондриях. Способность к окислительному фосфорилированию оценивается путем измерения митохондриального мембранного потенциала, скорости продукции ATP и активности F₀F₁-ATPase. Энергетический статус RPTC оценивается путем определения внутриклеточного содержания ATP. Морфология митохондрий в живых клетках визуализируется с помощью MitoTracker Red 580, флуоресцентного красителя, который специфически накапливается в митохондриях; живые монослои исследуются под флуоресцентным микроскопом. Жизнеспособность RPTC оценивается с помощью окрашивания аннексином V/пропидия йодидом с последующей проточной цитометрией для определения апоптоза и онкоза.

Данные методы позволяют осуществлять селективную активацию или ингибирование отдельных изоформ PKC для оценки их роли в клеточных функциях при различных физиологических и патологических состояниях, которые могут быть воспроизведены in vitro.

Протокол

1. Выделение почечных проксимальных канальцах для первичной культуры

1. Anesthetize кролика, акцизы обе почки и поместить их в чашку Петри заполнена стерильной буфера подготовки (DMEM/F12 среда) в ламинарном боксе.
2. Заливать каждую почку с 50 мл буфера Подготовка затем 50 мл стерильной фосфатно-солевой буфер, рН 7,4 (PBS), и PBS-оксид железа решение (45 мл + 5 мл). Де-капсулированной почек и передавать их на подготовительные буфер, содержащий дефероксамин.
3. Заготавливают кору каждую почку.
4. Однородный ткани, используя 15 мл Dounce гомогенизатора. Залить гомогената более 2 стерильных сита сетки (85 мкм на дне и 235 мкм сверху) размещены на 1 л стерильной стакан. Промойте сита с дефероксамин содержащего буфер.
5. Собирать любую ткань остается на сите 85 мкм в стерильные конические центрифужные пробирки заполнены 35-40 мл дефероксамин содержащего буфер. Аккуратно перемешайте суспензию клеток.
6. Поместите сильной мAgnet снаружи трубки для удаления железа заполнены клубочков и пусть подвески обосноваться. Аспирируйте железа от магнита помощью пипетки Пастера. Повторите этот процесс.
7. Подготовить 1 мл пищеварения среде, содержащей 2,400-2,500 единицы коллагеназы I и 0,6 мг соевого ингибитора трипсина растворяют в дефероксамин содержащего буфер. Фильтр-стерилизовать пищеварения среды.
8. Регулировка громкости клеточной суспензии в 40 мл и добавляют 1 мл пищеварения среды. Выдержите при комнатной температуре в течение 17 мин осторожно смешивания подвеска, центрифуги на 50 мкг в течение 2 мин при 4 ° C, аспирации среды, и добавить свежего буфера дефероксамин.
9. Повторите железа удаление процедуры с магнитом несколько раз, спина подвески вниз, аспирации среды, и добавить 46 мл среды, содержащей не глюкозу.
10. Аккуратно перемешайте и отмерить 500 мкл суспензии на две предварительно взвешенные трубы Эппендорф. Побочные клетки вниз при 10000 х г в течение 1 мин, аспирации средствах массовой информации, и вес гранул. Рассчитайте общую доходность влажной массы и белка.
11. Плита клетки в стерильный 35 блюд мм культуру в плотности 1 мг белка / блюдо использования без глюкозы DMEM/F12 среды. Культуры клеток в 2 мл глюкозы без DMEM/F12 среде всегда на орбитальном шейкере в инкубаторе при температуре 37 ° C (95% воздуха / 5% CO _2). ^1,2

2. Проксимальных почечных культуре клеток Трубочка

1. Культуральной среде является смесь 50:50 DMEM и Хэма F-12 питательной смеси без фенола красного, пирувата и глюкозы, с добавлением 15 мМ NaHCO _3, 15 мМ HEPES, и 6 мм лактата (рН 7,4, 295 мосмоль / KGH ₂ O). СМИ дополнены L-аскорбиновая кислота-2-фосфат (50 мкм), бычьего инсулина (10 нМ), человеческий трансферрин (5 мг / мл), гидрокортизона (50 нМ) и селен (5 нг / мл) непосредственно перед ежедневно, смена средств массовой информации.
2. Аспирируйте старых средств массовой информации из блюд с использованием стерильной техники. Добавить 2 мл теплой, свежей СМИ, чтобы каждое блюдо использованием стерильной техники. Ревнутренней клетки проксимальных канальцев (РПТС) достигают слияния примерно через 5-6 дней после посева. ^1,2

3. Аденовирусная инфекция из РПТС

1. Аденовирусной инфекции проводится в сливающиеся, покоя культур РПТС после ежедневного изменения средств массовой информации. Доминирующие отрицательные PKC-ε мутант (dnPKC-ε) был построен замены: 1) лизин, аргинин в положении 436 из АТФ-связывающим сайтом и 2) аланина с глутамата в положении 159 из pseudosubstrate области. Эти мутации уничтожил активности киназы конструкцию без изменения активной конформации PKC-ε ^3. PKC-ε было сделано постоянно активный по удалению остатков 154-163 его ингибирующее области pseudosubstrate ^4.
2. Добавить маточного раствора аденовируса проведения caPKC-ε кДНК или dnPKC-ε кДНК, чтобы каждое блюдо для получения желаемого множественности заражения (МВД), в результате значительного увеличения PKC-и Epsilна, уровни белка. Инкубируйте РПТС с аденовируса в течение 24 часов. Изменение средств массовой информации и культуры клеток в течение еще 24 часов. Значительное повышение уровня фосфорилированного и общей PKC-ε белки могут быть получены с использованием 25-50 МВД аденовирусных векторов кодирования caPKC-ε. Большой МВД результаты в еще больший рост уровня активной PKC-ε, но это не рекомендуется РПТС в связи с быстрым клеточной смерти и потери. Значительное повышение уровня неактивный PKC-ε белок может быть получен с использованием 50-100 МВД в РПТС без образования побочных эффектов ^5.
3. Через 48 часа после заражения, аспирата СМИ, мыть монослоев с PBS, а также сбор клеток для иммуноблот-анализ для определения уровня белка ПКС-ε ^5.

4. Измерение РПТС дыхания

1. Подготовка буфером для измерения состояния 3 дыхания (120 мМ KCl, 5 мМ KH ₂ PO _4, 10 HEPES мм, 1 мм MgSO ₄ и 2 мм, напримерTA, рН 7,4). Для измерительного комплекса I-связанных состояние 3 дыхание, дополняют буфером 5 мМ глутамата, 5 мМ малат и 0,1 мг / мл дигитонина. Для сложных II связью состояние 3 дыхание, дополняют буфером 10 мМ сукцинат, 0,1 мкМ ротенон и 0,1 мг / мл дигитонина. Для сложных IV связью состояние 3 дыхание, дополняют буфером с 1 мМ аскорбиновой кислоты, 1 мМ N, N, N ', N'-тетраметил-п-фенилендиамин (TMPD) и 0,1 мг / мл дигитонина. Место решения в 37 ° C водяной бане.
2. Аспирируйте СМИ от культуры блюдо, содержащее РПТС монослоя, добавить 2 мл теплого состояния 3 дыхание буфера, аккуратно соскоблить клетки от блюда с использованием резиновой полицейский, и передать подвески в камеру потребление кислорода оснащен Clark тип электрода.
3. Измерение состояния 2 дыхания (в отсутствие ADP). Инициировать состояние 3 дыхания путем добавления АДФ в конечной концентрации 0,4 мм. Инициировать состояние 4 дыхания, добавив олигомицином до конечного концентрATION 0,5 мкг / мл. Несвязанных дыхания измеряется путем добавления 0,5 мкМ FCCP в клетки дышащих в состоянии 3. ^6,7
4. Сбор клеточной суспензии из камеры осаждения белков использованием хлорной кислоты, и спином вниз осадок. Определение концентрации белка в клеточных гранул.

5. Анализ митохондриальной мембранный потенциал (ΔΨm)

1. Подготовка 0,5 мМ JC-1 решение в стерильной среде культуры.
2. Добавить медленно 20 мкл JC-1 решение каждое блюдо для получения конечной концентрации 5 мкМ. Swirl блюдо для смешивания красителей тщательно. Вернуться блюд в инкубатор на 30 мин.
3. Положить блюда на льду, аспирата СМИ, и мыть монослоев дважды с ледяным PBS. Аспирата PBS, добавить 1 мл свежего PBS, очистить клетки от тарелки и передавать их в трубки Эппендорф. Разбейте монослоев на отдельные клетки с помощью пипетки вверх и вниз.
4. Побочные подвески вниз, при 1000 мкг в течение 2 мин, жерехсердитый супернатант, добавить 1 мл PBS в осадок и вновь приостановить его для получения суспензии отдельных клеток. Повторите этот шаг еще раз, если это необходимо.
5. Побочные клетки вниз на уровне 1000 мкг в течение 2 мин, аспирации супернатант, добавить 0,5 мл PBS, и вновь приостановить гранул. Анализ флуоресценции проточной цитометрии с использованием возбуждения 488-нм аргон-ионный лазер. Читайте выбросов в двух отдельных каналов, FL1 при 525 нм и FL2 при 590 нм. Митохондриальная мембранный потенциал выражается в FL2/FL1 отношение флуоресценции ^6.

6. Выделение митохондрий

1. Подготовка изоляции буферов: буфер (10 мМ HEPES, 225 мМ маннит, 75 мМ сахарозы, 0,1 мМ EGTA, рН 7,4), буфер B (буфер содержащий ингибиторы протеазы, 1 мМ Na ₃ VO _4, 1 мМ NaF), и буфер C (10 мМ HEPES, 395 мМ сахарозы, 0,1 мМ EGTA, рН 7,4). Выполните все шаги на льду.
2. Вымойте РПТС монослоев дважды ледяным буфером PBS. Очистите монослоев в пробирки Eppendorf и спина ихпри 500 мкг в течение 5 мин. Промойте осадок в 1 мл буфера А.
3. Повторное приостановить осадок в 1 мл буфера B, и передать подвески 2 мл Dounce гомогенизатора.
4. Однородный клеток в Dounce гомогенизатор, пока большая часть клеток в гомогенат разбиты, когда проверяется под микроскопом.
5. Центрифуга гомогената при 1000 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Сбор супернатант и спином вниз при 15000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
6. Удалите супернатант и вновь приостановить осадок, содержащий сырую митохондрий в 1 мл буфера C. Побочные супернатантов вниз при 15000 х г в течение 10 мин при 4 ° C. Повторите промывку осадка еще два раза ^5.
7. Для измерения деятельности дыхательных комплексов, вновь приостановить митохондриальной гранул в 50-100 мкл буфера для анализа и заморозить в жидком азоте. Разморозить образцы медленно на льду.

7. Измерение активности NADH-убихинон оксидоредуктазы (комплекс I)

1. Подготовка буфере: 10 мМ KH ₂ PO _4, 5 мМ MgCl _2, рН 7,2. Добавить жирные кислоты без BSA и NADH для получения конечной концентрации 0,25% и 0,25 мм, соответственно. Добавить 2 мкл антимицином раствора (1 мг / мл) до конечной концентрации 2 мкг / мл.
2. Выполнить образцов в 48-и прозрачной пластиной. Включить контрольный образец, который имеет все дополнения, но не митохондрий. В каждую лунку, добавить 500 мкл буфера для анализа с дополнениями и митохондрий, и инкубировать пластин при 30 ° C при перемешивании в течение 5 мин.
3. Запустить реакцию добавлением 10 мкл 3,25 мм убихинона в каждую лунку. Измерить абсорбцию (340 нм) в течение 3 мин в 20-секундными интервалами. Добавьте 5 мкл ротенон раствора (1 мг / мл) в каждую лунку и записывать абсорбции для дополнительных 2 мин. Рассчитать комплекс I деятельность в качестве ротенон чувствительных к окислению НАДН ^7.

8. Измерение активности сукцинат-убихинон оксидоредуктазы (комплекс II)

1. Подготовка буфере, содержащем 0,25% жирных кислот без BSA, 20 мМ калий-сукцинат, 0,25 мМ 2,6-dichloroindophenol, 2 мкг / мл антимицином и 10 мкг / мл ротенон.
2. Выполнить образцов в дубликатах в 48-и прозрачную пластину в том числе контрольный образец, который имеет все дополнения, но не митохондрий. В каждую лунку, добавить 500 мкл буфера для анализа с дополнениями и митохондрий, и инкубировать пластин при 30 ° C при перемешивании в течение 2 мин.
3. Запустить реакцию добавлением 10 мкл 3,25 мм убихинона в каждую лунку. Измерить абсорбцию (595 нм) в течение 3 мин в 20-секундными интервалами. Рассчитать комплекс деятельности II, следуя снижение 2,6-dichloroindophenol ^7.

9. Измерение активности Убихинола-цитохром с-оксидоредуктазы (комплекс III)

1. Подготовка буфером, содержащим 0,1% жирных кислот без BSA, 80 мМ калий-сукцинат, 10 мкг / мл ротенон, и 0,24 мм цианистого калия.
2. Выполнить образцыВ дубликаты в 48-и прозрачную пластину в том числе контрольный образец, который имеет все дополнения, но не митохондрий. В каждую лунку, добавить 291 мкл буфера для анализа с дополнениями и митохондрий, и инкубировать пластин при 30 ° C при перемешивании в течение 5 мин.
3. Запустить реакцию добавлением 3 мкл 6 мм окисленного цитохрома с в каждую лунку. Измерить абсорбцию (550 нм) в течение 3 мин в 20-секундными интервалами. Добавьте 5 мкл антимицином раствора (1 мг / мл) в каждую лунку и записывать абсорбции для дополнительных 2 мин. Рассчитать сложной деятельности III, как антимицином чувствительных цитохрома с сокращением ^7.

10. Измерение активности цитохромоксидазы (комплекс IV)

1. Подготовьте уменьшить цитохрома с добавлением натрия аскорбат до 9 мм решению цитохрома С и диализа решение в течение ночи при 4 ° С в 1 л фосфатного буфера (10 мМ KH ₂ PO _4, рН 7,2), содержащем 5 мМ MgCl _2. Подготовить анализ буфер, содержащий0,1% жирных кислот без BSA и антимицина (2 мкг / мл).
2. Выполнить образцов в 48-и прозрачную пластину в том числе контрольный образец, который имеет все дополнения, но не митохондрий. В каждую лунку, добавить 233 мкл буфера для анализа с дополнениями и митохондрий, и инкубировать пластин при 30 ° C при перемешивании в течение 5 мин.
3. Запустить реакцию добавлением восстановленного цитохрома с (90 мкМ конечная концентрация). Измерить абсорбцию (550 нм) в течение 3 мин в 20-секундными интервалами. Добавить 2 мкл раствора цианистого калия (8 мкг / мл) в каждую лунку и записывать абсорбции в течение еще 2 мин. Рассчитать сложной деятельности IV, как KCN-чувствительных окисления цитохрома С ^7.

11. Измерение активности F ₀ F _{1-АТФазы} (АТФ-синтазы)

1. Подготовка F ₀ F _{1-АТФазы} буфером (10 мМ Трис-HCl, 200 мМ KCl, 2 мМ MgCl _2, рН 8,2). Повторное приостановить митохондриальной окатышей в буфере, заморозить образцы митохондриальной в Liquiг азота и оттаивания образцов медленно на льду.
2. Выполнить образцов в трех повторах в 48-и прозрачной пластиной. Для каждой группы лечения, 2 скважины будут работать для измерения суммарной активностью АТФазы (275 мкл буфера для анализа, 5 мкл митохондриальной суспензии, и 5 мкл 95% этанола) и 1 скважина для измерения олигомицином регистра АТФазы (275 мкл буфером, 5 мкл митохондриальной суспензии, и 5 мкл 1 мг / мл олигомицином решение в 95% этанола).
3. Инкубируйте образцы при 31 ° С в течение 10 мин при постоянном встряхивании. Добавить 16 мкл 100 мМ ATP раствора (рН 7,0) и инкубировать при 31 ° С в течение 5 мин при постоянном встряхивании.
4. Передача 200 мкл инкубационной смеси в пробирку, содержащую 50 мкл 3 М TCA. Инкубируйте образцы на льду в течение 10 мин и спина их вниз при 10000 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Используйте супернатанты и гранул для определения фосфата и белка соответственно.
5. Определить содержание фосфатов в супернатантах помощьюАнализ неорганических фосфатов. Подготовьте 100 мл Реагент Самнер путем добавления 0,88 г FeSO ₄ до 10 мл 3,75 М H ₂ SO ₄ и регулировки до 90 мл H ₂ O. Добавить 10 мл молибдата аммония раствор (0,66 г/10 мл H ₂ O) для решения FeSO ₄ в H ₂ SO _4. Защищать от света.
6. Нагрузка 96-луночный планшет с 50 мкл каждого стандартного фосфата (0 - 1000 мкм KH ₂ PO ₄₎ и 50 мкл каждого супернатанта в двух экземплярах. Добавить 250 мкл реагента Самнер в каждую лунку и инкубировать пластины при температуре 30 ° С в течение 15 мин при постоянном встряхивании.
7. Измерить абсорбцию при 595 нм при комнатной температуре. F ₀ F _{1-АТФазы} определяется путем измерения олигомицину чувствительной выпуска P _я из АТФ, как мы описали выше. ^7,8 Рассчитать общий и олигомицином регистра F ₀ F _{1-АТФазы} деятельности. Для расчета олигомицину чувствительной АТФазы ACTiВиты, вычесть олигомицином регистра деятельности с общей активностью АТФазы. ^8,9

12. Измерение концентрации АТФ в клетке

1. Место культуры блюд, содержащих РПТС монослоев на льду, аспират среды, и мыть монослоев в два раза со льдом буфера холодного PBS. Добавить 1 мл PBS, чтобы каждый монослой, очистить каждый монослой в PBS, и собирают суспензию клеток в пробирке Эппендорф. Побочные Эппендорфа в микроцентрифуге в течение 5 сек.
2. Определить содержание АТФ в каждой РПТС образца люциферазы метод с использованием биолюминесценции АТФ набор для анализа HS II (Roche) и протоколом производителя. Определение концентрации белка в каждом образце и расчета концентрации АТФ мг белка ^8.

13. Визуализация митохондриальной Морфология

1. Изменить культуру средств массовой информации. Добавить 2 мкл 100 мкМ раствора MitoTracker Красный 580 до каждого блюда (конечная концентрация. 100 нМ) и вернуться к блюдам incubatoг в течение 30 мин.
2. Изучите живой монослоя под флуоресцентным микроскопом с использованием объектива погружения в воду ^5.

14. Анализ жизнеспособности клеток

1. В 24 часов перед началом анализа подготовить 50 мМ раствор цисплатина для лечения клетки, которые будут служить в качестве положительного контроля для апоптоза (аннексина V-положительных клеток). Кроме того, подготовить 500 мМ раствор трет-бутилгидропероксид лечить клетками, которые будут служить в качестве положительного контроля для oncosis (пропидия йодо-положительных клеток).
2. Лечить 2 блюда с 2 мкл 50 мМ цисплатин и 2 блюд с 2 мкл 500 мМ трет-бутилгидропероксид. Посвятите 1 блюдо для не-пятно контроля.
3. В 24 часов после лечения цисплатином и TBHP, подготовить буфера для связывания (10 мМ Hepes, 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl _2, 1,8 мМ CaCl ₂₎ и пропидия йодида (PI) решение (50 мкг / мл) в связывающем буфере.
4. Вымойте монослоев один раз с обязательным баффэ. Добавить 1 мл ледяного буфера и 50 мкл PI решение каждого блюда, за исключением не-пятно и аннексина V-положительных клеток. Крышка блюд и инкубировать на льду в течение 15 мин с нежным орбитальной встряхивании.
5. Вымойте монослоев с буфером для связывания (10 мин) и добавьте 1 мл буфера для связывания и 2 мкл аннексина V-FITC решение каждого блюда, за исключением не-пятно и PI-положительных клеток. Крышка блюд и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин с нежным орбитальной встряхивании.
6. Аспирируйте буфера и мыть монослоев с 1 мл ледяного буфера для связывания на льду в течение 10 мин с нежным орбитальной встряхивании. Повторите стадии промывки.
7. Аспирируйте буфера для связывания и добавить 500 мкл буфера для связывания к каждому блюду. Аккуратно очистить клетки, используя резиновые полицейский и передать клеток проточной цитометрии труб. Дисперсные клеток в суспензии отдельных клеток с помощью пипетки образцы вверх и вниз. Разбейте любую ячейку кластеров.
8. Количественная PI и аннексина V-FITC флуоресценции сразу FloW цитометрии с использованием возбуждения при 488 нм и эмиссии при 590 и 530 нм для ИП и FITC, соответственно. Граф 10000 событий для каждого образца.
9. Положить FITC флуоресценции на оси Х и флуоресценции PI на Y-оси потока цитометрии цифры точкой сюжета. Клетки положительным для аннексина V и отрицательным для PI считается апоптоза. Клетки для положительных и отрицательных PI для аннексина V считают онкотического. ^10,11

Результаты

Рисунок 1 показывает, что аденовирусная доставки кДНК, кодирующих конститутивно активный (caPKC-ε) и неактивных (dnPKC-ε) мутантов PKC-ε приводит к значительно увеличились уровни белка ПКС-ε в РПТС и в митохондриях. Клетки, инфицированные с кДНК проведения caPKC-ε вектор экспрессия фосфорилированной (активные) формы PKC-ε, тогда как клетки, инфицированные ДНК-кодирования dnPKC ε сверхэкспрессированный PKC-ε, который был неактивным (не фосфорилируется) (рис. 1). Наличие активной PKC-ε сн...

Обсуждение

Здесь подход позволяет избыточная экспрессия отдельных изоферментов PKC в первичной культуре почечных проксимальных канальцев клеток. Есть несколько сильных сторон этого подхода: 1. Это позволяет для исследования механизмов регулирования в однородной популяции клеток (почечные клетки проксимальных канальцев), которые являются основной мишенью для различных оскорблений (ишемия, гипоксия, окислительный стресс), наркотики и nephrotoxicants в почках. 2. Митохондриальной функции в этом в пробирке модель РПТС, выраще...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Ламинарном потоке	Thermo Electron Corporation	FORMA 1104
2 мл и 15 мл Dounce ткани мясорубку	WHEATON	989-24607, 357544
85 и 235 микрон нейлоновая сетка	Мелкие детали	CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
50 мл стерильной пробирке центрифуги	BIOLOGIX	BCT-P 50BS
1,5 мл микро труб	Sarstedt	72.690.001
35 х 10 мм, стерильные чашки культуры	Гранулирование	430165
Центрифуга Jouan	Jouan	Jouan CR3 11175704 Роторы: Jouan T40
Регулируемые микро-центрифуге	SIGMA	Модель 1 - 15
Биологические Монитор кислорода	YSI Объединенного	YSI Model 5300A
Однокамерные Micro кислородная система	YSI Объединенного	5356S
Кислородный датчик	YSI Объединенного	5331A
Циркуляционные ванны	YSI Объединенного	5310
KCl и стандартный набор мембранных	YSI Объединенного	5775
Магнитная мешалка	YSI Объединенного	5222
Планшетный Recorder	Kipp & Zonen	BD 11E
48-и и 96-и прозрачных пластин	Costar	3548, 3679
Thermomixer R	Миppendorf	5355 21919
Орбитальный шейкер MAXQ 2000	Thermo Scientific	Шка 2000
Spectra FLUOR Plus (поглощение / флуоресценции / люминесценции читателя)	Tecan	F129005
С водяной рубашкой США Autoflow автоматического CO 2 инкубаторе	NUAIRE	NU 4850
12x75 мм полистирола культуры пробирки для проточной цитометрии	Марка Фишера	14-961-20
Axioskop Цель воде погружения 63x / 0,90 W	Carl Zeiss	114846 ACHROPLAN 44 00 67
DMEM / F12	Cellgro	99 - 830 - PB
DMEM / F12 Хэма	Сигма	D 2906 - 1л
Дефероксамин мезилата	БольницахРА	D110
Коллагеназы типа I	Worthington	4196
Ингибитора трипсина	Сигма	T 6522 - 500 мг
5,5 ', 6,6'-тетрахлор-1, 1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine йодида (JC-1)	Invitrogen	T3168
Mitotracker красный	Invitrogen	M22425
ATP Биолюминесценция набор для анализа HS II	Roche	11 699 709 001
Аннексина V - FITC решения	BioVision	1001 - 200
Проточный цитометр	BD Biosciences	BD FACSCalibur