Методическая статья

Мониторинг репликации плазмиды в клетках млекопитающих Онлайн над несколькими поколениями с помощью флуоресцентной микроскопии

DOI:

10.3791/4305

⸱

13 декабря 2012 г.

 ,  , 
1Department of Oncology, University of Wisconsin - Madison

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод наблюдения отдельных молекул ДНК в живых клетках описано. Метод основан на связывании флуоресцентно меченый белок-репрессор лак для сайтов связывания разработаны в ДНК интерес. Этот метод может быть адаптирован к следуют многие рекомбинантные ДНК в живых клетках с течением времени.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В клетках млекопитающих сохраняется мало естественных плазмид. Среди них есть геномы гамма-герпесвирусов, включая вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) и герпесвирус Капоши, ассоциированный с саркомой (KSHV), которые вызывают множественные злокачественные новообразования человека 1-3. Эти два генома реплицируются лицензированным образом, каждый с использованием одного вирусного белка и механизма клеточной репликации, и передаются дочерним клеткам во время деления клеток, несмотря на отсутствие у них традиционных центромер 4-8.

Много работы было сделано для характеристики репликаций этих плазмидных геномов с использованием таких методов, как Саузерн-блоттинг и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Однако эти методы ограничены. Количественная ПЦР и блоттинг по Саузерну дают информацию о среднем количестве плазмид на клетку в популяции клеток. FISH — это анализ одиночных клеток, который показывает как среднее количество, так и распределение плазмид на клетку в популяции клеток, но является статическим, не позволяя получить информацию о родителе или потомстве исследуемой клетки.

Здесь мы описываем метод визуализации плазмид в живых клетках. Этот метод основан на связывании флуоресцентно меченного белка-репрессора лактозы с несколькими участками в интересующей плазмиде 9. Представляющая интерес ДНК спроектирована таким образом, чтобы включать примерно 250 тандемных повторов последовательности оператора лактозы (LacO). LacO специфически связывается белком-репрессором лактозы (LacI), который может быть слит с флуоресцентным белком. Гибридный белок может быть либо экспрессирован из сконструированной плазмиды, либо введен ретровирусным вектором. Таким образом, молекулы ДНК флуоресцентно помечены и, следовательно, становятся видимыми с помощью флуоресцентной микроскопии. Гибридный белок блокируется от связывания с плазмидной ДНК путем культивирования клеток в присутствии IPTG до тех пор, пока плазмиды не будут готовы к просмотру.

Эта система позволяет отслеживать плазмиды в живых клетках на протяжении нескольких поколений, выявляя свойства их синтеза и деления на дочерние клетки. Идеальные клетки адгезивны, легко трансфицируются и имеют крупные ядра. Этот метод был использован для определения того, что 84% плазмид, полученных из ВЭБ, синтезируются в каждом поколении, а 88% вновь синтезированных плазмид точно делятся на дочерние клетки в клетках HeLa. Было замечено, что пары этих ВЭБ-плазмид были привязаны к сестринским хроматидам или ассоциировались с ними после их синтеза в S-фазе до тех пор, пока они не разделились по мере того, как сестринские хроматиды разделялись в анафазе10. В настоящее время этот метод используется для изучения репликации геномов KSHV в клетках HeLa и SLK-клетках. Клетки HeLa являются иммортализированными эпителиальными клетками человека, а клетки SLK являются иммортализированными эндотелиальными клетками человека. Хотя клетки SLK первоначально были получены из поражения KSHV, ни линия клеток HeLa, ни клеточная линия SLK естественным образом не содержат генома KSHV11. В дополнение к изучению репликации вируса, этот метод визуализации может быть использован для исследования влияния добавления, удаления или мутации различных элементов последовательности ДНК на синтез, локализацию и деление других рекомбинантных плазмидных ДНК.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Инженерная клеток с видимой Плазмиды

  1. Используйте стандартные пищеварения ограничение или гомологичной рекомбинации методов ввести фрагмент ДНК, содержащий около 250 копий лактозы последовательности операторов (Laco) в плазмиду для визуализации. Наши плазмида BACmid около 170 т.п.н. и содержит весь геном саркомы связанных Вирус герпеса Капоши (KSHV) и кодированных устойчивость к гигромицину 12.
  2. Представьте Laco содержащие плазмиды ДНК в клетки млекопитающих путем трансфекции с Lipofectamine 2000 года. Мы трансфицировали HeLa и SLK клеток в 60 мм блюд в течение 4 часов с 10 мкг очищенной ДНК плазмиды с 25 мкл Lipofectamine 2000 году, 0,5 мл OptiMEM, и 3,5 мл DMEM.
  3. Изменение культуральной среде до 5 мл DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и инкубируют клетки в течение 48 часов.
  4. Пластина клеток при низкой плотности в больших блюдах и культуре клеток в среде, содержащей антибиотик выбора для введенных плаСМИД, мы выбрали клеток в DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки с 300 мкг / мл гигромицину в течение 3 недель.
  5. Используйте куски стерильные, трипсина пропитанной фильтровальной бумаги для передачи гигромицину устойчивых колоний в новых блюд культуры.
  6. Когда трансфицированные клоны выросли, чтобы заполнить блюдо, выделить ДНК для ограничения пищеварения и Саузерн-блоттинга для того, чтобы полимер Laco плазмиды является однородным и ожидаемого размера.
  7. Если плазмиды не был спроектирован, чтобы выразить слияния LacI, заразить подходящих клонов с ретровирус, кодирующий репрессор лактозы (LacI), слитый с красным флуоресцентным белком, такие как LacI-tdTomato. Мы используем tdTomato, а не белки, которые светятся ближе к зеленым, чтобы минимизировать photoxicity, что будет происходить из нескольких экспозиций в течение длительного времени 13.
  8. Как только белок LacI слияния вводится, культуре клеток в присутствии 200 мкг / мл изопропилового-BD-тиогалактозида (IPTG), чтобы заблокировать слияние белков из обязательныхДНК.
  9. Культуры клеток в течение не менее 3 дней, чтобы выражение LacI-tdTomato белка.
  10. Экран клонов (путем вымывания IPTG и просмотр клеток, как описано ниже) для тех, с оптимальным уровнем LacI-tdTomato, которые показывают различные сигналы с минимальным уровнем фона несвязанного слитого белка.

2. Развитие Imaging System

Наша система формирования изображений состоит из Zeiss Axiovert 200M оснащена моторизованной сцене и план-Aochromat 63x/1.4 нефти цели. Флуоресцентный свет возбуждения осуществляется "нейтральный белый" Светодиодные системы Colibri. Выбросы обнаруживается CascadeII: 1024 EMCCD камеры. Это охлаждением, бэк-разбавленной камера с усилением регистр для усиления сигналов; темные ток 0,061 электронов на пиксел в секунду, а квантовая эффективность больше, чем 0,90. Система управляется с помощью AxioVision 4,8 программного обеспечения, включая модуль SmartExperiments. Для обнаружения tdTomaмы используем, чтобы Zeiss 75HE набор фильтров, для которых 85% прошли свет может возбуждать фтор и 95% излучаемого света будет проходить выбросов фильтр.

  1. Сборка системы формирования изображения с помощью инвертированного микроскопа и камеры для EMCCD чувствительны обнаружения сигналов, светодиодный источник света для конкретных возбуждением и быстрым опалубка, моторизованный фокус сцене и руки, и программное обеспечение управления для автоматизированного приобретения изображений в течение длительных промежутков времени с несколькими Z-стеки. Система должна сидеть на воздухе стол, который будет изолирован от вибраций.
  2. Соберите этап-топ инкубаторе для поддержания клеток при 37 ° C, 5-10% CO 2 в увлажненной камере. Разрешить достаточно времени для системы, чтобы прийти к стабильной температуры, чтобы минимизировать движение артефакты во время эксперимента.
  3. Используйте подогревом ошейник для целей, чтобы предотвратить несанкционированный цели из тепла от образца.

3. Визуализация меченой ДНК

  1. Пластина клеток в 35 ммсо стеклянным дном блюдо с плотностью менее 10% слияния, которое позволит пары клеток к делению в колонии 8-16 клеток без перекрытия. Сделайте это, по крайней мере, 24-48 ч перед изображениями так, что жизнеспособные клетки есть время, чтобы разделить.
  2. От одного до трех часов до начала обработки изображений, промыть пластины 3 раза культуральной среде которых не хватает как селективные препараты и IPTG. Эта процедура смывает нежизнеспособных клеток и позволяет LacI слитых белков связывать Laco сайтов в плазмиды.
  3. Заменить культуральной среде с 2 мл DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 25 мМ HEPES.
  4. Замените верхнюю часть культуры блюдо с CultFoil растягивается в кольцо крепления для 35 мм блюдо. Это покрытие будет препятствовать испарению культуральной среды, что позволит увеличить концентрацию соли в течение долгого времени и убить клетки.
  5. Использование дифференциального интерференционного контраста (DIC) для просмотра изображений клеток и определить фокальной плоскости верхней и нижней клеток в нескольких полях зрения.В каждом поле перейти к фокальной плоскости примерно 1/3 пути вниз от верхней части клетки. Сохранить X, Y, Z координаты в списке сохраненных позиций этапе.
    Примечание: плазмиды сигналы могут быть не видны через окуляры, когда клетки освещении светодиоды с длиной волны подходят для гибридного белка LacI. Слабые сигналы могут быть виден только с использованием EMCCD камера, которая позволяет интегрировать сигнал с течением времени и таким образом эффективно усиливает слабые сигналы.
  6. В программное обеспечение для управления микроскопом, определяют Z-Stack изображения должны быть выполнены на каждом этапе сохранено положение. Выберите аз шаг размере 0,35-0,50 мкм, которая позволит вам приблизить Найквиста в размерности г 14. Включите «лишних» ломтиков выше и ниже плоскости, в которой клетки находятся, эти кусочки позволяют выявлять следующие ячейки движения во время клеточного цикла, а также используются в пост-обработке приобретение (деконволюция) изображения стеки. Это включение будетпривести в стек 40-60 изображений, в зависимости от толщины клеток.
  7. В программное обеспечение для управления микроскопом, определить время эксперимента серию собрать яркое изображение поля Z-стеки на 30 мин интервалы (для отслеживания клеточного деления и миграции в течение длительного времени) и флуоресцентные изображения на 10-60 минутные интервалы (для визуализации плазмид внутри клеток). Не используйте DIC изображений во время эксперимента, так как он требует больше света, чем стандартные ярких изображений поле, которое может подвергать излишне клеток в фототоксичности в течение долгих экспериментов.
  8. Запустите программу-контролируемого эксперимента. Убедитесь, что система не нарушена (столкнулась, подвергаются чрезмерным светом комнате и т.д.) в ходе эксперимента.
  9. При необходимости пополнения воды в системы увлажнения во время эксперимента.

4. После приобретения обработка изображений

  1. Просмотрите изображения для каждого Z-Stack и момент времени. Обрезать ненужные областиизображения для сокращения времени компьютерной обработки на следующем этапе.
  2. Использование алгоритма деконволюции повторно назначить интенсивности сигнала на пиксель происхождения в каждом Z-Stack 15. Хотя это деконволюция может быть основана на теоретическом функции размытия точки для системы формирования изображения, предпочтительнее для измерения функции точки распространения вашей системы визуализации флуоресцентных микросфер, и использовать это измерение в деконволюции алгоритм. Мы измерили функцию рассеяния точки нашей системы формирования изображения и применять ограничения максимального правдоподобия итерационный алгоритм в AxioVision программного обеспечения (AxioVision описание программного обеспечения, Zeiss).
  3. Изучите изображение, чтобы отслеживать изменения интенсивности движения и плазмид во время клеточного цикла и разбиение плазмиды в дочерних клетках.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Максимальная прогнозов интенсивности Z-стеки, приобретенных в результате представителем эксперимента представлены на рисунке 3. Типичные плазмиды сигналы присутствуют в 3-8 ломтика Z-Stack, в зависимости от того, представляют одну или кластеров плазмид. В случае EBV и KSHV полученных плазмид, сигналы медленно двигаться внутри клетки, пока клетка достигает митоза. Сами клетки мигрируют по ходу эксперимента. Они также становятся сферическими и отсоедините от тарелки во время митоза. Клеточного цикла для з...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод, описанный здесь, может использоваться следовать плазмид в живых клетках млекопитающих с течением времени, охватывающих несколько поколений. По ограничению воздействия возбуждающего света, мы использовали эти методы, чтобы следить клетки вновь разделились парами через 16-32 колоний клеток, представляющих не менее 72 часов и 3 клеточных делений. Эти эксперименты дают информацию, которая не может быть получена от статического анализа, такие как количественной ПЦР, Саузерн-блоттинга и рыбы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась за счет грантов от NIH и САУ, в том числе T32CA009135, CA133027, CA070723, и CA022443. Билл Sugden является Американского онкологического общества профессор-исследователь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии
DMEM GIBCO 11965
OptiMEM GIBCO 31985
Эмбриональной бычьей сывороткой Hyclone SH30910.03
Пенициллин Сигма P3032
Стрептомицина сульфат Сигма S9137
Гигромицину Calbiochem 400050 400 мкг / мл для SLK, 300 мкг / мл для HeLa
Изопропиловый-BD-тиогалактозида (IPTG) Roche 10 724 815 001 Конечная концентрация 200 мкг / мл
Липофектамина 2000 Invitrogen 11668-027
HEPES GIBCO 15630
Со стеклянным дном блюда Маттек P35G-1.5-10-C
CultFoil Pecon 000000-1116-08
Axiovert 200M Zeiss
Колибри Zeiss 423052-9500-000
Нейтральный белый светодиод Zeiss 423052-9120-000
Фильтр Cube 75 он Zeiss 489075-0000-000
План-Apochromat 63x/1.4 цели Zeiss 440762-9904-000
CascadeII: 1024 EMCCD камеры Фотометрия B10C892007
Tempcontrol мини- Zeiss / Pecon 000000-1116-070
Tempcontrol 37-2 цифровой Zeiss / Pecon 000000-1052-320
CTI Контроллер 3700 цифровые Zeiss / Pecon 411856-9903
Цель нагреватель Zeiss / Pecon 440760-0000-000
Этап отопления вставки P Zeiss / Pecon 411861-9901-000
Этап-топ инкубатор S Zeiss / Pecon 411860-9902-000
Увлажнитель системы Zeiss / Pecon 000000-1116-065

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
  2. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
  3. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Fields Virology 2 volume set. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
  4. Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
  5. Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
  6. Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
  7. Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
  8. Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
  9. Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
  10. Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
  11. Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
  12. Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
  14. Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).
  15. Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Plasmid ReplicationFluorescence MicroscopyLive Cell ImagingLactose OperatorFluorescent Protein FusionViral Genome PartitioningCell Division TrackingFluorescent TaggingTime Lapse ImagingHeLa Cells

Похожие статьи