$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
В клетках млекопитающих сохраняется мало естественных плазмид. Среди них есть геномы гамма-герпесвирусов, включая вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) и герпесвирус Капоши, ассоциированный с саркомой (KSHV), которые вызывают множественные злокачественные новообразования человека 1-3. Эти два генома реплицируются лицензированным образом, каждый с использованием одного вирусного белка и механизма клеточной репликации, и передаются дочерним клеткам во время деления клеток, несмотря на отсутствие у них традиционных центромер 4-8.
Много работы было сделано для характеристики репликаций этих плазмидных геномов с использованием таких методов, как Саузерн-блоттинг и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Однако эти методы ограничены. Количественная ПЦР и блоттинг по Саузерну дают информацию о среднем количестве плазмид на клетку в популяции клеток. FISH — это анализ одиночных клеток, который показывает как среднее количество, так и распределение плазмид на клетку в популяции клеток, но является статическим, не позволяя получить информацию о родителе или потомстве исследуемой клетки.
Здесь мы описываем метод визуализации плазмид в живых клетках. Этот метод основан на связывании флуоресцентно меченного белка-репрессора лактозы с несколькими участками в интересующей плазмиде 9. Представляющая интерес ДНК спроектирована таким образом, чтобы включать примерно 250 тандемных повторов последовательности оператора лактозы (LacO). LacO специфически связывается белком-репрессором лактозы (LacI), который может быть слит с флуоресцентным белком. Гибридный белок может быть либо экспрессирован из сконструированной плазмиды, либо введен ретровирусным вектором. Таким образом, молекулы ДНК флуоресцентно помечены и, следовательно, становятся видимыми с помощью флуоресцентной микроскопии. Гибридный белок блокируется от связывания с плазмидной ДНК путем культивирования клеток в присутствии IPTG до тех пор, пока плазмиды не будут готовы к просмотру.
Эта система позволяет отслеживать плазмиды в живых клетках на протяжении нескольких поколений, выявляя свойства их синтеза и деления на дочерние клетки. Идеальные клетки адгезивны, легко трансфицируются и имеют крупные ядра. Этот метод был использован для определения того, что 84% плазмид, полученных из ВЭБ, синтезируются в каждом поколении, а 88% вновь синтезированных плазмид точно делятся на дочерние клетки в клетках HeLa. Было замечено, что пары этих ВЭБ-плазмид были привязаны к сестринским хроматидам или ассоциировались с ними после их синтеза в S-фазе до тех пор, пока они не разделились по мере того, как сестринские хроматиды разделялись в анафазе10. В настоящее время этот метод используется для изучения репликации геномов KSHV в клетках HeLa и SLK-клетках. Клетки HeLa являются иммортализированными эпителиальными клетками человека, а клетки SLK являются иммортализированными эндотелиальными клетками человека. Хотя клетки SLK первоначально были получены из поражения KSHV, ни линия клеток HeLa, ни клеточная линия SLK естественным образом не содержат генома KSHV11. В дополнение к изучению репликации вируса, этот метод визуализации может быть использован для исследования влияния добавления, удаления или мутации различных элементов последовательности ДНК на синтез, локализацию и деление других рекомбинантных плазмидных ДНК.