Мониторинг репликации плазмиды в клетках млекопитающих Онлайн над несколькими поколениями с помощью флуоресцентной микроскопии

Kathryn Norby; Ya-Fang Chiu; Bill Sugden

doi:10.3791/4305

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мониторинг репликации плазмиды в клетках млекопитающих Онлайн над несколькими поколениями с помощью флуоресцентной микроскопии

11.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4305

⸱

13 декабря 2012 г.

Kathryn Norby¹ , Ya-Fang Chiu¹ , Bill Sugden¹

¹Department of Oncology, University of Wisconsin - Madison

В этой статье

Краткое содержание

Метод наблюдения отдельных молекул ДНК в живых клетках описано. Метод основан на связывании флуоресцентно меченый белок-репрессор лак для сайтов связывания разработаны в ДНК интерес. Этот метод может быть адаптирован к следуют многие рекомбинантные ДНК в живых клетках с течением времени.

Аннотация

Лишь немногие плазмиды природного происхождения сохраняются в клетках млекопитающих. К ним относятся геномы гамма-герпесвирусов, включая вирус Эпштейна-Барр (EBV) и герпесвирус ассоциированный с саркомой Капоши (KSHV), которые вызывают множество злокачественных новообразований у человека ^1-3. Эти два генома реплицируются лицензированным образом, каждый с использованием одного вирусного белка и клеточного аппарата репликации, и передаются дочерним клеткам при делении, несмотря на отсутствие у них традиционных центромер ^4-8.

Было проведено много работ по характеристике репликации этих плазмидных геномов с использованием таких методов, как Саузерн-блоттинг и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Однако эти методы имеют свои ограничения. Количественная ПЦР и Саузерн-блоттинг дают информацию о среднем количестве плазмид на клетку в популяции клеток. FISH представляет собой метод анализа единичных клеток, который позволяет определить как среднее число, так и распределение плазмид на клетку в популяции, но этот метод является статическим и не дает информации о родительской клетке или потомках исследуемой клетки.

В данной работе мы описываем метод визуализации плазмид в живых клетках. Этот метод основан на связывании флуоресцентно меченного белка-репрессора лактозы с множественными сайтами в интересующей нас плазмиде ⁹. В интересующую ДНК вводят примерно 250 тандемных повторов последовательности оператора лактозы (LacO). LacO специфически связывается с белком-репрессором лактозы (LacI), который может быть слит с флуоресцентным белком. Слитой белок может экспрессироваться либо из модифицированной плазмиды, либо вводиться с помощью ретровирусного вектора. Таким образом, молекулы ДНК получают флуоресцентную метку и становятся видимыми при использовании флуоресцентной микроскопии. Чтобы предотвратить связывание слитого белка с плазмидной ДНК, клетки культивируют в присутствии IPTG до момента начала наблюдения за плазмидами.

Данная система позволяет отслеживать плазмиды в живых клетках на протяжении нескольких поколений, раскрывая особенности их синтеза и распределения между дочерними клетками. Идеальными являются адгезивные клетки с крупными ядрами, которые легко подвергаются трансфекции. Этот метод был использован для определения того, что в клетках HeLa в каждом поколении синтезируется 84% плазмид, производных от EBV, и 88% вновь синтезированных плазмид точно распределяются по дочерним клеткам. Было замечено, что пары таких плазмид EBV после их синтеза в S-фазе прикреплены к сестринским хроматидам или ассоциированы с ними до тех пор, пока сестринские хроматиды не разделяются в анафазе¹⁰. В настоящее время данный метод используется для изучения репликации геномов KSHV в клетках HeLa и SLK. Клетки HeLa представляют собой иммортализованные эпителиальные клетки человека, а клетки SLK — иммортализованные эндотелиальные клетки человека. Хотя клетки SLK изначально были получены из очага поражения KSHV, ни линия HeLa, ни линия SLK естественным образом не содержат геномов KSHV¹¹. Помимо изучения вирусной репликации, этот метод визуализации может быть использован для исследования влияния добавления, удаления или мутации различных элементов последовательности ДНК на синтез, локализацию и распределение других рекомбинантных плазмидных ДНК.

Протокол

1. Инженерная клеток с видимой Плазмиды

Используйте стандартные пищеварения ограничение или гомологичной рекомбинации методов ввести фрагмент ДНК, содержащий около 250 копий лактозы последовательности операторов (Laco) в плазмиду для визуализации. Наши плазмида BACmid около 170 т.п.н. и содержит весь геном саркомы связанных Вирус герпеса Капоши (KSHV) и кодированных устойчивость к гигромицину ^12.
Представьте Laco содержащие плазмиды ДНК в клетки млекопитающих путем трансфекции с Lipofectamine 2000 года. Мы трансфицировали HeLa и SLK клеток в 60 мм блюд в течение 4 часов с 10 мкг очищенной ДНК плазмиды с 25 мкл Lipofectamine 2000 году, 0,5 мл OptiMEM, и 3,5 мл DMEM.
Изменение культуральной среде до 5 мл DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и инкубируют клетки в течение 48 часов.
Пластина клеток при низкой плотности в больших блюдах и культуре клеток в среде, содержащей антибиотик выбора для введенных плаСМИД, мы выбрали клеток в DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки с 300 мкг / мл гигромицину в течение 3 недель.
Используйте куски стерильные, трипсина пропитанной фильтровальной бумаги для передачи гигромицину устойчивых колоний в новых блюд культуры.
Когда трансфицированные клоны выросли, чтобы заполнить блюдо, выделить ДНК для ограничения пищеварения и Саузерн-блоттинга для того, чтобы полимер Laco плазмиды является однородным и ожидаемого размера.
Если плазмиды не был спроектирован, чтобы выразить слияния LacI, заразить подходящих клонов с ретровирус, кодирующий репрессор лактозы (LacI), слитый с красным флуоресцентным белком, такие как LacI-tdTomato. Мы используем tdTomato, а не белки, которые светятся ближе к зеленым, чтобы минимизировать photoxicity, что будет происходить из нескольких экспозиций в течение длительного времени ^13.
Как только белок LacI слияния вводится, культуре клеток в присутствии 200 мкг / мл изопропилового-BD-тиогалактозида (IPTG), чтобы заблокировать слияние белков из обязательныхДНК.
Культуры клеток в течение не менее 3 дней, чтобы выражение LacI-tdTomato белка.
Экран клонов (путем вымывания IPTG и просмотр клеток, как описано ниже) для тех, с оптимальным уровнем LacI-tdTomato, которые показывают различные сигналы с минимальным уровнем фона несвязанного слитого белка.

2. Развитие Imaging System

Наша система формирования изображений состоит из Zeiss Axiovert 200M оснащена моторизованной сцене и план-Aochromat 63x/1.4 нефти цели. Флуоресцентный свет возбуждения осуществляется "нейтральный белый" Светодиодные системы Colibri. Выбросы обнаруживается CascadeII: 1024 EMCCD камеры. Это охлаждением, бэк-разбавленной камера с усилением регистр для усиления сигналов; темные ток 0,061 электронов на пиксел в секунду, а квантовая эффективность больше, чем 0,90. Система управляется с помощью AxioVision 4,8 программного обеспечения, включая модуль SmartExperiments. Для обнаружения tdTomaмы используем, чтобы Zeiss 75HE набор фильтров, для которых 85% прошли свет может возбуждать фтор и 95% излучаемого света будет проходить выбросов фильтр.

Сборка системы формирования изображения с помощью инвертированного микроскопа и камеры для EMCCD чувствительны обнаружения сигналов, светодиодный источник света для конкретных возбуждением и быстрым опалубка, моторизованный фокус сцене и руки, и программное обеспечение управления для автоматизированного приобретения изображений в течение длительных промежутков времени с несколькими Z-стеки. Система должна сидеть на воздухе стол, который будет изолирован от вибраций.
Соберите этап-топ инкубаторе для поддержания клеток при 37 ° C, 5-10% CO ₂ в увлажненной камере. Разрешить достаточно времени для системы, чтобы прийти к стабильной температуры, чтобы минимизировать движение артефакты во время эксперимента.
Используйте подогревом ошейник для целей, чтобы предотвратить несанкционированный цели из тепла от образца.

3. Визуализация меченой ДНК

Пластина клеток в 35 ммсо стеклянным дном блюдо с плотностью менее 10% слияния, которое позволит пары клеток к делению в колонии 8-16 клеток без перекрытия. Сделайте это, по крайней мере, 24-48 ч перед изображениями так, что жизнеспособные клетки есть время, чтобы разделить.
От одного до трех часов до начала обработки изображений, промыть пластины 3 раза культуральной среде которых не хватает как селективные препараты и IPTG. Эта процедура смывает нежизнеспособных клеток и позволяет LacI слитых белков связывать Laco сайтов в плазмиды.
Заменить культуральной среде с 2 мл DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 25 мМ HEPES.
Замените верхнюю часть культуры блюдо с CultFoil растягивается в кольцо крепления для 35 мм блюдо. Это покрытие будет препятствовать испарению культуральной среды, что позволит увеличить концентрацию соли в течение долгого времени и убить клетки.
Использование дифференциального интерференционного контраста (DIC) для просмотра изображений клеток и определить фокальной плоскости верхней и нижней клеток в нескольких полях зрения.В каждом поле перейти к фокальной плоскости примерно 1/3 пути вниз от верхней части клетки. Сохранить X, Y, Z координаты в списке сохраненных позиций этапе.
Примечание: плазмиды сигналы могут быть не видны через окуляры, когда клетки освещении светодиоды с длиной волны подходят для гибридного белка LacI. Слабые сигналы могут быть виден только с использованием EMCCD камера, которая позволяет интегрировать сигнал с течением времени и таким образом эффективно усиливает слабые сигналы.
В программное обеспечение для управления микроскопом, определяют Z-Stack изображения должны быть выполнены на каждом этапе сохранено положение. Выберите аз шаг размере 0,35-0,50 мкм, которая позволит вам приблизить Найквиста в размерности г ^14. Включите «лишних» ломтиков выше и ниже плоскости, в которой клетки находятся, эти кусочки позволяют выявлять следующие ячейки движения во время клеточного цикла, а также используются в пост-обработке приобретение (деконволюция) изображения стеки. Это включение будетпривести в стек 40-60 изображений, в зависимости от толщины клеток.
В программное обеспечение для управления микроскопом, определить время эксперимента серию собрать яркое изображение поля Z-стеки на 30 мин интервалы (для отслеживания клеточного деления и миграции в течение длительного времени) и флуоресцентные изображения на 10-60 минутные интервалы (для визуализации плазмид внутри клеток). Не используйте DIC изображений во время эксперимента, так как он требует больше света, чем стандартные ярких изображений поле, которое может подвергать излишне клеток в фототоксичности в течение долгих экспериментов.
Запустите программу-контролируемого эксперимента. Убедитесь, что система не нарушена (столкнулась, подвергаются чрезмерным светом комнате и т.д.) в ходе эксперимента.
При необходимости пополнения воды в системы увлажнения во время эксперимента.

4. После приобретения обработка изображений

Просмотрите изображения для каждого Z-Stack и момент времени. Обрезать ненужные областиизображения для сокращения времени компьютерной обработки на следующем этапе.
Использование алгоритма деконволюции повторно назначить интенсивности сигнала на пиксель происхождения в каждом Z-Stack ^15. Хотя это деконволюция может быть основана на теоретическом функции размытия точки для системы формирования изображения, предпочтительнее для измерения функции точки распространения вашей системы визуализации флуоресцентных микросфер, и использовать это измерение в деконволюции алгоритм. Мы измерили функцию рассеяния точки нашей системы формирования изображения и применять ограничения максимального правдоподобия итерационный алгоритм в AxioVision программного обеспечения (AxioVision описание программного обеспечения, Zeiss).
Изучите изображение, чтобы отслеживать изменения интенсивности движения и плазмид во время клеточного цикла и разбиение плазмиды в дочерних клетках.