Одновременное внутриклеточной регистрации мотонейронов поясничного и силы, возникающей в ее мотор в взрослой мыши В естественных условиях

Краткое содержание

Этот новый метод позволяет одновременно внутриклеточной регистрации одного мотонейрона мыши взрослых и измерению силы, возникающей в ее мышечных волокон. В сочетании исследования электрических и механических свойств моторных единиц в нормальных и генетически модифицированных животных является прорывом для изучения нервно-мышечной системы.

Аннотация

Спинальный мотонейрон давно служит подходящей модельной системой для изучения функций нейронов, поскольку это нейрон центральной нервной системы, обладающий уникальными свойствами: (1) наличием легко идентифицируемых мишеней (мышечных волокон) и, следовательно, очень хорошо известной функцией (контроль мышечного сокращения); (2) ролью конвергентной мишени для многих спинальных и нисходящих сетей, что и определило название «конечный общий путь»; и (3) большим размером сомы, что позволяет проникать в них острыми внутриклеточными электродами. Более того, при исследованиях in vivo можно одновременно регистрировать электрическую активность мотонейронов и силу, развиваемую их мышечными мишенями. Таким образом, проведение внутриклеточных записей мотонейронов in vivo ставит экспериментатора в уникальное положение, позволяя одновременно изучать все компоненты «двигательной единицы» (название, данное мотонейрону, его аксону и иннервируемым им мышечным волокнам¹): входные сигналы, воздействующие на мотонейрон, электрофизиологические свойства мотонейрона и влияние этих свойств на физиологическую функцию мотонейронов, т. е. силу, развиваемую его двигательной единицей. Однако этот подход является весьма сложным, поскольку препарат нельзя парализовать, что снижает механическую стабильность при внутриклеточной записи. Поэтому эксперименты такого рода проводились только на кошках и крысах. Тем не менее, изучение спинальных моторных систем могло бы совершить колоссальный рывок, если бы стало возможным проводить аналогичные эксперименты на нормальных и генетически модифицированных мышах.

По техническим причинам изучение спинальных сетей у мышей в основном ограничивалось неонатальными препаратами in vitro, в которых мотонейроны и спинальные сети остаются незрелыми, мотонейроны отделены от своих мишеней, а при исследовании в срезах — от большинства своих входов. До недавнего времени лишь нескольким группам удалось провести внутриклеточную регистрацию мотонейронов in vivo^2-4 , включая нашу команду, которая опубликовала описание нового препарата, позволившего получать очень стабильные записи мотонейронов in vivo у взрослых мышей^5,6. Однако эти записи проводились у парализованных животных, i.e., без возможности регистрации силы сокращения, развиваемой этими мотонейронами. Здесь мы представляем усовершенствованный вариант этого оригинального препарата, с помощью которого удалось одновременно регистрировать электрофизиологические свойства мотонейронов и силу, развиваемую их двигательной единицей. Это важное достижение, поскольку оно позволяет идентифицировать различные типы мотонейронов на основе их силового профиля и тем самым раскрыть их функцию. В сочетании с генетическими моделями, нарушающими работу спинальных сегментарных цепей^7-9 или воспроизводящими заболевания человека^10,11, мы ожидаем, что данный метод станет незаменимым инструментом для изучения спинальной двигательной системы.

Протокол

1. Шаг первый

Предварительно анестетика лекарства: 10-15 мин до анестезии, вводят атропин (0,20 мг / кг) и methylprenidsolone (0,05 мг) подкожно, чтобы предотвратить слюноотделение и отек, соответственно.

2. Шаг второй

Индукция анестезии: инъекционные пентобарбитала натрия (70 мг / кг) или смесью кетамина / ксилазина (100 мг / кг и 10 мг / кг, соответственно) внутрибрюшинно. Пусть мышь идти под пока нет рефлекса ноги щепотку может быть получен. Если анестезии кажется слишком легким, дополнения с 1/4 от дозы.

3. Шаг третий

* Примечание: эта операция является терминал процедуры.

При хирургической анестезии плоскость была достигнута, перенесите мышью на возвышении теплое одеяло в положении лежа.

1. Накройте морду мыши с маской доставки чистой O ₂ при расходе около 100 мл / мин.
2. С помощью машинки для стрижки волос, бритья области спины от затылка до основания хвоста.
3. Бритье также право задних конечностей.
4. Переверните мышь положении лежа на спине, но будьте осторожны, чтобы оставить кислородную маску на место.

4. Шаг четвертый

Закрепить мыши на место со швами петлей вокруг конечности и закреплены на четырех углах рабочей поверхности.

5. Шаг пятый

Вставьте датчик температуры для контроля температуры мышь ядра. Отрегулируйте одеяло отопления / мощность лампы для поддержания внутренней температуры от 36 ° C до 38 ° C.

6. Трахеотомия и искусственной вентиляции

1. Использование тупыми ножницами, сделать разрез на трахее и потяните кожу от обеих сторон.
2. Использование тупым пинцетом, разорвать слюнных желез так, чтобы разоблачить две тонкие мышцы (грудинно-подъязычный), охватывающий трахеи.
3. Использование тупым пинцетом, разделить два MUSCле вдоль медиального разделения выявить трахеи.
4. Использование Дюмон 7 щипцы, сдвиньте две длины от 4,0 шелковых шва под трахеи.
5. Сделайте поперечный надрез в трахее между двумя хрящевых колец, но старайтесь не полностью раздел трахеи.
6. Вставьте трахеи трубки вниз по трахее, а затем закрепите его с обеих сторон вставки открытия, связывая нити над ним. Трахеи трубки подключены к мыши вентилятора (SAR-830/AP, КВО Inc) и капнографа (μcapstar, КВО Inc.) Вентилятор подключен через соблюдение сумку, к источнику чистой O _2. Настройте параметры вентилятора (частота дыхания 100-150 ударов в минуту, в конце-дыхательный объем 170-310 мкл), так что мышь не борется против искусственной вентиляции легких и в конце выдоха рСО ₂ стабильный между 4 и 5%.

7. Размещение внутривенного вливания

1. Использование методов тупой диссекции, подвергать яремнойвены на одной стороне шеи. На этом уровне яремной вены распадается на два основных стволов, передней и задней лицевой вены.
2. Выполните следующие шаги дважды, по одному на каждый из этих стволов:
   1. Использование Dumont 4 или 5 пинцетом, осторожно отделить вены от окружающих его соединительной ткани.
   2. Использование Дюмон 7 щипцы, сдвиньте две длины от 6,0 шелковых нитей под вены. отделить их как можно дальше вдоль вены.
   3. Нанесите небольшое судно клип на проксимальной стороне вены (сторона ближе к сердцу), и галстук с дистальной части вены.
   4. Использование очень тонкая диафрагма ножницами, сделать небольшой поперечный разрез в вену, с большой осторожностью, чтобы не раздел вены полностью.
   5. Вставьте предварительно заполненных 1FR катетер (premicath, Выгон) в отверстие, до судна клип.
   6. Проведение вену и катетер вместе в Dumont 4 пинцетом, осторожно снять судно клип, затем нажмите катетер несколько морэлектронной миллиметров в вену.
   7. Закрепить катетер, связывая его с обеих швов на обеих сторонах вставки.
3. Один из катетеров связано с шприцем или шприца для введения дополнительной дозы анестетика при необходимости (обычно каждые 10-30 мин). Дозу IV либо 6 мг / кг пентобарбитала натрия или 1250 +40 мкг / кг / мин кетамина / ксилазина ^12. Другой катетер подключен к шприцевой насос для медленной внутривенной инфузии (50 мкл / ч) 4% раствора глюкозы содержащие NaHCO ₃ (1%) и plasmion (14%).

8. Закрыть кожу шеи с иглы и шовный и вернуть мышь, чтобы положении лежа

9. Препарирование Задние конечности Мышцы и нервы

1. Используя ножницы, сделать разрез от верхней части бедра до ахиллова сухожилия. Отделить кожу от нижних мышц, стараясь не повредить кровеносные сосуды. Прижигание по мере необходимости.
2. Определить переднего края двуглавой мышцы бедра, которая выглядит как белая линия, идущая вниз по бедру. Используя ножницы, аккуратно откройте вдоль линии от колена все пути к тазовой кости. Отделить мышц. Седалищный нерв теперь видны под двуглавой мышцы бедра.
3. Осторожно рассекают двуглавой мышцы бедра. Прижигание / вязи, необходимых для предотвращения кровотечения. Двуглавой мышцы бедра может быть полностью удалены или просто лежа, чтобы разоблачить седалищного нерва и трицепс голени мышц.
4. Проанализируйте из Sural нерва.
5. Использование 8/0 шелковой нитью, связать дистальной части общего малоберцового нерва и сократить дистальнее узел. Проанализируйте нерва вплоть до, как можно ближе к хип насколько это возможно.
6. Определить большеберцового нерва между ними общего малоберцового и Sural нервы. Среди различных ветвей большеберцового нерва, определить ветвей, иннервирующих трицепс голени с веток, которые идут глубже (далее именуемый большеберцового нерва).
7. Использование 8/0 шелканить, связать воедино все ветви большеберцового нерва при сохранении нетронутыми ветви, иннервирующие трицепс голени. Вырезать большеберцового нерва дистальнее узел и анализировать нерва вверх насколько это возможно.
8. Охват целого задних конечностей марлей впитал с физиологическим раствором для предотвращения высыхания в то время как приступить к следующему шагу.

10. Ламинэктомия

1. Используя ножницы, сделать надрез вдоль позвоночника. Отделить кожу от нижних мышц.
2. Сделать два надреза на каждой стороне позвонка отделить подкожные мышцы. Затем разрезать каждый сухожилия мышц, которые прикрепляются на стороне позвонка с каждой стороны.
3. Использование тупым пинцетом и штраф кюретки, удалите оставшуюся часть мышц на спинной стороне позвонков вокруг остистого отростка четко идентифицировать каждого позвонка.
4. Определить позвонки T13 и L1. T13 является последним позвонком, чтобы ребра прилагается. Позвоночного столба WЯ буду иммобилизованных помощью Cunningham спинного мозга позвоночных зажимы (Stoelting Co.) Поместите спинного зажимы с каждой стороны T13 и L1. Будьте осторожны, чтобы не сжимать спинного мозга, но положить немного напряжения в продольной оси. Убедитесь, что позвоночник хорошо защищена, нажав аккуратно пинцетом.
5. При использовании тонкой rongeurs, удалить спинной процессов, то пластинки над T13 и L1, тем самым подвергая спинного мозга.
6. Изолируйте открытый спинной мозг с небольшой бит из хлопка или spongel впитал с физиологическим раствором, чтобы предотвратить высыхание.
7. Разместить заказ пластиковой ванны на верхней части спины, окружающие спинной мозг. Закрепите ванну на месте с помощью 4/0 шелковой нитью. Убедитесь, что баня является водонепроницаемым, закрыв его с Kwik-Cast герметик (WPI).
8. После Kwik-Cast высохнет, снимите хлопка покрытие спинного мозга, и наполняйте ванну с минеральным маслом.
9. Использование Дюмон 5 щипцы и очень тонкая диафрагма ножницами, осторожно потяните на мат оболочкиГ окружающий спинной мозг, и открыть его как можно дальше в обоих направлениях. Сложите оболочку с каждой стороны спинного мозга.
10. Опустите поднятой платформе, на которой лежит мышь, чтобы держать его приостановлено позвоночного зажима.
11. С помощью другого позвоночного зажима для фиксации остистого отростка крестцовой области для поддержки спины области животного.
12. Третий зажим используется для иммобилизации правой задней конечности и голеностопного сустава, согнутой под углом 90 ° угол в колене.

11. Ахиллова сухожилия Dissection

1. С конечности согнуты под углом 90 ° в колене и в лодыжке, снимите марлю охватывающие задние конечности области, и анализировать ахиллова сухожилия бесплатно окружающие ткани. Проанализируйте как можно больше трицепс голени от окружающих тканей, а также.
2. Разрежьте сухожилие Plantaris мышц близка к пяточной кости, а затем вырезать его снова, чтобы удалить сухожилия полностью.
3. Используя резьбовые иглу, приложите 6/0 шелковой нитью через йэлектронной ахиллова сухожилия и сделать тройной узел вокруг сухожилия.
4. Поместите датчик силы близко к узлу, сократить дистальной части сухожилия, и приложите его к силе преобразователь помощью шелковой нити.
5. Вставьте два отрезка проволоки из нержавеющей стали под фасции мышц трицепс голени. Эти провода подключены к усилителю внеклеточной переменного тока для ЭМГ.
6. Поместите общий малоберцовый нерв и большеберцового нерва на двух биполярных электродов крючком.
7. Поместите нерва трицепс голени на катоде крючок электрода, с анодом прикосновения поблизости мышцы.
8. Подключить все стимулирующие электроды для изоляции блока.
9. Поместите шарик электрода на дорсальной поверхности спинного мозга, связанных с внеклеточным усилителя переменного тока для записи шнур спины потенциалов. Поместите Ag / AgCl электрод в контакте с задней мышцей.

12. Шаг двенадцатый

Стимулировать нерва трицепс голенис использованием 50 мкс прямоугольного импульса повышения интенсивности низких частот (<1 Гц) до максимальной амплитуды дергаться не наблюдается. Медленно перемещайте датчик силы, чтобы растянуть мышцы, контролируя амплитуду дергаться ответа пока не дергаться амплитуда достигает максимального значения.

13. Внутриклеточные записи мотонейронов

С этой точки зрения, стандартные электрофизиологические методы используются для подготовки внутриклеточного электрода, проникают нейронов в спинном мозге и определить его как МН.

1. Вытяните стекло микропипетки на ~ 1 мкм наконечник с помощью пипетки съемника (P-97 микропипетки съемник, Sutter Instruments). Заполните электрода с раствором KCl 3M (сопротивление электрода 10-20 МОм).
2. Использование микроподвижки, ездить микропипетки, связанных с внутриклеточными усилителя (Axoclamp 2B, Axon Instruments) в спинной мозг. Мониторинг локальных потенциалов поля вызванной стимуляцией электроннойАх нервов, чтобы найти двигатель бассейне голени трицепсы.
3. Осторожно подходить предполагаемого мотонейронов при мониторинге сопротивление микроэлектрода. При нажатии на мембрану, сопротивление увеличивается. Проникновение иногда может быть облегчена с помощью "шум" функции внутриклеточных усилителя.

14. Процедура эвтаназии

В конце эксперимента, животное усыпляют от передозировки пентобарбитала (210 мг / кг), а затем обезглавливание.

Результаты

На рисунке 1 показано, как определить мотонейрона из группы трицепс голени после проникновения. При низкой интенсивности стимуляции, только моносинаптических ВПСП могут наблюдаться (рис. 1А). При более высокой интенсивности, ВПСП может быть достаточно большой, чтобы вызвать "ортодромном" шип (рис. 1б). При еще более высоких интенсивности стимуляции, все-или-ничего антидромной всплеска оказывается, с более короткой задержкой, чем моносинаптических ВПСП (рис. 1С)....

Обсуждение

Подготовка описано здесь является первой, которая позволяет, во взрослой мыши, одновременное внутриклеточной регистрации поясничных мотонейронов и измерению силы, возникающей в мышечные волокна иннервируются ее аксона.

Из-за малого размера животного, хирургические навыки, необходимые для этого препарата может быть сложной задачей приобрести. Однако, как только эти навыки освоены, вся операция может быть выполнена в течение трех часов, и животные могут выжить в течение 7 более часа после окон...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Атропина сульфата	Aguettant
Methylprenidsolone	Pfizer	Солу-Медрол
Натрий pentobarbitone	Sanofi-Aventis	Пентобарбитала
Кетамин
Ксилазин
Глюкоза
Плазменные расширитель	Роджер Bellon	Plasmagel
Тупыми ножницами	FST	14079-10
Блант прекрасно ножницы	FST	15025-10
Vannas Весна Ножницы	FST	15002-08
Изобразительное щипцы зубчатые	FST	11370-32
Изобразительное щипцы зубчатые	FST	11370-31
Каннингем спинного адаптер	Stoelting Ко
Kwik-Cast герметика	WPI	# Kwik-CAST
Вентилятор	КВО Inc	SAR-830/AP
Капнограф	КВО Inc	μcapstar
Отопление одеяло	Harvard Apparatus	507221F
Внутриклеточные усилитель	Axon InstrumeНТС	Axoclamp 2B
Внесите съемника	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G