Простой протокол для опосредованного тромбоцитами слипания Малярийного плазмодия-Инфицированных эритроцитов в условиях ограниченных ресурсов Настройка

Summary

Этот метод исследует тромбоцит-опосредованных слипания фенотип Малярийного плазмодия-Инфицированных эритроцитов (PRBC) в клинических изолятов. Это осуществляется путем выделения и совместной инкубации плазмы, обогащенной тромбоцитами и суспензии PRBC.

Abstract

P. falciparum вызывает большинство тяжелых малярийных инфекций. Патофизиологические механизмы, лежащие в основе церебральной малярии (КМ), до конца не изучены, и было выдвинуто несколько гипотез, включая механическую обструкцию микрососудов эритроцитами, паразитирующими на P. falciparum. Действительно, на внутриэритроцитарной стадии своего жизненного цикла P. falciparum обладает уникальной способностью модифицировать поверхность инфицированного эритроцита путем экспорта поверхностных антигенов с различными адгезивными свойствами на мембрану эритроцитов. Это позволяет секвестрировать pRBC во многих тканях и органах путем адгезии к эндотелиальным клеткам, выстилающим микроциркуляторное русло посткапиллярных венул ¹. Таким образом, зрелые формы паразита избегают выведения селезенки из деформированных инфицированных эритроцитов ² и ограничивают среду обитания до более благоприятного низкого давления кислорода ³. Как следствие такой секвестрации, в периферической крови могут быть обнаружены только незрелые бесполые паразиты и гаметоциты.

Цитоадгезия и секвестрация зрелого pRBC к многочисленным рецепторам хозяина, экспрессируемым на микрососудистом русле, происходит при тяжелом и неосложненном заболевании. Тем не менее, несколько линий данных свидетельствуют о том, что только определенные адгезивные фенотипы, вероятно, связаны с тяжелыми патологическими исходами малярии. Один из примеров такого специфического взаимодействия хозяина и паразита был продемонстрирован in vitro, где способность молекулы межклеточной адгезии-1 поддерживать связывание pRBC с определенными адгезивными свойствами была связана с развитием церебральной малярии4,5. Плацента также была признана местом преимущественного накопления пэритроцитов у беременных женщин, инфицированных малярией, при этом хондротинсульфат А экспрессируется на синцитиотрофобластах, выстилающих плацентарное межворсинчатое пространство, в качестве основного рецептора ⁶. Проникновение pRBC в неинфицированные эритроциты через рецептор комплемента 1 (CD35)^7,8 также было связано с тяжелым заболеванием ⁹.

Одним из наиболее недавно описанных фенотипов цитоприлипания P. falciparum является способность pRBC образовывать тромбоцитарно-опосредованные скопления in vitro. Для образования таких скоплений pRBC требуется CD36, гликопротеин, экспрессируемый на поверхности тромбоцитов. Другой рецептор человека, gC1qR/HABP1/p32, экспрессируемый на различных типах клеток, включая эндотелиальные клетки и тромбоциты, также способствует адгезии pRBC на тромбоцитах с образованием сгустков ¹⁰. Происходит ли слипание in vivo, остается неясным, но это может объяснить значительное накопление тромбоцитов, описанное в микроциркуляторном русле мозга малавийских детей, умерших от CM ¹¹. Кроме того, способность клинических изолятивных культур к комкованию in vitro была напрямую связана с тяжестью заболевания у пациентов из Малави (¹²) и из Мозамбика (но не у ¹⁴ из Мали).

Поскольку некоторые аспекты фенотипа скопления pRBC плохо охарактеризованы, текущие исследования по этому вопросу не следовали стандартизированной процедуре. Это важный вопрос из-за известной высокой вариабельности, присущей анализу ¹⁵. В данной статье мы представляем метод in vitro тромбоцитарного компрессования P. falciparum в надежде, что он послужит платформой для последовательного метода для других групп и повысит осведомленность об ограничениях в изучении этого фенотипа в будущих исследованиях. Находясь в Малави, мы предоставляем протокол, специально разработанный для ограниченных ресурсов, с тем преимуществом, что свежесобранные клинические изоляты могут быть исследованы на фенотип без необходимости криоконсервации.

Protocol

1. Сбора проб

Тромбоциты можно легко активировать с помощью температуры, возбуждение или хранения и, следовательно, они должны быть обработаны с осторожностью. Использование вакутейнеров собрать кровь для препаратов тромбоцитов неизбежно в большинстве клинических ситуаций, но должны быть тщательно продуманы, как всасывание может потенциально вызвать активацию тромбоцитов. В связи с клиническим протоколом, используемым в нашем центре научно больнице, наши образцы были тщательно собраны в вакутейнеров цитрат натрия. Мы не испытывали никаких проблем с преждевременной активации тромбоцитов в той или наши предыдущие исследования ^12. Мы собираем крови тромбоцитов препарат из группы крови O + лиц, чтобы минимизировать неспецифическое группы крови антиген агрегации. Доноры также не принимал лекарства в предыдущие 7-10 дней, как некоторые лекарства, как известно, влияют функции тромбоцитов.

1.1 Подготовка обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP)

1. Соберите примерно 5 млцельной крови от малярии наивные хоста или 2,5 мл крови из см или тяжелой формой малярии (SM) пациентов в Vacutainer цитрат натрия (BD номер продукта 36276).
2. Центрифуга цельной крови при 250 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Не центрифугировать при 4 ° С в виде низких температурах может привести тромбоцитов к агрегации.
3. Тщательно передачи облачно супернатант в чистую 15 мл трубки. Тромбоциты легко активируются изменением температуры и механическим ударам и поэтому должны быть обработаны с осторожностью. Избегайте встряхивания или любой судорожные движения трубки.
4. Использование haematocytometer Neubauer, чтобы рассчитывать и регулировать суспензии тромбоцитов до> 300 × 10 ³ тромбоцитов / мкл в течение здоровых доноров и <150 × 10 ³ тромбоцитов / мкл с КМ и SM пациентов с использованием 1X фосфатным буфером (рН 7,2-7,4; PBS). Убедитесь в том, чтобы выбрать высокий коэффициент разбавления, чтобы облегчить тромбоцитов и обеспечения ее достоверности.

Примечание: Малярия погладитьients имеют уменьшенное количество тромбоцитов по сравнению со здоровыми лицами ^16,17,18. Поэтому концентрации тромбоцитов в СМ и UM корректируются в соответствии со средним числом тромбоцитов у пациентов в каждой малярии диагностические группы. P. тропической слипания фенотипа является общим в CM изолятов и отображает сильное сродство поэтому пониженной концентрации тромбоцитов не влияет на размер или частоту комок с концентрацией тромбоцитов стандартизирован для всех случаев CM.

1.2 Подготовка бедной тромбоцитами плазмы (БТП)

1. Для получения ППС, центрифугируют часть PRP полученные выше при 1500 х г в течение 10 мин. Большинство тромбоцитов осаждают в нижней части трубки.
2. Оба PRP и РРР можно хранить при температуре 4 ° С в течение двух недель. В идеале, используйте свежие тромбоциты для слипания анализа. Через 8-10 дней большинство тромбоциты могут быть неактивными и, возможно, агрегированных.

2. ПунктыITE культуры

1. Промыть гранулированные PRBC три раза с 5-10 мл среды RPMI 1640 центрифугированием при 370 х г в течение 5 мин.
   Примечание: в этом протоколе всех культур начался примерно 1 мл упаковке объемом ячейки (PCV) и выдерживают при 5% гематокрита. Культура может быть запущена с любого из PCV PRBC и соответствующим образом скорректированы с неинфицированных РБК и массовой информации для достижения желаемых гематокрита.
2. Поместите PRBC в колбе культуры и добавка со стандартной культуральной среде малярии RPMI 1640 с добавлением 25 мМ HEPES, 5% Albumax II или 10% сыворотки и 40 мкг / мл гентамицина для достижения 5% гематокрита.
3. Пермеата колбах с культурой смесью 92,5% азота, 2,5% кислорода и 5% диоксида углерода перед закрытием и инкубации. С другой стороны, герметичный сосуд свечи методом Трагер-Jensen могут быть использованы.
4. Для PRBC получена непосредственно от пациентов, инкубировать их культуру колбу для 24-36 часов в 37 ° C инкубаторе в 5% СО _2, чтобы получить зрелых паразитов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: MOST лаборатории и культуры адаптированные линии очень легко поддерживать в культуре при стандартных условиях. Есть простые способы, описанные ниже, которые можно использовать для синхронизации различных стадий паразита, чтобы сохранить скорости роста.
5. Подготовьте тонкий мазок крови, как описано ниже и изучить паразита созревания под световым микроскопом.

3. Тонкий мазок крови по подготовке слайдов

1. Поместите приблизительно 10-15 мкл крови на одном конце слайд матового стекла лежит на плоской поверхности.
2. Прикоснитесь каплей крови с краем второй слайд, пока кровь не равномерно распределены по краю второй слайд.
3. Удерживая второй слайд на угол 45 °, быстро, но осторожно, не оказывая слишком много давления на первом слайде, сдвиньте крови через первый слайд, чтобы сделать тонкую пленку крови, которая равномерно распределена. Воздух сухой.
4. Погрузите слайд в метаноле в течение 10 сек. Воздух сухой.
5. Погрузите слайд в 2%-й Гимзаайн по крайней мере 10 мин. Промыть широко, пока вода не станет чистой. Воздух сухой.
6. Изучить слайд, используя 90-100X масле объектив на световом микроскопе

4. Очистка и синхронизация бесполого Этапы

Очистка зрелого P. тропической PRBC является необходимым шагом для слипания анализа. Действительно, только зрелые паразиты способны связываться с рецепторами тромбоцитов, как это на данном этапе жизненного цикла, что соответствующие лиганды выражены и выступают из поверхности инфицированных эритроцитов. Есть несколько способов, чтобы очистить и синхронизации бесполых стадий P. тропической: Поздно бесполых стадий может быть обогащен перколлом градиент ^19; магнитные сортировки клеток ²⁰ или с помощью желатина осаждения ²¹ Протокол, описанный здесь.. Сорбит синхронизации выбирает для кольцо стадии ^22, после чего кольца культивируют в течение 24-26 ч, чтобы получить зрелой стадии (без нEed выполнять желатина флотации).

4,1 Plasmagel флотации

Plasmagel флотации используется желатин-подобные решения, чтобы выбрать для меньшего веса сулавесский эритроцитов оставаться в растворе в то время как плотное кольцо формы и розетками опускаться на дно. Эта методика дает до 90% чистоты зрелой стадии инфицированных эритроцитов и может быть использован как для полевых и лабораторных штаммов. Однако, как упоминалось ранее, plasmagel флотации удаляет розеткообразования PRBC а также незрелых стадий, которые могут привести к уменьшению слипания частоты в этих пробах с высокой частотой розеткообразования. Тем не менее, отсутствие розеткообразования PRBC после флотации plasmagel не повлияет на анализ, потому что наносить удар розеткообразования является взаимодействие PRBC и неинфицированных эритроцитов при слипания является обязательным pRBCs опосредованного тромбоцитами. Лигандов, участвующих в этих двух признаков отличается, в основном с дополнением рецепторов CR-1 на неинфицированных эритроцитов посредническую розеткообразования.

1. Prewarm решение Gelofusine и сыворотки / Albumax II среде без до 37 ° С на водяной бане.
2. Передача культуры в чистую стерильную 15 мл пробирку и осадок клеток путем центрифугирования при комнатной температуре при 370 х г в течение 5 мин.
3. Тщательно аспирата супернатант, чтобы не беспокоить и ресуспендируют осадок клеток в равном объеме Gelofusine и белков среды.
4. Передача смесь в стерильный 15 мл трубки и дайте настояться в течение 15-20 мин при 37 ° С инкубатор или пока четкого разграничения не видно между верхним и нижним уровнем.
5. Тщательно передачи верхнего слоя на свежую стерильную 15 мл пробирку и добавляют 10 мл свежей RPMI.
6. Центрифуга при 370 мкг в течение 5 мин и тщательно отбросить супернатант.
7. Оцените паразитемией и стадия развития на тонкий мазок крови и исследовать под световым микроскопом, как описано в разделе 4.

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожилые PRBC диапазоне между 60-90% зараженных эритроцитов dependiнг на начальном паразитемии культуры. За высокий процент зрелых паразитов, используйте культур с начальной паразитемией ≥ 10%.

5. Анализ Clumping

1. Используйте haematocytometer Нойбауэра, чтобы рассчитывать и регулировать PRBC суспензии, полученной после plasmagel флотации для 1 х 10 ⁸ PRBC / мкл.
2. В свежем 1,5 мл пробирку, ресуспендируют PRBC при 5% гематокрита акридинового оранжевого при 20 мкг / мл конечная концентрация и PRP 10% от общего объема.
   Вместо акридинового оранжевого, паразит культуры могут быть окрашены с 25 мкг / мл этидий-бромидом в течение 5 минут перед использованием.
   Например, для 200 мкл реакционной смеси, добавить 10 мкл зрелый PRBC 20 мкл 300 × 10 ³ тромбоцитов / мкл в течение PRP от здоровых доноров или 150 × 10 ³ тромбоцитов / мкл у больных СМ и 170 мкл содержащей белков.
   Примечание: отношение тромбоцитов: PRBC в конечной реакции составляет 20:1. Это важно, поскольку это позволяет Максимгм слипания частота выборки не определена. Если число тромбоцитов добавляются в контрольной то не все слипания pRBCs может иметь шанс комок.
3. Таким же образом подготовить следующую контроля; неинфицированных эритроцитов и PRP, и PRBC с ППС выяснить роль тромбоцитов в слипания pRBCs.
4. Передача суспензии до 1,5-2,0 мл конической винтовой крышкой флакона.
5. Помещают пробирку при легком перемешивании при прокатке на 10-12 мин при комнатной температуре.
6. Проверьте скопление формирования мокрым слайд-подготовлены с помощью пипетки 10 мкл PRBC ± тромбоцитов смеси на предметное стекло, накрывают стеклом поскользнуться и изучить в соответствии флуоресценции.
7. Выборка может быть сделано на 15-20 минутных интервалов в общей сложности 120 минут. Скопление рассматривается как совокупность трех или более эритроциты.

Results

Пример тромбоцит-опосредованных комок анализа с использованием приблизительно 70% зрелых стадий P. тропической после обогащения методом флотации plasmagel показано на рисунке 2. Скопление представляет собой совокупность трех или более эритроциты. Окрашивание акридинового оранжевого или бромистым этидием могут быть визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии. Акридинового оранжевого спектрально аналогичные флуоресцеин, с возбуждением максимумом при 502 нм и максимум эмиссии при 525 нм (зеленый), в то время как бромистый этидий имеет максимум при возбуждении 493 нм и максимум эмиссии при 620 нм (как родамин красители, красный ). Глыбы легко обнаружить под микроскопом, как при нормальном освещении они выглядят как клеточные агрегаты и под флуоресценции в виде пятен зеленого или красного при окраске акридиноранжа или красителей этидия бромид, соответственно, как показано на рисунке 2 (30 мин времени точки с помощью акридиноранжа ). Чем больше сгустки, тем больше клетки совокупность появляется ипдер нормальный свет и большие пятна зеленого или красного под светиться для соответствующих красителей. Поскольку ДНК красителей мишени, а следовательно пятно ядра, тромбоциты и неинфицированных РБК не выявляются в флуоресцентной микроскопии из-за отсутствия ядер.

Случайное образование мелких скоплений PRBC 4,7 ± 1,6 pRBCs / комок происходят после 30 мин. Комок размер значительно повышает в среднем> 15 PRBC / сгустки после инкубации в течение 120 мин с некоторыми сгустки содержащие многочисленные PRBC / комок, который не может быть визуально подсчитывали. Частота слипания фенотип рассчитывается как число инфицированных клеток, присутствующих в сгустки / 1000 инфицированных клеток, рассчитывали в двух экземплярах анализов.

Рисунок 1. Набор операций, слипания эксперимента. Тромбоцитами RICH и плазмы, обедненной (А) и P. тропической инфицированных эритроцитов культуры (В) получают, а затем объединяются для слипания анализ (C).

Рисунок 2. Слипание эритроцитов заражены P. тропической лаборатории изолировать. Clumps образована НВ3 в момент времени 0, 30 и 120 мин в обогащенной тромбоцитами плазмы (А) и плохого формирования комок в бедной тромбоцитами плазмы (B).

Ограничения анализа

Существуют ограничения, непосредственно затрагивающих эту функцию тромбоцитов или влияния на исход, и большинство из них уже были выделены и Арман Роу ^15. Здесь мы упомянем некоторые из потенциальных проблем, которые могут возникнуть в Differeнт этапы анализа:

1. Адаптация клинических изолятов в культуре пробирке может быть проблемой, так как иногда более длительных периодов культуры требуются для того, чтобы достичь достаточно высокой паразитемии, чтобы позволить образование сгустков. С высокой антигенной изменчивости цены в P. тропической, клей фенотип культуры адаптированные паразита, может не соответствовать оригинальным заражение паразитом населения после длительного раза в культуре.
2. Для того чтобы избежать неспецифической агглютинации из-за антигенов группы крови, тромбоцитов доноры должны быть согласованы крови антиген группы клинических изолятов, используемых в том же самом анализе, или универсальной донорской крови антиген группы О использованы. Однако у лиц с группой крови O-редки в африканских объектов, таких как Малави и, следовательно, тромбоциты обычно используется получаются из группы крови O + доноров и должны быть подобраны по группе крови.
3. Подсчет сгустки на мокрой подготовки слайд является громоздкой и сложной для захвата изображения, как слокти находятся в постоянном движении. Как правило, PRBC накапливаться на краях покровного стекла или они имеют тенденцию к слипанию формирование "ложных" сгустки, которые могут быть легко спутать с реальным сгустки. Для того чтобы уменьшить движения клеток, позволяют клеткам осадка в течение 15 мин при комнатной температуре перед проведением анализа.
4. Слипания анализа является срочным, и поэтому только позволяет анализируемого образца на человека в то время, для оптимальной точности. Время выборки пунктов для двух различных образцов могут легко перекрываться, в результате несоответствующие моменты времени выборки между образцами, если обрабатывать более одного образца в то же время. При таких обстоятельствах, сложный количественный программное обеспечение может вычислить комок размеров или, альтернативно, клетки-специфичные антитела могут быть использованы для анализа состава сгустки. Хотя эти методы могут значительно повысить значимость данным, в условиях ограниченных ресурсов, где этого анализа, вероятно, будет использоваться такие методы и оборудование не являются легкодоступными.

Discussion

Мы описали тромбоцит-опосредованных слипания анализ используется для изучения PRBC в клинических изолятов непосредственно в поле. Тромбоциты-опосредованной слипания, характерное поведение в P. тропической клинических изолятов, была определена как отдельный фенотип клея, частые в CD36-связывающего изолятов ^12,23-24. Мы использовали эту пробу выделить три основных момента: 1) сильного слипания в пробирке фенотип P. тропической изолированы от Малави детей, который связан с тяжестью заболевания и диагноз 2) новый рецептор Р-селектина mediaties слипания на тромбоциты вместе с CD36, 3) степень тромбоцитопении у пациентов с СМ является достаточной для того, дальнейшее формирование PRBC сгустки в пробирке ^12. Участие тромбоцитов в комок формирования демонстрируют изучения мокрый слайд подготовки, как описано в разделе 6. Тромбоциты могут быть выделены из PRP центрифугированием при высоких скоростяхдля того, чтобы минимизировать крови реакции антигенной группе, однако мы использовали весь PRP с целью минимизации преждевременного активации тромбоцитов от чрезмерной обработки и от высокоскоростного центрифугирования. Тромбоцитов активность может быть измерена путем агрегации тромбоцитов тест помощью слабых агонистами тромбоцитов, адреналин или аденозиндифосфат (ADP) ^25, как описано в ^26.

Есть несколько аспектов анализа, которые ранее были слабо изучен, одной из которых является важность выбора PRP источников и эффект группы крови антиген о результатах анализа. Мы подготовили PRP от лиц, которые были группой крови O + и не принимал никаких лекарств в последние 7-10 дней до крови рисуется как некоторые фармацевтические тромбоцитов может повлиять поведение.

Другие факторы, которые могут влиять на слипание успехом включать PRBC гематокрит, уровни паразитемии и длина слипания анализа. Использование высоких гематокрита и тромбоцитов сотрудничестваЕНТ было бы трудно сказать, является ли кластер действительно глыба или же слишком много клетки просто сидят вместе, потому что они плотно упакованы ^15. Clumping также обычно возрастает с увеличением больше времени инкубации. Все эти полезные рекомендации, которые следует учитывать при проектировании слипания исследований.

Мы считаем, что образцы из различных клинических групп могут быть проанализированы параллельно, используя PRP от того же донора, если это возможно, чтобы сделать это, но в условиях ограниченных ресурсов, таких как поля сайтов переливания бассейна, как правило, ограничен. Поэтому трудно иметь единый + O донором для стандартизации анализов. Поэтому мы определили несколько O + донорами для обеспечения совместимости группы крови там, где это возможно. Использование нескольких доноров также полезно в случаях больших размеров выборок, и поэтому бремя донорство крови не падает только на одного человека.

Отбора проб, в 15-20 минутах гораздо более реальным, если одного PErson проводит анализы, позволяющие мокрый слайд препаратов и выполнении анализа кинетики время выборки без перекрытия. Большинство микроскопических данные визуально и несколько целей, и поэтому важно, чтобы подсчет клеток проверяется более чем одним человеком. В этом случае, при обработке одного образца за один раз может позволить полный анализ 3:57 образцов в день в зависимости от личной эффективности.

Тромбоцит-опосредованных слипания может быть выполнена с использованием клинических и лабораторных штаммов. Для лабораторных линий, рекомендуется связывание CD36 паразитов, которые используются для максимального слипания частот. Анализ может быть соединена с другими анализа агглютинации, такие как розеткообразования или использованы в тестах на ингибирование слипания, которые позволили бы изучению рецепторов на тромбоциты, которые могут опосредовать PRBC связывания, мало изучены и исследованы аспект этого фенотипа.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Invitrogen	21870-092
Acridine orange	Invitrogen	A3568	10 мг/мл
Gelofusine	B Braun	Gelofusine
1 M HEPES	Invitrogen	15630
Gentamycin	Invitrogen	15750045	50 мг/мл
Albumax	GIBCO	1102-037
Вакутейнер цитрата натрия	BD	362760	емкостью 4 мл
Инвертированный микроскоп	Leica	MD16000
Флуоресцентный микроскоп	Leica	EL6000	Содержит флуоресцентные фильтры синего и зеленого света для акридина, оранжевого и бромида этидия