Методическая статья

Одновременное электроэнцефалография, в режиме реального времени измерения концентрации лактата и Optogenetic Манипуляция активности нейронов в коры головного мозга грызунов

DOI:

10.3791/4328

⸱

19 декабря 2012 г.

 ,  ,  , 
1Department of Veterinary & Comparative Anatomy, Pharmacology and Physiology, Sleep and Performance Research Center, WWAMI Medical Education Program, Washington State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедура описана для управления деятельностью коры головного мозга пирамидальных нейронов optogenetically в то время как электроэнцефалограммы, электромиограммы, и церебральной концентрации лактата контролируется. Экспериментальные записи выполняются на кабельно-привязанный мышей, когда они подвергаются спонтанному сон / бодрствование циклы. Optogenetic сборки оборудования в нашей лаборатории; записывающее оборудование является коммерчески доступным.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя мозг составляет менее 5% тела по массе, он использует примерно одну четверть глюкозы, используемой организмом в состоянии покоя1. Функция сна без быстрого движения глаз (NREMS), самой большой части сна по времени, неясна. Тем не менее, одной из характерных особенностей NREMS является значительное снижение скорости утилизации глюкозы в мозге по сравнению с бодрствованием2-4. Это и другие результаты привели к широко распространенному мнению, что сон выполняет функцию, связанную с мозговым метаболизмом. Тем не менее, механизмы, лежащие в основе снижения метаболизма глюкозы в мозге во время NREMS, еще предстоит выяснить.

Одно из явлений, связанных с NREMS, которое может повлиять на скорость мозгового метаболизма, - это появление медленных волн, колебаний на частотах менее 4 Гц, на электроэнцефалограмме5,6. Эти медленные волны, обнаруженные на уровне черепа или поверхности коры головного мозга, отражают колебания нижележащих нейронов между деполяризованным/верхним состоянием и гиперполяризованным/подавленнымсостоянием. В выключенном состоянии клетки не подвергаются потенциалам действия в течение интервалов до нескольких сотен миллисекунд. Восстановление градиентов ионной концентрации после потенциалов действия представляет собой значительную метаболическую нагрузку на клетку8; Отсутствие потенциалов действия в подавленных состояниях, связанных с NREMS, может способствовать снижению метаболизма по сравнению с пробуждением.

Необходимо было решить две технические проблемы, чтобы проверить эту гипотетическую взаимосвязь. Во-первых, необходимо было измерить церебральный гликолитический метаболизм с временным разрешением, отражающим динамику церебральной ЭЭГ (то есть в течение секунд, а не минут). Для этого мы измерили концентрацию лактата, продукта аэробного гликолиза и, следовательно, скорость метаболизма глюкозы в мозге мышей. Лактат измеряли с помощью датчика реального времени на основе лактатоксидазы, встроенного в лобную кору. Чувствительный механизм состоит из платино-иридиевого электрода, окруженного слоем молекул лактатоксидазы. Метаболизм лактата лактатоксидазой приводит к образованию перекиси водорода, которая производит ток в платино-иридиевом электроде. Таким образом, наращивание гликолиза головного мозга приводит к увеличению концентрации субстрата для лактатоксидазы, что затем отражается в увеличении тока на чувствительном электроде. Кроме того, необходимо было измерить эти переменные при манипулировании возбудимостью коры головного мозга, чтобы изолировать эту переменную от других аспектов NREMS.

Мы разработали экспериментальную систему для одновременного измерения активности нейронов с помощью электроэнцефалограммы, измерения гликолитического потока с помощью биосенсора лактата и манипулирования активностью нейронов коры головного мозга через оптогенетическую активацию пирамидальных нейронов. Мы использовали эту систему для документирования взаимосвязи между электроэнцефалографическими волнами, связанными со сном, и динамикой концентрации лактата в коре головного мозга от момента к моменту. Протокол может быть полезен для любого человека, заинтересованного в изучении взаимосвязи между активностью нейронов, измеренной на электроэнцефалографическом уровне, и клеточной энергетикой в мозге.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Хирургическая подготовка животных

1. Испытуемых

Используйте мышей B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J трансгенной линии 9; JAX штамм # 7612) или других мышей, экспрессирующих синие светочувствительных катионов канал, Channelrhodopsin-2, в коры головного мозга нейроны. Применение синего света в коре головного мозга B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J линию трансгенных вызывает пирамидальные нейроны, экспрессирующие Channelrhodopsin-2 для деполяризации и пройти потенциалы действия 9,10. Как следствие пирамидальной активации клеток, местные интернейроны будут активированы, и изменение потенциала распространяется на нейроны за пределами площадки стимуляции 10. Выполнить операции в стерильных условиях в соблюдении применимых нормативных принципов: автоклаве хирургические инструменты и softpacks (операционного поля, марлевые прокладки); горячая борта стерилизовать все тепло терпимым имплантированных металлических устройств (канюли, винты и провода)для 30-сек; Лечить тепла непереносимостью имплантируемых устройств (волоконно-оптический кабель, пластиковый разъем) с 10-секундный провал в этанол; удар этанола ближнего пунктов сухой применением сжатым воздухом.

2. Анестезия, Стереотаксическая размещения и оформления черепа

Используйте IMPAC 6 Интегрированные нескольких пациентов (Vet Если на персонаже Inc) системы, чтобы обезболить мыши. Используйте 5% Isoflurane/95% кислорода для индукции и 3% Isoflurane/97% кислорода для поддержания во время операции. Поместите животное на циркуляцией воды одеяло установлена ​​на 37 ° С. Не нужно контролировать температуру тела, если одеяло выдерживают при этой температуре.

3. Подготовка черепа для имплантации

Подготовьте место разреза после бритья все меха из верхней части черепа. Побрился область должна проходят сбоку от уха до уха и передне-заднего от глаз к заднему концу черепа. Лечить открытые участки кожи с тремя consecutivэлектронной мазки бетадин следует этанола. Сделайте медиальный разрез в верхней части черепа, из промежутка между глазами к задней части черепа. Очистите череп с перекисью водорода и стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl). Управление кровотечения с прижигание инструмент. Найдите и отметьте брегмы и лямбда для определения стереотаксических координат. Стереотаксическая координаты для электрода / optogenetic стимул конфигураций, которые мы использовали представлены в таблице 1 и схематически показано на рисунке 1а.

4. Подготовка к имплантации сайтов на череп

Используйте высокую скорость бормашины с 0,5 бит мяч заусенцев установить каждом участке имплантации в черепе. Фаска внешнего края каждого отверстия с помощью 0,7 мм мяч заусенцев немного для облегчения винта.

5. Вставка и крепления канюли, ЭМГ и ЭЭГ снабжении покупателей

Вставьте ЭЭГ винтов (0,8 мм в длину, 2 см без покрытия 30-калибровочного луженой медной шины провода предварительно припаяны к головке винта) в отверстия и вести их через прорези руки отвертку примерно на 4-5 оборотов для получения желаемой глубины. Держите руководство канюли на месте с помощью стереотаксической держателя канюли, а затем прикрепите их к черепу и якоря с акриловым цементом. Каждый канюли должны содержать фиктивные канюлю / Стилет (пластмассы One, часть # C312 DC \ 1) с момента операции до момента эксперимента (10-14 дней) для поддержания проходимости.

6. Хирургическое закрытие сайта

После ЭЭГ и руководство канюли расположены в черепе, объединить их с зубным цементом акриловые (Lang Dental - Орто-Jet цемента). После цемент наборы, установите пластиковый разъем (Pinnacle Технология части № 8402) над сушеные курган цемента. Припой концы проводов, исходящих из ЭЭГ приводит к контактам на пластиковый разъем. Encase провода приводит в цементе. Затем нарисуйте EMG провода через затылочных мышцы, сдвинув их в ствол 21ga иглой пронзил мышцы. Завяжите узлом двойной хирург из нейлона 5-0 шва вокруг этих проводах только дистально, где они выходят мышц. Шовный вместе кожу, которая была втянута доступ к мышечной ткани с одной прервал узлов хирург, используя обратную резки P-3 иглы и 5-0 нейлоновые нити.

7. Послеоперационное обезболивание и восстановление

Администрирование бупренорфина в качестве обезболивающего средства (0,1 мг / кг, подкожно) и Flunixin меглумина (0,1 мг / кг, подкожно) в качестве противовоспалительного сразу после операции, и ежедневно на 1-2 дней после операции. Разрешить животных, чтобы восстановить в стандартном жилищные условия колонии, по крайней мере за семь дней до эксперимента. При отсутствии дополнительного ухода за стандартный корпус колонии, канюли может быть как ожидается, останется патент, по крайней мере, двух недель с внутренним стилеты закреплены на месте. ЭЭГ и ЭМГ датчики можно ожидать сохраненияфункциональностью для этого срок.

2. Генерация Timed световых импульсов

1. Программирование блока Стимул MC

Подключите MC-Стимул блок (Multi-Channel Systems) через соединение USB к настольному компьютеру. Использование электронной таблицы как MC-Стимул пользовательский интерфейс для программирования MC блок стимул. Введите желаемое TTL (транзисторно-транзисторной логики) напряжения для на период, длительность стимула и выключать периодов, число циклов в секунду лучшего, а общее число повторяющихся циклов в течение всей сессии стимул. Для получения дополнительной информации см. MC-Стимул технического руководства:

3. Производство / Сборка волоконно-оптических PrOBEs для легкой доставки к коре головного мозга

  1. Расходные материалы и оборудование, необходимые находятся по адресу: http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
  2. Огранки и полировки волоконно-оптических кабелей. http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf

4. Собрание грызунов системы стимулирования Optogenetic

1. Интерфейс MC-Стимул группы и лазерная

После MC-Стимул устройство запрограммировано, запустить его в качестве автономного генератора сигналов 5-ти вольт двоичной ON / OFF сигнала. Подключите MC-Стимул устройства к TTL включен блок лазера с BNC разъемами.

2. Производство лазерных Выход через волоконно-оптический кабель

С помощью цифрового дисплея и переменной набора мощности силового агрегата на ручной лазерныйют регулировать выходную мощность лазера. Подключите устройство мощность лазера для лазерной помощью ленточного кабеля. Подключите женщины FC (наконечник разъема) волоконно-оптического адаптера лазера на разъем FC на волоконно-оптический патч-кабель (3 м длиной, диаметром 200 мкм стекла проводимости волокна, заключенного в свет, отраженный акрилатный полимер оболочки).

3. Транспортировка лазера на животных: Роторный Коммутатор

Подключите происходящих волоконно-оптический кабель (3 м в длину) и доставки волоконно-оптический кабель (45 см длиной), чтобы противоположных концах зрительного поворотные совместной упаковывая две коллиматорные линзы (линзы дорического). Волоконно-оптических поворотные совместной служит в качестве коммутатора: как животное движется вокруг своей клетке, поворотные совместной вращается, чтобы предотвратить поломку волоконно-оптического кабеля. Использование пластиковых стяжек для прикрепления коммутатор на металлической подставке расположены над цилиндрической клетке, в которой находится животное.

4. Присоединение доставки волоконно-оптическихКабельные Главы

Сдерживать мыши с помощью одной руки, чтобы прикрепить мышь под сложенные ладони. Orient голову между средним экспериментатора и указательным пальцем. Удалить манекен канюлю из канюли размещены на волоконно-оптические канюли. Очистите направляющие канюли космического мусора с помощью стерильной иглой 25ga. Вставьте волоконно-оптического кабеля от руки и прикрепите ее к волоконно-оптической канюли руководство с резьбовой крышкой винта спасти от манекена канюли. Контролировать глубину введения волоконно-оптического кабеля в мозге шва узел, завязанный на волоконно-оптический кабель на фиксированном расстоянии от плоского расщепленного конца. Весь экспериментальной установки показана на рисунке 1b.

5. Измерение ЭЭГ определенных сна и концентрации лактата во время стимуляции Optogenetic

1. Precalibration из лактата датчика

Предварительная калибровка датчика лактата осуществляется с в пробиркеКомплект (Pinnacle Технология части № 7000-K1-T). Датчик уравновешенную фосфатным буферным раствором (рН 7,4), а затем подвергается трех концентраций L-лактата в скачком на производителя протоколов.

2. Размещение лактата датчиков и ЭЭГ кабельные

Вставьте предварительно откалибровать датчик в череп монтажа лактата канюли руководство таким образом, идентична волоконно-оптического кабеля процедуру введения (раздел 4.4). Подключите лактата датчик предусилитель Pinnacle 8400 биосенсора с биполярным разъемы. Прикрепите этот предусилитель к 8-контактному разъему на хирургически имплантированных headmount.

3. Создание Optogenetic интенсивности стимула

До начала сбора данных, использование контроля интенсивности лазерного излучения регулятором интенсивности раздражителя optogenetic. Амплитуды ЭЭГ ответ будет варьироваться в зависимости от животных, в связи с факторами, которые не изучались систематически, D должна быть проверена при визуальном осмотре в начале стимуляции. На практике, интенсивность 80-120 μWatts, как правило, приводят к увеличению амплитуды ЭЭГ примерно на 50% на частоте стимуляции. После специальной быстрого преобразования Фурье анализ (см. раздел 5.5) является необходимым для количественного определения абсолютной величины ответа.

4. Сбор данных

Сбор данных с помощью Pinnacle 8400 Система: http://pinnaclet.com/pal-8400.html .

5. Обработка данных с Neuroscore

Оцените состояние сна путем визуального осмотра ЭЭГ и ЭМГ данных с Neuroscore интерфейс (DataSciences, International: http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp ) или Sirenia интерфейс (Pinnacle технологии:F = "http://www.pinnaclet.com/sirenia.html" целевых = "_blank"> http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). Обработка данных в десять секунд эпох, как следа, без быстрого движения глаз сон, или быстрого сна движения глаз на основе ЭЭГ и ЭМГ. Сохранить данные в таблицы Microsoft Excel для дополнительного анализа и статистических испытаний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как показано на рисунке 2, мышь оборудована для optogenetic стимуляции и лактат / ЭЭГ / ЭМГ сбора данных прошли спонтанные сон / бодрствование переходов государства, а ЭЭГ, ЭМГ и церебральной концентрации лактата контролируется постоянно. Ток при лактата датчик увеличился в периоды низкой амплитуды ЭЭГ и снижение в периоды высокой амплитуды ЭЭГ. Как показано на рисунке 3, оба канала ЭЭГ, которые реагируют на раздражители optogenetic доставлен в лобной коре.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы, представленные здесь, позволяют измерять отношения между сном и изменения в головном мозге концентрация лактата гликолитических промежуточные на шкале времени не было возможно ранее. Животные проходят спонтанные переходы между следа, NREMS и REMS. Кроме того, мы в состоянии применить optogenetic раздражителей в то время как животные проходят эти переходы. Данные, собранные на сегодняшний день показывают, что как спонтанных, так и индуцированных волн влияние на считывание лактат оксидаза на основе биосенсоров.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования, финансируемого Министерством обороны (Defense Advanced Research Projects Agency, премия для молодых факультет, номер гранта N66001-09-1-2117) и NINDS (R15NS070734).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Компонент Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
Basi мышь канюли Pinnacle технологии / Basi Inc 7032
Лактат биосенсоров Pinnacle технологии 7004
Руководитель горе Pinnacle технологии 8402
Режим сна / биосенсоров системы записи Pinnacle технологии 8400-K1-SL 2 каналов ЭЭГ, 1 канал EMG, 1 и биосенсоров
Привязной мыши в лабораторных Набор для калибровки Pinnacle технологии 7000-K1-T
Волоконно-оптические канюли Один пластмассы C312G 21 калибровочных канюли
Dummy Канюля Один пластмассы C312DC 21 калибровочных Dummy
Алмазный волоконно Scribe Thorlabs S90W
Оптический разъем обжимной инструмент Thorlabs CT042
Развилки трубы Thorlabs FT030 03,0 мм
Thorlabs T10S13 Max Dia. 0,012
Stripper развилки труб Thorlabs FTS3
Голые жесткий Покрытие многомодовых волокон Thorlabs BFL37-200 200 мкм Core, 0,37 NA
Провод Snips / Kevlar Ножницы Thorlabs T865
Волоконно-оптические эпоксидные Thorlabs F112
Инструмент волоконно Stripper Thorlabs
Полировки стекла плиты Thorlabs CTG913
Резиновые полировальные Pad Thorlabs NRS913
Глаз Лупа Thorlabs JEL10
Kim Wipes Thorlabs KW32
Сжатый воздух Thorlabs CA3
Полирование Puck Thorlabs D50-хх
Волоконно сферу инспекции Thorlabs CL-200
Полировка фильмов Thorlabs LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P
FC / PC разъем конца Thorlabs 30126G2-240 240 мкм Диаметр цилиндра, SS Ferrule
MC Стимул единицы Многоканальных систем STG-4002
MC Стимул программного обеспечения Многоканальных систем MC-Стимул V 2.1.5
Голубой лазер CrystaLaser CL473-050-0
Лазерный питания CrystaLaser CL2005
Волоконно-оптический поворотный Совместная Дорический линзы FRJ-v4
Таблица 2. Материалов и оборудования.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Magistretti, P. Brain Energy Metabolism. Fundamental Neuroscience. Zigmond, M. J., Bloom, F. E., Landis, S. C., Roberts, J. L., Squire, L. R. , Academic Press. New York. 389-413 (1999).
  2. Maquet, P., et al. Cerebral glucose utilization during sleep-wake cycle in man determined by positron emission tomography and [18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose method. Brain Res. 513 (1), 136-143 (1990).
  3. Buchsbaum, M. S., et al. Regional cerebral glucose metabolic rate in human sleep assessed by positron emission tomography. Life Sci. 45 (15), 1349-1356 (1989).
  4. Kennedy, C. Local cerebral glucose utilization in non-rapid eye movement sleep. Nature. 297 (5864), 325-327 (1982).
  5. Pappenheimer, J. R., Koski, G., Fencl, V., Karnovsky, M. L., Krueger, J. Extraction of sleep-promoting factor S from cerebrospinal fluid and from brains of sleep-deprived animals. J. Neurophysiol. 38 (6), 1299-1311 (1975).
  6. Borbely, A. A., Achermann, P. Sleep homeostasis and models of sleep regulation. Principles and Practice of Sleep Medicine. Kryger, M. H., Roth, T., Dement, W. C. , 3rd, W.B. Saunders. Philadelphia. 377-390 (2004).
  7. Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Spatiotemporal analysis of local field potentials and unit discharges in cat cerebral cortex during natural wake and sleep states. J. Neurosci. 19 (11), 4595-4608 (1999).
  8. Astrup, J., Sorensen, P. M., Sorensen, H. R. Oxygen and glucose consumption related to Na+-K+ transport in canine brain. Stroke. 12 (6), 726-730 (1981).
  9. Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  10. Mateo, C. In Vivo Optogenetic Stimulation of Neocortical Excitatory Neurons Drives Brain-State-Dependent. Curr. Biol. , (2011).
  11. Wisor, J. P., Clegern, W. C. Quantification of short-term slow wave sleep homeostasis and its disruption by minocycline in the laboratory mouse. Neurosci. Lett. 490 (3), 165-169 (2011).
  12. El Yacoubi, M., et al. Behavioral, neurochemical, and electrophysiological characterization of a genetic mouse model of depression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6227-6232 (2003).
  13. Tsunematsu, T., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J. Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
  14. Le, S., Gruner, J. A., Mathiasen, J. R., Marino, M. J., Schaffhauser, H. Correlation between ex vivo receptor occupancy and wake-promoting activity of selective H3 receptor antagonists. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325 (3), 902-909 (2008).
  15. Burmeister, J. J., Palmer, M., Gerhardt, G. A. L-lactate measures in brain tissue with ceramic-based multisite microelectrodes. Biosens. Bioelectron. 20 (9), 1772-1779 (2005).
  16. Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat. Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
  17. Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Cortically-induced coherence of a thalamic-generated oscillation. Neuroscience. 92 (2), 427-443 (1999).
  18. Liu, Z. W., Faraguna, U., Cirelli, C., Tononi, G., Gao, X. B. Direct evidence for wake-related increases and sleep-related decreases in synaptic strength in rodent cortex. J. Neurosci. 30 (25), 8671-8675 (2010).
  19. Iwai, Y., Honda, S., Ozeki, H., Hashimoto, M., Hirase, H. A simple head-mountable LED device for chronic stimulation of optogenetic molecules in freely moving mice. Neurosci. Res. 70 (1), 124-127 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи