Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Логика, экспериментальные шаги, и потенциал Гетерологичная природного биосинтеза продукта Благодаря комплекса антибиотик эритромицин производится через

18.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4346

⸱

13 января 2013 г.

 ,  , 
1Chemical and Biological Engineering Department, State University of New York at Buffalo, 2Chemical Engineering Department, Massachusetts Institute of Technology

В этой статье

Краткое содержание

Гетерологичных биосинтеза эритромицина через E. палочки Включает в себя следующие экспериментальные шаги: 1) генетическая передача, 2) гетерологичный восстановления и 3) анализ продукта. Каждый шаг будет объяснено в контексте мотивация, потенциал и проблемы в производстве терапевтических природных продуктов с использованием E. палочки В качестве суррогатного хозяина.

Аннотация

Гетерологичный синтез сложных природных соединений — это подход, разработанный для преодоления текущих ограничений и реализации будущих возможностей. Он особенно полезен для тех соединений, которые обладают терапевтической ценностью, но не могут быть получены в достаточном количестве или нуждаются в усовершенствовании методов производства. Экспериментальные процедуры можно разделить на три компонента: 1) генетический перенос; 2) гетерологичная реконструкция; и 3) анализ продуктов. Каждый экспериментальный компонент подвергается постоянной оптимизации для решения возникающих проблем и использования возможностей, связанных с этим развивающимся подходом.

Гетерологический биосинтез начинается с идентификации генетической последовательности, отвечающей за синтез ценного природного соединения. Перенос этой последовательности в гетерологический организм осложняется сложностью биосинтетического пути, обеспечивающего образование продукта. Хорошим примером является антибиотик эритромицин А. Для его окончательного биосинтеза требуется двадцать генов (суммарно >50 kb). Кроме того, три из этих генов кодируют мегасинтазы — многодоменные ферменты, размер каждого из которых составляет ~300 kDa. Этот генетический материал должен быть сконструирован и перенесен в E. coli для реконструированного биосинтеза. В процессе переноса генетического кластера эритромицина А в E. coli будут описаны такие методы, как изоляция с помощью ПЦР, конструирование оперонов, использование мультицистронных плазмид и электротрансформация.

После переноса клетка E. coli должна обеспечить последующий биосинтез. Этот процесс также затруднен значительными различиями между E. coli и большинством исходных организмов-хозяев, ответственных за образование сложных природных соединений. Клетка должна предоставлять необходимые субстраты для поддержания биосинтеза и координированно экспрессировать перенесенный генетический кластер для выработки активных ферментов. В случае с эритромицином A клетка E. coli была генетически модифицирована для обеспечения двух предшественников (пропионил-CoA и (2S)-метилмалонил-CoA), необходимых для биосинтеза. Кроме того, для окончательного образования эритромицина A потребовались модификации последовательности генов, оптимизация числа копий плазмиды, коэкспрессия шаперонинов, посттрансляционная ферментативная модификация и регулировка температуры процесса.

Наконец, необходимо оценить эффективность продукции. Для случая с эритромицином А мы представим два метода. Первый — жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS) для подтверждения и количественного определения продукции. Биоактивность эритромицина А также будет подтверждена с помощью биоанализа, в ходе которого тестируется антибиотическая активность в отношении Bacillus subtilis. Аналитические тесты подтверждают биосинтез эритромицина А из E. coli и создают основу для дальнейших инженерных усилий по улучшению или диверсификации продукции, а также для получения новых сложных природных соединений с использованием данного подхода.

Введение

Эритромицин является поликетидного антибиотик, продуцируемый грам-положительные бактерии почвы Saccharopolyspora erythraea, а текущее производство было постепенно улучшилось до ~ 10 г / л в течение десятилетий традиционного мутагенеза и отбора протоколы и позже через процесс оптимизации схемы 1-6. Мутагенеза и отбора стратегий часто встречаются в природных антибиотиков развития продукта в результате трудностей в культивировании и / или генетической обработки родной хозяева производства и в связи с доступными антибиотиками активности или улучшение фенотипа роста, чтобы помочь выбора. В случае эритромицин, С. erythraea ограничен медленным ростом профиля и отсутствием более прямые методы генетической манипуляции (по отношению к организмам, таких как кишечная палочка), тем самым, препятствуя быстрому улучшению производства и биосинтез новых производных. Признав производственных вопросов и открыл diversificatiпо возможности с соединения, такие как эритромицин, научного сообщества стали преследовать мысль о гетерологичных биосинтеза (рис. 1) 7. Эти усилия совпали с имеющейся информацией последовательность для эритромицин кластера генов 8-11. Следует подчеркнуть, что число последовательности сложных природных скоплений продукта гена значительно расширил 12-16, обеспечивая стимул для дальнейших усилий в гетерологичных биосинтеза доступ к закодированной лекарственных потенциал. Чтобы сделать это, гетерологичный восстановление требует, чтобы новый хозяин удовлетворения потребностей конкретного пути биосинтеза. E. палочки предоставляет техническую удобства, широко охватывающей множество методов молекулярной биологии и метаболических процессов и инженерного стратегии разработки продукта. Тем не менее, по сравнению с родным хозяевами производства, E. палочка не проявляют такой же уровень сложные природные производства продукта. Поэтому неизвестно, будет ли E. палочка может служить жизнеспособным вариантом для гетерологичных сложных природных биосинтеза продукта. Тем не менее, предполагается, что E. палочка была бы идеальной организма-хозяина, если гетерологичных биосинтеза может быть достигнуто.

С этой целью в виду, первоначальные усилия начали производить поликетидного агликона 6-deoxyerythronolide B (6dEB) через Е. палочки. Тем не менее, родные E. метаболизма кишечной не может обеспечить заметное уровня ацетил-КоА и (2S)-methylmalonyl-КоА прекурсоров, необходимых для поддержки 6dEB биосинтеза не могла нового хозяина посттрансляционно изменить deoxyerythronolide синтазы B (DEBS) ферментов. Для решения этих вопросов, метаболический путь состоит из родных и гетерологичные ферменты был построен в E. палочка такая, что экзогенно пропионат кормят был преобразован внутриклеточно в ацетил-КоА, а затем (2S)-methylmalonyl-КоА, во время инженерной чтобы завершить этот путь, ген SFP был помещен в гоэлектронной хромосомы E. палочки BL21 (DE3) для получения нового штамма называют BAP1. Фермент Sfp является phosphopantetheinyl трансферазы способны крепления 4'-phosphopantetheine кофактора в DEBS ферментов 17,18. Три DEBS генов (каждый ~ 10 кб) были затем помещены на двух отдельно выбирается выражение векторов, содержащих индуцибельной T7 промоутеров. После ключевые настройки после индукции температуры (до 22 ° C), DEBS гены были согласованно, высказанные в рамках BAP1 в активном состоянии способны генерировать 6dEB 19.

Стремление к полной эритромицин биосинтеза затем начали использовать аналогичный кластер генов от Micromonospora megalomicea или гибридный путь состоит из генов S. erythraea, С. fradiae и С. venezuelae которые производятся промежуточные эритромицин C и 6-deoxyerythromycin D, соответственно, 20-22. Недавно наша группа расширила эти усилия, производя erythromycin (наиболее клинически значимых форм эритромицина) через Е. палочки. В отличие от предыдущих работ, наша стратегия согласованно выразили 20 оригинальных С. erythraea генов, необходимых для биосинтеза поликетидного, deoxysugar биосинтеза и привязанности, дополнительный пошив одежды, и самостоятельно сопротивления (рис. 2). В общей сложности, 26 (отечественные и гетерологичных) гены были разработаны, чтобы позволить E. палочки для получения эритромицин в дозе 4 мг / л, 23,24. Этот результат установила полное производство комплекса поликетидного природный продукт с использованием E. палочки и служит основой для привлечения этой новой опции производства или заниматься новыми.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Приведенный ниже текст является специфическим для эритромицин антибиотик, но шаги призваны быть вообще применимо к другим натуральным продуктам в качестве кандидатов на гетерологичные биосинтеза.

1. Эритромицин генетического переноса кластеров

  1. Дизайн ПЦР-праймеров для амплификации все гены, связанные с эритромицин кластера в S. erythraea хромосомы. Этот шаг является специфичным для тех, естественными кандидатами продукт, генетические последовательности были определены. Кроме того, необходимые гены могут быть синтезированы (через несколько коммерческих вариантов поставщика) с тем преимуществом, что вновь синтезированных генов будет предназначен для оптимального использования кодона в рамках нового E. палочки хозяина. Если синтеза ДНК преследовали, текущая задача состоит в создании megasynthase генов, которые могут превышать 10 кб в длину. Технически, синтез может быть достигнуто, но это сложная и дорогостоящая. Предполагается, что постоянное improvemродители в генной технологии синтеза будут рассмотрены текущие недостатки и дальнейшего подтверждения этого подхода для обеспечения гетерологичный генетический материал.
  2. Выполните ПЦР с использованием свежеприготовленных С. erythraea геномной ДНК в качестве матрицы. Хромосомной ДНК могут быть получены из культур S. erythraea или из замороженных запасов бактерии (рис. 3) 25. ПЦР-реакции могут извлечь выгоду из того ДМСО (4 мкл в 50 мкл реакции) с учетом высокого содержания G+ C в целевом С. erythraea генов. Каждый усиливается ген должен быть упорядочен, чтобы подтвердить, что полный геном был получен и что никаких мутаций были введены в процессе ПЦР.
  3. Через дайджест ограничения и перевязки, вставьте каждой из изолированных генов в векторы экспрессии предназначен для E. палочки (рис. 3). Это инициирует разработку сайтов рестрикции в ПЦР-праймеров, чтобы пищеварение и лигированием в подходящих бывшихВыражение векторов (например, были включены в рис. 3). Мы использовали оба pET21 и pET28 векторов. PET28 вектор позволяет включить лидера последовательности в 5 ', которая помогает экспрессии генов в эритромицин случае. Подтверждение индивидуального выражения гена через RT-PCR, SDS-PAGE анализа (с использованием растворимых белковых фракций), или удобные фенотипического анализа (рис. 4).
  4. Построить оперонов основе генов успешно выразил от отдельных плазмид выражении (рис. 3). Мы традиционно использовали комбинации совместимых ползучего ферментов рестрикции (таких, как Xba I и Spe I) 24 для последовательного преобразования генов оперона, однако, ограничение сайтов выбрали для строительства оперона не должна находиться в пределах (или должны быть удалены из списка) изолированная генных последовательностей (вопрос, который можно избежать, если ген синтеза используется). Этот шаг консолидирует 20-эритромицин генов до Е. Трансформатор палочкиrmation. В настоящее время, мы использовали этот метод, чтобы включать в себя до 20 кб чужеродной ДНК в стандартном вектор ПЭТ (два гена ~ 10 кб каждая). Кроме того, мы использовали этот подход для создания оперонов из девяти генов. Пока неизвестно, сколько именно ДНК, или как многие гены могут быть интегрированы в ПЭТ-типа плазмид, однако, показатели приведенные выше служить основой для сложных систем, как биосинтеза эритромицина. Наконец, стандарт в пробирке перевязки шаги и последующие успешные шаги преобразования становится все более трудным, как и оперона плазмиды увеличивается размер. Лигирование температуре (12-22 ° C) и времени (3-24 ч) разнообразны и электро-преобразования используется для облегчения процесса получения окончательного плазмиды конструкций.
  5. Преобразование новый дизайн плазмид биосинтетических в E. Штамм BAP1 использованием электро-преобразования (рис. 5). Эта процедура может быть предпринята с плазмидами введены либо последовательно, либо в сотрудничествеmbination. При преобразовании размера состоянии или многочисленные плазмиды, мы традиционно использовали электро-преобразования (в отличие от химических превращений). Как только трансформируются, пластины клеток на твердой среде LB, содержащей тетрациклин (5 мг / л), карбенициллин (100 мг / л), канамицин (50 мг / л), стрептомицин (50 мг / л), а апрамицин (50 мг / л ), чтобы выбрать для плазмиды обслуживания. Это очень необычно использовать шесть различных выбор антибиотиков после преобразования E. кишечной клетки, но это просто отражает общее число плазмид необходимо, чтобы позволить окончательное эритромицин биосинтеза. Хотя возможно, такой подход ограничивает производственные возможности соединения однажды культивирование начался (см. ниже).

2. E. Восстановление кишечной Биосинтетические

  1. Штамм BAP1 была разработана, чтобы обеспечить требуемую субстратов для биосинтеза и посттрансляционно изменить deoxyerythronolide megasynthase B. Индивидуальные генов erythromycin пути были проверены на экспрессию генов и закреплены в качестве оперонов в выражение плазмид. Данный раздел посвящен культуре условия для проверки согласованной деятельности полном эритромицин пути.
  2. Возьмите 3 отдельных колоний недавно преобразована BAP1 и привить 1,5 мл LB культур, содержащих необходимые плазмиды антибиотиками выбора (при тех же концентрациях указано выше, чтобы выбрать для трансформанты на твердой среде), изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG; 100 мкМ ) и арабинозы (2 мг / мл), чтобы вызвать экспрессию генов, и 20 мМ натрия пропионат для поддержки внутриклеточное образование предшественники биосинтеза. Как только производство было подтверждено, больше культуры могут быть проведены в попытке масштабировать и максимально продукта титры.
  3. Культуры клеток при 22 ° C и 250 оборотов в минуту в течение 24-48 часов. В этом случае, выбор антибиотика гарантирует, что необходимые плазмиды сохраняются на ранних этапах клеточной культуре. Тем не менее, плазмидыа может быть легко потерян как выбор антибиотика уровней изменится в течение периода культивирования. Это может привести к нестабильности плазмиды (например, потеря одного или более плазмид в культуре), который затем ограничивает производственные возможности. Проблема усугубляется, когда несовместимых плазмид использоваться для введения полного гетерологичных кластера генов. Так обстоит дело для эритромицин соединения (рис. 5) и должны быть устранены, чтобы действительно перепроизводство соединения из E. палочки. Однако, для целей демонстрации начальных производства, такие недостатки дизайна допускаются для оперативного установления возможности гетерологичных подход.
  4. Уточнить культуры путем центрифугирования при 10000 оборотов в минуту в Eppendorf отцентрифугировать. Удалить супернатант и хранить при температуре 4 ° С для анализа.
  5. В случае эритромицин, отсутствие соединения производство было направлено за счет включения в GroES / EL шаперонина (с использованием pGro7специально для решения отсутствие активности ферментов после выражения) и включение дополнительных копий генов (для тех генов, подозреваемых в слабой экспрессии / активности). Аналогичные стратегии могут быть необходимы с другими гетерологичных природных усилия производство продукта.

3. Анализ продукции

  1. Для подтверждения и количественной эритромицин образования, придать супернатанта культуры на LC-MS системы (рис. 6). Коммерчески доступные эритромицин был использован для подтверждения производстве и в качестве стандарта при количественной оценке. В тех случаях, без коммерчески доступные стандарты, LC-MS анализа потребуется дополнительная характеристика химического методами ЯМР и масс-спектрометрии высокого разрешения.
  2. Сравнить производства между 3 колоний / культур от BAP1 преобразования. Выберите самый высокий продюсер и подготовить глицерине из колонии источник. Этот шаг может быть сделано параллельно с производством культур раздел протокола2, используя небольшую часть культуры подготовить глицерина акций. Хранить глицерина складе в морозильной камере -80 ° C.
  3. Использование подтвердил, высокое производство складе клетке, начинают отдельной культурой производства и извлечения окончательного супернатанта с 2-кратным объемом этилацетата. С помощью вакуумной системы испарительного для сушки экстракта и ресуспендируют в 100 мкл метанола. Передача экстракт стерильный фильтр дисков (~ 1/4 дюйма в диаметре) и позволяют диску высохнуть. Отдельно культуры B. subtillis в LB жидкость на ночь. Добавить 20 мкл B. Сенная культуры до 20 мл жидкого агара LB при 45 ° C. Плита агар и позволит укрепить. Поместите фильтр диск на тарелку и инкубировать при 37 ° C (рис. 7). Кроме того, экстракт можно добавлять в жидкую культур в 96-луночный планшет для количественной оценки активности с использованием ридер (рис. 7).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Желаемых результатов такого подхода является производство полностью биологически активный натуральный продукт из E. палочки гетерологичный хозяин. Это лучше всего представлена ​​LC-MS результаты используются для подтверждения и количественного производства (рис. 6) и антибактериальные биопроб для подтверждения окончательного активности (рис. 7). В общей схеме гетерологичных биосинтеза, этот результат определяет успех. Как только достигнута, научно-исследовательской деятельности...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критические шаги в гетерологичных биосинтеза встречаются на каждом из трех процедурные моменты в процессе: 1) генетическая передача, 2) биосинтетических восстановления и 3) анализ продукта. Проблемы на любом этапе будет сорвать конечная цель создания гетерологичной биосинтеза. Пожалуй, наиболее сложным аспектом этого процесса является создание восстановленного биосинтеза, так как это абсолютно необходимо, чтобы успешный анализ. Тем не менее, восстановление зависит от тщательной разработки и передачи генетического матери...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы благодарят NIH (AI074224 и GM085323) и NSF (0712019 и 0924699) для финансирования для поддержки проектов, направленных на гетерологичные биосинтеза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
ПЦР машины Eppendorf Mastercycler личного
Диметилсульфоксид (ДМСО) Рыбак BP231
Электропоратора BioRad Micropulser
IPTG Рыбак BP1620
Пропионат натрия Сигма P1880
L-арабинозы Сигма A3256
Холодильные Shaker Thermo Scientific MaxQ 4000
Микроцентрифуге Миppendorf Центрифуга 5415D
pGro7 Takara Сопровождающий плазмиды Set (3340)
pET21, pET28, ПХДФ-Дуэт-1 EMD химических веществ 69742-3, 69864, 71340
LC-MS Applied Biosystems 3200 Q-Trap
Этилацетат Сигма 270989
Метанол Сигма 322415
Вакуумные центрифуги Eppendorf Концентратор 5301
Роторный испаритель Buchi R-200

Ссылки

  1. Adrio, J. L., Demain, A. L. Genetic improvement of processes yielding microbial products. FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).
  2. Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb). Microbiology. 144 (Pt. 9), 2441-2448 (1998).
  3. Chen, Y., et al. Genetic modulation of the overexpression of tailoring genes eryK and eryG leading to the improvement of erythromycin A purity and production in Saccharopolyspora erythraea fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1820-1828 (2008).
  4. McGuire, J. M., Bunch, R. L., Anderson, R. C., Boaz, H. E., Flynn, E. H., Powell, H. M., Smith, J. W. "Ilotycin," a new antibiotic. Antibiot & Chemother. 2, 281-284 (1952).
  5. Minas, W., Brunker, P., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Improved erythromycin production in a genetically engineered industrial strain of Saccharopolyspora erythraea. Biotechnol. Prog. 14, 561-566 (1998).
  6. Zou, X., Hang, H. F., Chu, J., Zhuang, Y. P., Zhang, S. L. Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale. Bioresour. Technol. 100, 1406-1412 (2009).
  7. Zhang, H., Boghigian, B. A., Armando, J., Pfeifer, B. A. Methods and options for the heterologous production of complex natural products. Nat. Prod. Rep. 28, 125-151 (2011).
  8. Cortes, J., Haydock, S. F., Roberts, G. A., Bevitt, D. J., Leadlay, P. F. An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea. Nature. 348, 176-178 (1990).
  9. Donadio, S., Staver, M. J., McAlpine, J. B., Swanson, S. J., Katz, L. Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis. Science. 252, 675-679 (1991).
  10. Salah-Bey, K., et al. Targeted gene inactivation for the elucidation of deoxysugar biosynthesis in the erythromycin producer Saccharopolyspora erythraea. Mol. Gen. Genet. 257, 542-553 (1998).
  11. Summers, R. G., et al. Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production. Microbiology. 143, 3251-3262 (1997).
  12. Corre, C., Challis, G. L. New natural product biosynthetic chemistry discovered by genome mining. Nat. Prod. Rep. 26, 977-986 (2009).
  13. McAlpine, J. B. Advances in the understanding and use of the genomic base of microbial secondary metabolite biosynthesis for the discovery of new natural products. J. Nat. Prod. 72, 566-572 (2009).
  14. Nett, M., Ikeda, H., Moore, B. S. Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes. Nat. Prod. Rep. 26, 1362-1384 (2009).
  15. Oliynyk, M., et al. Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338. Nat. Biotechnol. 25, 447-453 (2007).
  16. Wilkinson, B., Micklefield, J. Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways. Nat. Chem. Biol. 3, 379-386 (2007).
  17. Gokhale, R. S., Tsuji, S. Y., Cane, D. E., Khosla, C. Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases. Science. 284, 482-485 (1999).
  18. Quadri, L. E., et al. Characterization of Sfp, a Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase for peptidyl carrier protein domains in peptide synthetases. Biochemistry. 37, 1585-1595 (1998).
  19. Pfeifer, B. A., Admiraal, S. J., Gramajo, H., Cane, D. E., Khosla, C. Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Science. 291, 1790-1792 (2001).
  20. Lee, H. Y., Khosla, C. Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotics in Escherichia coli. PLoS Biol. 5, e45(2007).
  21. Peiru, S., Menzella, H. G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).
  22. Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products. Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).
  23. Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering. Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).
  24. Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host. Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).
  25. Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. Norwich, UK. (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

E coliLC MS
Логика, экспериментальные шаги, и потенциал Гетерологичная природного биосинтеза продукта Благодаря комплекса антибиотик эритромицин производится через
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.