По всему геному Гена удаления в<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; По высокая пропускная способность ПЦР

Xiuchun Ge; Ping Xu

doi:10.3791/4356

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

По всему геному Гена удаления в

16.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4356

⸱

23 ноября 2012 г.

Xiuchun Ge¹ , Ping Xu¹

¹The Philips Institute of Oral and Craniofacial Molecular Biology, Virginia Commonwealth University

В этой статье

Краткое содержание

Эффективное генома одного метода генной мутации была создана использования Streptococcus sanguinis В качестве модельного организма. Этот метод осуществляется через высокую пропускную способность рекомбинантного ПЦР и преобразований.

Аннотация

Транспозонов мутагенеза и одного гена удаления двух методов, применяемых в генома генов нокаутом в ^1,2 бактерии. Хотя транспозона мутагенеза является менее трудоемким и менее дорогостоящими, и не требует завершить геноме информации, есть два слабых места в этом методе: (1) возможность разных мутантов в смешанном мутант библиотека, которая по борьбе с мутантами выбирает со снижением конкуренции; и (2) возможность частичной инактивации гена которой гены не полностью теряют свои функции после введения транспозона. Одного гена удаления анализа могут компенсировать недостатки, связанные с мутагенеза транспозонов. Для повышения эффективности генома одного делеции гена, мы пытаемся установить высокую пропускную техника для генома одного удаления гена с использованием Streptococcus sanguinis в качестве модельного организма. Каждый ген удаления построить в S. sanguinis генома предназначен для составляющих 1КБ вверх по течению от целевого гена, APHA-3 гена, кодирующего белок канамицину и 1-кб ниже целевого гена. Три комплекта F1/R1 грунтовки, F2/R2, и F3/R3, соответственно, разработан и синтезирован в 96-луночный планшет формата для ПЦР-амплификации из этих трех компонентов каждого удаления построить. Грунтовки R1 и F3 содержат 25-BP последовательности, которые являются дополнением к регионам APHA-3 гена в конце их 5. Крупномасштабных ПЦР-амплификации APHA-3 гена выполняется один раз для создания всех одно-генных конструкций удаления. Промоутер APHA-3 гена изначально исключены чтобы свести к минимуму потенциальные полярный эффект кассетного канамицин. Для создания конструкции гена удаления, высокой пропускной ПЦР-амплификации и очистки осуществляется в 96-луночный планшет формата. Линейные рекомбинантного ампликона ПЦР для каждого гена удаление будет составлен через четыре реакции ПЦР с использованием высококачественных ДНК-полимеразы. Первоначальный EXPONдифференциальной фазы роста S. sanguinis культивировали в Todd Hewitt бульоне с добавлением 2,5% инактивированной лошадиной сыворотки используется для повышения компетенции для преобразования ПЦР-рекомбинантной конструкции. При этом условии до 20% С. sanguinis клетки могут быть трансформированы ~ 50 нг ДНК. Основываясь на этом подходе, 2048 мутанты с одного гена удаления в конечном итоге были получены из 2270 генов S. sanguinis учета ORFs четыре гена, целиком в рамках других ORFs в S. sanguinis SK36 и 218 потенциальных существенных генов. Техника на создание конструкции ген удаления высокой пропускной способностью и может быть легко использовать в генома одного удаления гена для любого трансформируемые бактерий.

Протокол

1. Primer Design

Грунтовки предназначены использования в доме сценарии основаны на S. sanguinis SK36 последовательность генома. Три набора праймеров, F1/R1, F2/R2, и F3/R3 предназначены для усиления 1-кб перед последовательностью гена-мишени, APHA-3 ген, кодирующий устойчивость к канамицину (Km ^г) белка ³ и 1 КБ вниз по течению последовательности гена-мишени, соответственно (рис. 1). Среди этих праймеров, F1 и R3 разработана с использованием ePrimer3 в EMBOSS набор программ ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) для усиления фланкирующие области выше или ниже целевого ген. Гена специфических праймеров, R1 и F3, разработаны основанные на 5 'и 3' последовательности гена-мишени. R1 и F3 праймеры содержат 25-BP адаптер последовательностей в конце их 5 ', которые являются дополнением к APHA-3ген. Температура плавления каждого праймера были разработаны, чтобы быть как можно ближе к 60 ° C, чтобы разрешить использование единой температуры отжига для всех ПЦР-реакции в 96-луночный.
F1, R1, R3 F3 и праймеры синтезированы в 96-луночные планшеты на основе генного порядка. Каждая пластина содержит один вид грунтовки в том же порядке ген. Развести праймеров в 96-и рабочих грунтовки пластины до конечной концентрации 10 мкМ для ПЦР-амплификации помощью многоканальной пипетки.

2. Высокая пропускная способность ПЦР-амплификации и очистки

Для высокой пропускной способностью усиливать 1-кб выше или ниже целевого С. sanguinis генов, собрать смесь ПЦР коктейлей на льду в 15-мл коническую трубку с 1640 мкл DDH ₂ O, 250 мкл 10xHigh Fidelity PCR буфера, 200 мкл 10 мМ смеси дНТФ, 100 мкл 50 мМ MgSO _4, 100 мкл 10 нг / мкл С. sanguinis SK36 геномной ДНК и 10 мкл Taq ДНК Платиновый polymeрасе высокой точностью и передачи 23 мкл смеси в каждую лунку в 96-луночный ПЦР планшет помощью многоканальной пипетки. Передача 1 мкл каждого F1 и R1 (или F3 и R3) от 10 мкМ праймера рабочей пластины к пластине ПЦР с использованием многоканальной пипетки. Печать ПЦР планшет и выполнять усиления при 94 ° С в течение 1 мин, 30 циклов 94 ° C в течение 30 сек, 54 ° C в течение 30 сек и 68 ° C в течение 1,5 мин.
Подготовьте 1% агарозном геле, содержащем бромистый этидий с 48 скважин установки загрузки многоканальной пипетки. Смешайте 4 мкл продукта ПЦР с 1 мкл буфера загрузки 5xDNA на 96-луночный планшет и загрузить образцы на агарозном геле с использованием 10-мкл многоканальной пипетки. Выполнить электрофорез при 135 В в течение 30 мин. Изучите полосы на геле в UVP документации и анализа системы.
Очищают продуктов ПЦР по PureLink 96 ПЦР-комплект очистки с использованием центрифугирования в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Для элюирования ДНК, добавить 40 мкл стерильной DDH ₂ O в яме бinding пластины.
Случайно выбрать несколько очищенных ампликонов на пластине для изучения ДНК концентраций с использованием NanoDrop спектрофотометр. Отрегулируйте концентрацию ампликонов на тарелке ~ 10 нг / мкл.
Плазмиды, содержащей Km ^г кассеты переваривается использованием EcoR я как шаблон ПЦР. Переваривается плазмиды очищают QIAquick набора для очистки ПЦР и линейной плазмидной ДНК доводят до конечной концентрации ДНК 10 нг / мкл. Соберите 25 мкл смеси для Km ^г кассеты ампликона, в том числе 16,4 мкл DDH ₂ O, 2,5 мкл 10xHigh Fidelity PCR буфера, 2 мкл 10 мМ дНТФ смеси, 1 мкл 50 мМ Mg SO _4, 1 мкл 10 мкМ F2, 1 мкл 10 мкМ R2, 1 мкл линейной плазмидной ДНК и 0,1 мкл Taq Платиновый ДНК-полимераза с высокой точностью. Выполните ПЦР-амплификации при 94 ° С в течение 1 мин, 30 циклов 94 ° C в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек и 68 ° С в течение 1 мин. Изучить продукт ПЦР помощью гель-электрофореза в 1% агарозном. Pooла большую часть кассеты Km ^г ампликона из 10 отдельных ПЦР очищали с помощью набора для очистки QIAquick ПЦР. Отрегулируйте ампликона концентрации до 10 нг / мкл.
Для получения окончательного линейного рекомбинантного ампликонов PCR, три ПЦР ампликонов сочетаются друг с 1 мкл (почти в равных молярных количествах) в одной ПЦР планшет также ПЦР шаблона. Другие компоненты ПЦР добавлены в том числе 14,4 мкл DDH ₂ O, 2,5 мкл 10xHigh Fidelity PCR буфера, 2 мкл 10 мМ дНТФ смеси, 1 мкл 50 мМ Mg SO _4, 1 мкл 10 мкМ F1, 1 мкл 10 мкМ R3, 0,1 мкл Taq Платиновый ДНК-полимераза с высокой точностью. ПЦР-амплификации проводят при 94 ° С в течение 2 мин, 30 циклов при 94 ° C в течение 30 сек 55 ° C в течение 30 сек и 68 ° C в течение 3,5 мин, и, наконец, 68 ° C в течение 4 мин.
Изучите ПЦР ампликонов на агарозном геле. Очищают и количественной ПЦР ампликонов как описано выше. Замораживание рекомбинированные ампликонов PCR при -20 ° C.

3. ComПодготовка компетентных клетках

Тодд Хьюитт бульон готов, скорректированная рН до 7,6 с помощью 10 N NaOH, нагревают до кипения, а затем охлаждают до комнатной температуры и стерилизовать с использованием 0,22 мкм полистирола фильтр ^4. Добавить 300 мкл инактивированной сыворотки лошади (конечная концентрация 2,5%) до 11,7 мл бульона Todd Hewitt в 15-мл коническую трубку составить TH + HS среды. Алиготе TH + HS среду в 2 мл и 10 мл в пробирки.
Инокулировать 5 мкл на складе С. sanguinis SK36 замораживали при -80 ° C в 2 мл TH средний + HS и инкубировать в течение ночи с культурой укупорки плотно при 37 ° С, сопровождается предварительной инкубации 10 мл-TH + HS трубку.
После ночи, трансфер 50 мкл культуры в 10 мл TH + HS и инкубировать в трубке при 37 ° C в течение 3 часов (соответствует OD ₆₆₀ из 0,07-0,08), сразу же использовать для преобразования.

4. Трансформации клеток и Антибиотик выбора

Добавить 2 мкл 70 нг С. sanguinis SK36 компетенцийществования стимулирующий пептид (CSP) и 2 мкл линейного рекомбинантного ПЦР ампликона (~ 50 нг), чтобы Эппендорфа на 96-луночный блок и предварительно нагреть их при температуре 37 ° C. Передача 330 мкл 3 час-инкубационных SK36 культуры в каждую пробирку. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. Заменить ДНК стерильной DDH ₂ O в качестве контроля.
Установите блок на льду и распространился 100 мкл каждого преобразования на мозг сердце инфузии (BHI) агар пластины с 500 мкг / мл канамицина. Инкубируйте пластины при температуре 37 ° C в течение 2 сут при микроаэробных условиях.

5. Мутант подтверждения и хранения

Для каждой замены мутант, случайно подхватывать 2 отдельных колоний, привить колонии в 5 мл BHI, содержащий 500 мкг / мл канамицина и инкубировать посевной microaerobically течение ночи при 37 ° C. Криоконсервируют каждой культуре в 30% глицерине при -80 ° C
Чтобы изучить вопрос о мутанта содержащий ген ожидается замена, выполнить ПЦР колоний для каждого мутанта с помощью F1 и R3праймеров в 96-луночный планшет ПЦР. О 1-мкл ночной культуры из отдельных колоний используют в качестве ДНК-матрицы в 25-мкл ПЦР-реакции амплификации. ПЦР проводят при 94 ° C в течение 5 мин, 35 циклов 94 ° C в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек и 68 ° C в течение 3,5 мин, и, наконец, 68 ° C в течение 4 мин.
Чтобы точно определить двойной группой мутантов или загрязнения ампликона ПЦР, ПЦР изучить ампликона с помощью электрофореза в течение 4 часов на> 12 см длиной 2% агарозном геле с окрашиванием этидийбромидом. В соответствии с этим условием электрофореза в агарозном геле, любой ампликонов с разницей ≥ 100 б.п. были четко определены. Когда полосы в результате усиления кассеты ^г Km и дикий тип гена, как ожидается, отличаются <100 б.п., внутреннего праймера T1 используется для определения, является ли ген дикого типа могут быть обнаружены с помощью ПЦР.
Для дальнейшего подтверждения удаления ампликонов очищают PureLink 96 набора для очистки ПЦР и секвенировали с использованием P1 праймер,связывается с кассетой ^г Км. Хранить только правильные мутантов подтвердить путем секвенирования.