Методическая статья

Изоляция первичных меланоцитов-подобных клеток из Сердца Mouse

10.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4357

⸱

29 сентября 2014 г.

 ,  ,  , 
1Penn Cardiovascular Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе, ж е обнаружен новый население меланоцитов-подобных клеток (также известный как сердечные меланоцитов) в сердцах мышей и людей, которые способствуют мерцательная аритмия вызывает у мышей.

Аннотация

Мы определили новый население меланоцитов-подобных клеток (также известный как сердечные меланоцитов) в сердцах мышей и людей, которые способствуют предсердий триггеров аритмии у мышей. Для исследования электрических и биологические свойства сердечных меланоцитов мы разработали процедуру, чтобы изолировать их от мыши сердцах, что мы, полученных от тех, предназначены для защиты новорожденных мышиных кардиомиоцитов. Для того чтобы получить здоровые сердечные меланоциты, пригодные для более широкого зажима патч или биохимических исследований, мы разработали изысканный процедуру выделения и покрытие сердечные меланоциты, основанные на тех, которые изначально предназначены для защиты кожных меланоцитов. Изысканный процедура демонстрируется в данном обзоре и производит большее количество здоровых меланоцитов-подобных клеток, которые могут быть покрыты как чисто населения или с кардиомиоцитов.

Введение

Мы недавно обнаружен новый популяции клеток в сердце мышей и людей, которые выражают меланин-синтеза ферментов и морфологически напоминают кожные меланоциты. Мы назвали "сердечные меланоциты 'Эти клетки и обнаружили, что они присутствуют в анатомических мест, откуда мерцательная аритмия триггеры часто происходят в организме человека. Мы также обнаружили, сердечные меланоциты способствовать предсердий аритмий у мышей с зародышевой линии удаления DCT. Сердечные меланоциты редко распределяется по всему мыши атриум, где они составляют менее 0,1% всех предсердных клеток. Для исследования электрических и биологические свойства сердечных меланоцитов мы разработали процедуру, чтобы изолировать их от сердца мыши, используя Cre-индуцируемый меланоцит специфические маркеры. Наша первоначальная процедура была разработана с тем, которые используются для изоляции новорожденных мышиных кардиомиоцитов и дало очень небольшое количество клеток, пригодных для локальной фиксации записей или ПЦР-анализа. Тем не менее, для улучшения исцелитьй и жизнеспособность сердечной меланоцитов, для более глубокого электрофизиологические анализ или биохимические исследования, мы разработали изысканный процедуру от тех, предназначены для защиты кожных меланоцитов. Процедура, описанная и показано в этом обзоре имеет то преимущество, что производство здоровых сердечных меланоцитов, которые могут быть покрыты в виде чистого населения или кардиомиоцитов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1 Подготовка необходимых решений и оборудования

  1. Во-первых, стерилизации хирургических инструментов (прямые щипцы форма, пинцетов формы, прямые ножницы формы и изогнутые ножницы формы) в автоклаве их в течение 15 мин. при 121 ° С. Подготовьте 2 комплекта инструментов, где один набор используется для рассечения из сердца и другой набор будет использоваться для измельчения составляющих ткань.
  2. Растворите 1 пакетик MCDB153 питательных сред в 900 мл стерилизованной, фильтрованной воды и помешивайте, пока порошок не растворится. Добавить 1,2 г бикарбоната натрия, или 15,7 мл раствора бикарбоната натрия [7,5% вес / объем], на каждый литр конечного объема среды быть подготовленный и перемешивают до полного растворения. Доводят рН до 7,2 путем добавления или 1 N HCl или 1 н NaOH, затем залить СМИ через 0,2 мкм бутылки верхней фильтра в стерильных условиях в капот культуры ткани (биозащитой). Затем соберите СМИ и хранить его при температуре 4 ° С.
  3. Подготовьте дополненийдобавить в культуральной среде (список материалов). Добавки должны быть добавлены в средствах массовой информации как раз перед носитель, необходимых для посева клеток.
  4. Подготовьте DPBS с 10% FBS плюс антибиотиков (пенициллина и стрептомицина).
  5. Далее, подготовить 0,25% раствор трипсина путем добавления 0,25 г трипсина бычьей поджелудочной железы (активность,> 2500 USP единиц / мг, ультрачистой; USB) к 100 мл DPBS плюс антибиотики (пенициллин и стрептомицин).
  6. Другие необходимые для выполнения этой процедуры необходимое оборудование включают стереомикроскопа, чашках Петри (10-см), 50-мл конических труб, фильтры 40-мкм клеток, DPBS плюс антибиотики, 60-мм чашки для культивирования и 35-мм чашек для культивирования.

2 Изоляция сердца от неонатальных мышей Щенки

  1. Во-первых, получить P0 до P2 щенков новорожденных мышей (п = 6 до 8). Рекомендуется использовать щенков, генерируемые разведения DCT-CRE гомозиготных самок с самцами, которые гетерозиготных по либо в R26R: EYFP аллеля или Z / EG аллеля для мечениямеланоцитов-подобные клетки. Оба R26R: EYFP и Z / EG мыши можно получить Джексона Laboratories (поголовья 006148 и 003920, соответственно).
  2. Далее, усыпить неонатальном щенков мыши, протрите их сундуки с спиртовым тампоном, а затем поместить щенков в 10-см чашки Петри с DPBS.
  3. Разрежьте кожу на груди и грудины с стерилизованные щипцы и ножницы, а затем открыть сундук тщательно под стереомикроскопом. Сердца новорожденных щенков мыши очень малы, поэтому будьте осторожны, чтобы убедиться, чтобы удалить все сердце с предсердий прилагается.
  4. Вымойте сердца в DPBS и передавать их на новый 10-см чашку Петри.

3 ферментативного расщепления

  1. Принесите чашку Петри с подакцизным сердца к капот культуры ткани (биозащитой), а затем выполните следующие действия, используя стерильные методы в капюшоне.
  2. Во-первых, мыть сердцах трижды в стерильных DPBS плюс антибиотиков.
  3. Поместите сердца (п = 6-8) в60-мм чашки для культивирования и добавить 6-8 мл 0,5% раствора трипсина на блюдо.
  4. Затем разрезать сердца на мелкие кусочки (менее 1 мм, в размере) и инкубировать их при 37 ° С в течение 30 мин в 5% СО 2 атмосферы.
  5. После инкубационного периода завершена, залить полученный раствор сердечной ткани и трипсина от блюдо в стерильный 50-мл коническую трубку.
  6. Затем, используя 10-мл стерильной пипеткой, быстро, но осторожно, растирают решение в 50-мл коническую трубку 30-50 раз.
  7. Фильтр полученный раствор через сито 40 мкм клетки в верхней части новой, чистой 50-мл коническую трубку для сбора фильтрата.
  8. Далее, центрифуги 50-мл пробирке при 240 х г в настольной центрифуге в течение 5 мин при комнатной температуре. Тогда, мягко аспирации от супернатант и ресуспендируют оставшийся осадок в 6-8 мл стерильного DPBS. Повторите этот шаг еще 2 раза. Этот шаг пеллеты межпредсердной миоцитов и сердечных меланоциты, но не сбить Fiфибробластов Поскольку фибробластов меньше и останется в супернатанте.

4 Покрытие Сердечная меланоцитов-подобные клетки

  1. После третьего полоскания после центрифугирования, тщательно слить или аспирации от промывочного раствора (DPBS) и ресуспендируют осадок в 6 мл культуральной среды MCDB, к которому были добавлены добавки.
  2. Теперь нарисуйте ресуспендированные раствор в стерильной пипетки и поместить клетки в 35-мм блюдо или в лунку 6-луночного планшета, и объединить разрозненные сердечные клетки от 3 новорожденных мышей в одной 35-мм блюдо или хорошо.
  3. Выдержите посуду в течение ночи при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы, аспирация от питательных сред наряду с любыми одиноких клеток, а затем промыть пластины один раз DPBS. Затем добавить свежий СМИ к пластинам и Замените носитель каждые 2 дня. Клетки, выделенные из неонатальной или эмбриональных сердца можно поддерживать в культуре в течение 3 недель, тогда как клетки, выделенные из взрослого слышатьTS может поддерживаться в культуре в течение до 10 дней.

5 Изоляция Сердечная меланоцитов-подобные клетки из взрослых мышей Сердца

  1. Сначала снимите сердца от зрелой мышей (3-4 недели-старые, п = 3) через середины линии стернотомию после введения гепарина 100 Ед интраперитонеальное мышам, а затем эвтаназии их. Рекомендуется использовать фенобарбитал усыпить мышей для этой процедуры, но этот препарат не во всех регионах.
  2. Далее, мыть вырезанные сердца в стерильных DPBS содержащих антибиотики в капот культуры ткани (биозащитой). Сожмите сердца слегка изогнутых диссекционные для удаления остатков крови от них, а затем промыть сердца в DPBS еще раз.
  3. Удалить из предсердий и атриовентрикулярного кольцо из сердец (эти структуры содержат меланоциты как клетки) и поместите вырезанные образцы тканей в 35-мм блюдо.
  4. Вырезать сердца на мелкие кусочки с помощью изогнутых ножниц и силыпс, а затем добавить 6-8 мл 0,5% раствора трипсина к блюду. Затем инкубируют посуду при 37 ° С в течение 45-60 мин.
  5. Теперь, выполните шаги с вышеописанной процедуре, начиная с шага 3,6 года.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол, описанный в этой статье является улучшенной техникой по сравнению с той, которую мы ранее опубликованной выделения сердечные меланоцитов из мышиного сердца. Эта процедура использует использование флуоресцентных маркеров, управляемых синтеза меланина фермента конкретных Cre-рекомбиназы маркировать сердечные меланоцитстимулирующий как клетки. Важно использовать маркер для обозначения сердечные меланоцитов при работе с Свежевыделенные эмбриональных или неонатальных клеток, так как морфологические различия, которы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сердечные меланоциты находятся в анатомических местах в сердце, которые обычно приводят к мерцательной аритмии триггеров. К таким регионам относятся легочные вены, атриовентрикулярным кольцо, заднюю левого предсердия и овальное отверстие (рисунок 4). Чтобы понять роль этих клеток играть в аритмии, мы разрабатываем методы, чтобы выделить их и изучить их физиологию. Тем не менее, мы признали, что повышение эту технику, чтобы получить здоровые и большие количества сердечных меланоцитов позволит дальнейшие ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У нас нет ничего раскрывать.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Национального института награждения Здоровье R01 HL105734 к VVPMDL поддерживается, в частности, Национального института исследований в области здравоохранения Карьера премии K08 HL094748. VVP является инновационный научный сотрудник Американской ассоциации сердца поддержке гранта 11IRG900384.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
MCDB 153Sigma-AldrichM7403Растворить в воде
DPBS, без кальция и магнияInvitrogen14190136Исх. конц.: 1x
Рабочая конц.: 1x
Пенициллин-стрептомицинInvitrogen15140163Исх. конц.: 100x
Рабочая конц.: 1x
Фетальная бычья сывороткаLife TechnologyCertifiedРабочая конц.: 4%
TPASigma-AldrichP1585Растворить в DMSO
Исх. конц.: 3.2 μM
Рабочая конц.: 32 nM
ТрансферринSigma-AldrichT8158Растворить в DPBS
Исх. конц.: 0.1 mg/ml
Рабочая конц.: 1 μg/ml
Дибутирилциклический АМФSigma-AldrichD0627Растворить в DPBS
Исх. конц.: 0.5 mM
Рабочая конц.: 5 μM
ИнсулинSigma-AldrichI6634Растворить в 10 mM уксусной кислоте
Исх. конц.: 1 mg/ml
Рабочая конц.: 5 μg/ml
Основной FGFBD Biosciences354060Растворить в воде
Исх. конц.: 4 ng/μl
Рабочая конц.: 4 ng/ml

Ссылки

  1. Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
  2. Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
  3. Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
  4. Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
  5. Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
  6. Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
  7. Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
  8. Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
  9. Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
  10. Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DPBS40

Похожие статьи