Введем новый способ поддержания человеческого слизистой оболочки кишечника в культуре и мониторинг ответ на различные типы стимулов по меньшей мере, 24 часов. С помощью нашего метода, полярность ткани сохраняется, что позволяет физиологический стимуляции через апикальную маршрута.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Новый метод культуры и поляризованный Стимуляция кишечника человека Экспланты Слизистая
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В настоящее время существует лишь несколько моделей, способных реалистично имитировать сложную микросреду кишечника человека, в которой происходят разнообразные взаимодействия. Надлежащий гомеостаз напрямую зависит от этих взаимодействий, поскольку они формируют весь иммунологический ответ, вызывая толерантность к пищевым антигенам и одновременно обеспечивая эффективный иммунный ответ против патогенных микробов, случайно попадающих в организм с пищей.
Гомеостаз кишечника также поддерживается за счет различных сложных взаимодействий между микробиотой (включая полезные бактериальные штаммы, поступающие с пищей) и организмом хозяина, которые регулируют адгезию и деградацию слизи, выработку антимикробных пептидов эпителиальным барьером, а также «обучение» эпителиальных клеток, контролирующее толерогенный или иммуногенный фенотип специфических популяций резидентных лимфоидных клеток кишечника. До настоящего времени эти взаимодействия было очень трудно воспроизвести с помощью in vitro анализы с использованием либо культур клеточных линий, либо мононуклеарных клеток периферической крови. Кроме того, мышиные модели существенно отличаются от кишечника человека по составу компонентов слизистой оболочки (организация слизистого слоя, сообщество комменсальных бактерий). Таким образом, было затруднительно проводить исследования различных методов лечения, которые планируется внедрить в клиническую практику для терапии важных стресс-индуцированных или патологических состояний, таких как синдром раздраженного кишечника, воспалительные заболевания кишечника или колоректальный рак.
Для решения этих проблем мы разработали новую систему, которая позволяет нам стимулировать эксплантаты слизистой оболочки кишечника человека, сохраняющие свое воздействие in situ со стороны микробиоты хозяина и иммунного ответа, поляризованным образом. Поляризованная апикальная стимуляция имеет огромное значение для исхода вызванного иммунного ответа. Было неоднократно показано, что одни и те же стимулы могут вызывать совершенно разные ответы, если они обходят апикальную поверхность кишечного эпителия, стимулируя эпителиальные клетки базалатерально или вступая в прямой контакт с компонентами собственного слоя слизистой оболочки, что переключает фенотип с толерогенного на иммуногенный и вызывает излишнее и чрезмерное воспаление в данной области.
Поляризованная стимуляция была достигнута путем приклеивания полого цилиндра, который ограничивал область стимуляции на апикальной поверхности слизистой оболочки, как будет описано в протоколе. Мы использовали эту модель, в частности, для изучения дифференциального воздействия трех различных штаммов Lactobacilli. Мы демонстрируем, что данная модельная система является очень эффективным инструментом для оценки иммуномодулирующих свойств пробиотиков в условиях здоровья и патологии.
Протокол
1. Получение и подготовка ткани
- Тканей (здоровые или IBD слизистой оболочки) получают во время операции. Как только образец вырезан передачи в лабораторию как можно скорее, удерживая его в Ca + + / Mg + + HBSS без буфера с добавлением пенициллина / стрептомицина при 4 ° С или на льду.
* Размер образца зависит от наличия ткани: часть ткани, полученной, строго то, что не является необходимым для диагностики и могут значительно отличаться между здоровыми субъектами и IBD. Здоровые ткани вырезают из пациентов, перенесших операцию на рак толстой кишки.
- Вымойте ткань мягко и очистить его от всех брыжеечных материала. Отдельный слой слизистой оболочки с подслизистой использованием стерильных ножниц и щипцов, сохраняя при этом ткани в буфере HBSS в чашке Петри (не обязательно погружен). Нажмите на поверхности слизистой оболочки с пинцетом как можно меньше.
- Вырезать в слизистой оболочке полос по крайней мере, 1 Cм в ширину и как можно дольше. Используйте две стерильные скальпели, так же как если бы вы резки пищи.
- Отмыть слизистой оболочки нежно HBSS и продлить его на чашку Петри с апикальной стороны вверх.
2. Монтаж ткани
- Подготовить свежую среду (tisDMEM). Использование DMEM дополнена глютамин (2 мМ) и NaPyr (1 мМ) и добавляют 15% FBS-Na (фетальной бычьей сывороткой - североамериканский), 1% ЕЕ-X и 200 нг / мл EGF во время использования.
- Наполните 10 см чашки Петри с остальной частью FBS-Na (использовать около 30 мл, так что металлическая сетка будет полностью погружен) и погрузить металлических сеток. Храните пластины открыть и поддерживать в пластиковые цилиндры на кране.
* Металлическая сетка сделаны из железа. Сетки квадратной формы со стороной 0,5 мм.
- Возьмите 3 мкл хирургического клея с 10 или 20 мкл пипетки. Примените это тщательно, чтобы одна из границ пластикового цилиндра, удерживая ее жIRM с щипцами.
- Аккуратно цилиндра на апикальной стороне слизистой оболочки, как можно ближе к одной из границ полосы, насколько возможно.
- Чтобы дать клею время, чтобы прочно прикрепить цилиндр на ткань, подготовить центральный хорошо органной культуры пластина: Внесите 850 мкл-1 мл среды в центре хорошо и поддерживать металлической сеткой по краям центральной яме пластины.
- Срежьте избыточной ткани от границ цилиндра с помощью двух стерильных скальпелей, как раньше.
- Аккуратно поднимите цилиндр с прилагаемой ткани и поместите базолатеральным сторона на металлической сетке в центре пластины.
3. Стимуляция
- Используйте стимулы на ваш выбор в нужный концентрации.
- Применяют соответствующий объем в центре пластикового цилиндра, не нарушая цилиндра или поверхность слизистой оболочки с кончиком пипетки. Убедитесь, что выбранный вами объем равномерно покрывает поверхность внутри цилиндра. Вdicated объемах:
Большой пластиковый цилиндр: 200 мкл
Средний пластиковый цилиндр: 100 мкл
Малый пластиковый цилиндр: 50 мкл - Выдержите в течение до 3 часов в обычном инкубаторе.
* Если вы хотите инкубировать в течение более длительных, убедитесь, что вы используете гораздо меньший объем стимулов (10-20 мкл) и сразу сделать заказ ткани в атмосфере 100% О 2 в давлении 1 атм (см. 3.5) .
- Возьмите среде с стимулов от апикальной поверхности ткани и не заменяют свежей средой, потому что ткань не получает достаточное количество O 2, если толстый слой среды на апикальной лица предотвращает газообмен. Закройте планшет.
- Поместите ткань в атмосфере 100% О 2 в давлении 1 атм.
4. Уборка
- После 24 часов общего времени культуры (± 2,5 часа), осторожно снимите цилиндр из йэлектронной ткани с помощью скальпеля аккуратно очищая от клея и хранить его в зависимости от желаемого анализа (для иммуногистохимии исправить и / или иммунофлуоресцентные анализы, или оснастки замораживание в жидком N2 для очистки РНК и генов профилирования экспрессии или очистки белков и Западной анализов пятно ).
- Урожай базолатеральную среду для профилирования секреции цитокинов. Центрифуга при 8000 оборотов в минуту в течение 7 минут, чтобы мусор гранул, передавать супернатанта в пробирку Эппендорфа (в качестве альтернативы аликвоты) и немедленно хранят при -20 ° C.
* Если вы хотите сохранить супернатантами дольше, храните их при температуре -80 ° C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Нам удалось в поддержании здоровья человека и IBD слизистую оболочку кишечника в культуре в течение по крайней мере 24 часов сохранения благополучия ткани. В соответствии с предыдущими наблюдениями 1, это было возможно только, если большинство времени культивирования (по крайней мере 85% от общего числа) состоялось в O 2, так как ткань не выжить в течение 24 часов в обычных инкубаторов (рис. 2). Мы также показали, что различные реакции эксплантатов можно наблюдать на этой модели в ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Потребность в физиологически значимых моделей, на которых лечение человека слизистой кишечника может быть обоснованно испытания уже давно было подчеркнуто. Многие исследователи определили потенциальные артефактов и дефектов в обеих клеточных 5 и 6 моделей мышей до сих пор использовались для этой цели. В самом деле, хотя перспективные доклинические данные часто получены, они редко перевести на значительные клинические преимущества.
Способ, описанный в данной работе, пред...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы благодарим Эрика Милети за отличную техническую поддержку и д-р Антонио Ди Sabatino для обеспечения кислородом камер.
Финансирование: Эта работа была поддержана грантами от седьмой рамочной программы ЕС (IBDase, ERC: Dendroworld) и Фонд Cariplo к MR и поддержке Марии Кюри международной мобильности обучения сети (перекрестные помехи, соглашение о гранте №: 21553-2), чтобы KT.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагенты | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Пенициллин/стрептомицин | Lonza | DE17602E | |
| Гентамицин | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-глутамин | Lonza | BE17605E | |
| Незаменимые аминокислоты 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Материалы | |||
| Цилиндры для клонирования 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Цилиндры для клонирования 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Цилиндры для клонирования 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Металлические сетки | Собственное изготовление | ||
| Планшет для культивирования органов с центральной лункой | BD Falcon | 353037 | |
| Хирургический клей (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Кислородные камеры | Собственное изготовление | ||
| Кислородные баллоны | Air Liquid Sanità |
Ссылки
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056(2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356(2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
