Методическая статья

Определение летучих Обонятельные с помощью газовой хроматографии-Multi-единицы Recordings (ГКХ) в усиков насекомого Lobe

DOI:

10.3791/4381

⸱

24 февраля 2013 г.

 ,  , 
1Department of Biology, University of Washington

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обонятельные сигналы посредником много различных поведения у насекомых, и часто являются сложной смесью состоящей из десятков до сотен летучих соединений. Использование газовой хроматографии с многоканальной записи в усиков насекомого доли, мы опишем метод для определения биологически активных соединений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все организмы населяют мир, полный сенсорных стимулов, которые определяют их поведенческую и физиологическую реакцию на окружающую среду. Обоняние особенно важно для насекомых, которые используют свои обонятельные системы для реагирования на сложные раздражители запаха и их различения. Эти запахи вызывают поведение, которое опосредует такие процессы, как размножение и выбор среды обитания1-3. Кроме того, химическое восприятие насекомыми опосредует поведение, которое имеет большое значение для сельского хозяйства и здоровья человека, включая опыление4-6, травоядность продовольственных культур7 и передачу болезней8,9. Таким образом, идентификация обонятельных сигналов и их роли в поведении насекомых важна для понимания как экологических процессов, так и пищевых ресурсов и благополучия человека.

На сегодняшний день идентификация летучих веществ, которые управляют поведением насекомых, была сложной и часто утомительной. Современные методы включают запись электроантеннограммы с газовой хроматографией (GC-EAG) и запись одиночных сенсиллумов с помощью газовой хроматографии (GC-SSR)10-12. Эти методы оказались жизненно важными для идентификации биологически активных соединений. Мы разработали метод, который использует газовую хроматографию в сочетании с многоканальной электрофизиологической записью (называемой 'GCMR') от нейронов в антеннальной доле (AL; первичный обонятельный центр насекомого)13,14. Этот современный метод позволяет нам исследовать, как информация о запахе представлена в мозге насекомого. Более того, поскольку нейронные реакции на запахи на этом уровне обработки обоняния очень чувствительны из-за степени конвергенции рецепторных нейронов антенны в нейроны AL, записи AL позволят эффективно и с высокой чувствительностью обнаруживать активные составляющие естественных запахов. Здесь мы опишем GCMR и приведем пример его использования.

Несколько общих шагов участвуют в обнаружении биологически активных летучих веществ и реакции насекомых. Летучие вещества сначала должны быть собраны из источников интереса (в этом примере мы используем цветы из рода Mimulus (Phyrmaceae)) и охарактеризованы по мере необходимости с использованием стандартных методов GC-MS14-16. Насекомых подготавливают к изучению с помощью минимального рассечения, после чего в долю антенны вставляют записывающий электрод и начинают многоканальную нейронную запись. Постобработка нейронных данных затем показывает, какие именно запахи вызывают значительные нейронные реакции нервной системы насекомых.

Хотя пример, который мы представляем здесь, специфичен для исследований опыления, GCMR может быть расширен до широкого спектра изучаемых организмов и летучих источников. Например, этот метод может быть использован для идентификации одорантов, привлекающих или отпугивающих переносчиков насекомых и вредителей сельскохозяйственных культур. Кроме того, GCMR также можно использовать для идентификации аттрактантов для полезных насекомых, таких как опылители. Этот метод может быть распространен и на субъекты, не связанные с насекомыми.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Летучие Follection

  1. В этом примере мы используем летучих образцов M. lewisii цветы - родной альпийских Уайлдфлауэр в Калифорнии. Летучие вещества собираются с использованием динамических методов сорбции в соответствии с Riffell и соавт. 14. Короче говоря, этот метод используется закрытая система захвата цикл, в котором цветы заключены в сумке тефлона. Использование инертного вакуумных насосов, воздух вокруг цветов всасывается через "ловушки", состоящей из пипетки Пастера заполнены Porapak Q матрица. Возвратного воздуха из насоса фильтруется активированным углем. После определенного периода времени, в нашем случае 24 ч, Porapak Q матрица элюируют неполярных растворителей, обычно гексана, чтобы собрать концентрированного экстракта. Затем экстракт хранится в -80 ° С до анализа. При необходимости образцы могут быть сосредоточено до анализа в потоке газообразного азота. Если образец уже хорошо характеризуется, запустить аликвоты черезгазовый хроматограф-масс-спектрометр (ГХ-МС) для определения летучих компонентов перед использованием образца.

2. Электрофизиологические подготовка

  1. Отрежьте примерно 1 см от конца 1.000 мкл кончика пипетки. Поместите шмель (Bombus недотроги) в основание кончиком пипетки и осторожно надавите в направлении противоположном конце наконечника, пока только голова подвергается.
  2. Растопите воск и стоматологического формировать ее по всему подвергается голову, убедившись, что воск придерживается на сложные глаза для безопасности и чтобы голова пчелы полностью неподвижным. Будьте уверены, чтобы не получить любой воск на антенны пчел.
  3. Как только голова находится в безопасности, чтобы площадь, окна-как, разрез в голову капсулы с помощью лезвия бритвы выключателя или соответствующего размера скальпелем вырезать кутикулу. С помощью лезвия выключателя, начиная с спинной стороне головной капсулы, сразу за антенны и прилегающих к одной из сложных глаз. Вырезатьпрямой линии, от одного соединения глазу на глаз контралатеральной соединения. После резки по прямой линии до противоположного глаза соединения, начать делать надрез сверху до головной капсулы кривые и заканчивается вблизи его грудной клетки. На данный момент, начинают вырезать к противоположному концу головной капсулы. Наконец, когда линия была сокращена до противоположного конца, сократить линию обратно в исходное положение начального разреза. Важно, чтобы удалить кутикулу, что находится рядом с антенной, так как это будет препятствовать вставки электрода.
  4. После того, кутикула обрезается, используйте пару щипцов для удаления кутикулы пчелы, которые затем должны подвергать мозг пчелы и, что более важно, усиков долях. Сразу начинают superfusing мозга с насекомыми солевым раствором, так что мозг не станет осушенный. После того, как мозг подвергается, обязательно используйте пару очень тонкий пинцет, чтобы удалить периневральным оболочки непосредственно над усиков долях. Будьте очень осторожны, чтобы непроколу мозга пчелы с помощью пинцета.

3. Газовой хроматографии с многоканальной записи

  1. Пчела "Подготовка", - зафиксировано в трубке с его мозг подвергается - готов к электрофизиологические записи. Поместите пчел в зажим, закрепленный на магнитной основе, который находится на воздухе таблице.
  2. Организовать мешок IV, регулятор потока, и трубы (заполненные солевым насекомых), так что солевой непрерывно superfuses мозга.
  3. Использование микроманипулятор, insertareference электрод, сделанный из вольфрамовой проволоки, в глаза пчелы.
  4. Использование отдельной микроманипулятора, вставьте многоканальных электродов, таких как тетрод проволочных спиралей или кремния многоканального электрода (Neuronexus Technologies), в усиков долей пчел. Этот электрод соединен с предварительным усилителем, таких как S-3 системы ТДТ в Z серии Z-шины bioamp процессор ТДТ системы. Выход из газа ChroДетектор matogram автора через экранированный кабель BNC может быть сопряжена с системой усилителей и сбора данных, что оба нервные и GC сигнала будет синхронизирована.
  5. Подождите примерно 30-60 минут для записи нейронной стабилизироваться. После того, спонтанная активность и форму волны единиц в записи каналов стали последовательно, использовать запах шприц, чтобы стимулировать пчел и наблюдать за реакцией записи каналов на запах.
  6. Запись внеклеточной шипы от нейронов авто-пороговой записи каналов 3,5 до 5 сигма сигнала на отдельных каналах записи. Руководство порога может потребоваться для некоторых каналов, чтобы избежать загрязнения от электрических помех. Потенциалы действия от нейронов появится как скачков напряжения в канале регистрации. Когда напряжение канала превышает пороговое значение, система буферов и экономит несколько миллисекунд до и после пересечения порога, тем самым забираюга моментальный снимок формы сигнала, или шип.
  7. Сразу рядом с воздуха таблице GC. Перед инъекционных цветочный экстракт в GC, убедитесь, что метод температура рампы выполнения GC является правильным. В нашем примере мы используем метод температуры, начиная с 50 ° C в течение 4 мин с последующим повышением температуры со скоростью 10 ° C / мин. до 220 ° C, в какое время мы проводим GC для дополнительных 6 мин. Мы используем DB-5 GC колонки (J & W Scientific, Фолсом, Калифорния, США), с гелием в качестве газа-носителя. Без деления потока на входе, с температурой, установленной до 200 ° C. Детектором ионизации пламени температура устанавливается до 230 ° C.
  8. Инъекция экстракта образца цветочные свободное пространство в нагретую впрыска ГК выпустить адсорбированные летучие вещества в колонке GC. Выходящий из колонки разделен между 1:01 пламенно-ионизационный детектор (FID) и пчела антенну с помощью стеклянной "Y" соединитель (J & W Scientific). Начать записьОрдинг от электрода, как вы вводите образца в ГХ.
  9. После запуска GC закончил, пусть подготовки остальные от 5 до 15 мин. Тогда либо вводят другого образца в ГХ или стимулировать подготовку с помощью одного летучие соединения или смеси соединений. В этом последнем методе стимулирования подготовки, импульсы воздуха от постоянного потока воздуха направляется через стеклянный шприц, содержащий кусочек фильтровальной бумаги, на котором соединения будут сданы на хранение. Запах стимул импульсные с помощью электромагнитного активированного клапан, управляемый с помощью программного обеспечения.
  10. Если единица активности внезапно останавливается или изменения, проверьте солевой капельного и пусть подготовки остальных в течение 15 мин. Если спонтанной активности не восстановить свой прежний уровень, то подготовка должна быть отброшена, а другая пчела, если доступно.
  11. После эксперимента исправить мозга с 5%-ного формалина в течение 20 минут с зондом еще в ткани. Далее, акцизы мозгаи поместить его в 2% глутаральдегида в течение 4 часов, а затем делать серии градуированных обезвоживанию этанола и очистить мозг с метилсалицилат. На основании фиксации и очистки ткани, мест в AL, где электроды проколот ткани должны быть четко различимы конфокальной микроскопии.

4. Анализ данных

  1. Анализ собранных данных после эксперимента, чтобы отделить и идентифицировать записанные нейронных единиц. Использование типичных программ (Offline сортировщик, MClust, и SClust) в отдельные сигналы, или "шипы", основанный на шипованные формы, такие как пик или долина амплитуды, полушириной пика, и т.д., или сокращенные меры (основные компоненты) 17 , 18 (рис. 2). Используйте только те кластеры шипы, которые разделены на три-мерном пространстве (PC1-PC3) и статистически отличаются друг от друга (многомерного дисперсионного анализа, р <0,05) (рис. 2) для дальнейшего анализа. Пожалуйста, обратитесь кЦитата # S 17-19 для полного описания тетрод записи и шип-сортировочный методологии.
  2. Тайм-штамп шипов в каждом кластере, а также экспортировать эти данные для анализа с использованием MATLAB или Neuroexplorer (Nex технологий, Winston-Salem, NC) для создания растровых участков и скорострельность ответов (рис. 2, 3А).
  3. Определить время удерживания летучих использованием одновременно записывать GC данных. Используйте время удерживания летучих веществ, определяется вершине пика на хроматограмме, чтобы изучить устройство ответы на эти моменты времени.
  4. Для изучения индивидуальных ответов устройство через перспективе GC, BIN число шипов в 100 мс интервалах и изучить времени хода скорострельность ответы со ссылками на время удержания элюируя летучих веществ. Биннинга шипов в 100 мс интервалах обеспечивает достаточно подробно, или сигнал, примерно в то время, конечно нейронных ответ на элюируя одоранта с GC.
  5. Для EXAпомоему населения ответы на различные летучие элюирующие, интегрировать скорострельность ответов отдельных подразделений за 3 окна выборки сек, 1,5 сек до, и после 1,5 сек, время удерживания летучих (рис. 3). Этот период времени является типичной длительности выделяющих летучие от GC. Мы покажем, скорострельность ответы единиц цветового кодирования них (красный высокий отклик скорострельность, синий является низкий ответ) и расположив их как деятельность матрица с каждой строки представляют ансамбль ответ на GC стоков (столбцы) ( рис. 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В ГКХ методом с использованием M. lewisii цветочный аромат, мы вводим 3 мкл экстракта в ГХ. Общее количество летучих элюирования через GC, как правило, 60-70 летучих веществ. Аромат M. lewisii преимущественно состоит из монотерпеноиды, в том числе β-мирцен (ациклические) и α-пинен, а остальная часть аромата состоит из шести-углеродные летучих веществ, таких как 2-гексанола, и сесквитерпеноидов, которые составляют <1% свободного пространства.

ГКХ использ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Насекомых обонятельные-опосредованных поведения ездить много различных процессов, в том числе воспроизводство, принимающих выбор площадки, и выявления соответствующих продовольственных ресурсов. Изучение этих процессов требует способности идентифицировать летучих вылетающих из источника, а также возможность выявления тех соединений, которые посреднических поведения. Осложняет дело в том, что запахи состоят из десятков до сотен индивидуальных соединений, которые вместе создают уникальный аромат, который воспринимается ин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом NSF IOS 1121692, а также в университете Фонд исследований в Вашингтоне.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название пункта Компания Номер в каталоге Комментарии
Porapak типа Q 80-100 меш Воды WAT027060
Сумки Рейнольдс печи Рейнольдс
GC Agilent 7820A
GC колонки J & W Scientific, Фолсом, Калифорния, США DB-5 (30 м, 0,25 мм, 0,25 мкм)
Аналитический носителя гелия Praxair Его K 1 мл / мин
16-канальный кремния электрод Тех Neuronexusologies a4x4-3mm50-177
Изобразительное NiCr провода, 0,012 мм в диаметре) Sandvik Kanthal HP Reid PX000004 Для создания пользовательских тетроды и stereotrodes
Предварительный усилитель Такер-Davis системы PZ-2
Усилитель Такер-Davis системы RZ-2
Система сбора данных - OpenEx люкс Такер-Davis системы
Интернет-всплеска сортировка программного обеспечения - SpikePac Такер-Davis системы
Offline шипованные сортировка программного обеспечения - Mclust Спайк-сортировочный инструментов Дэвид Redish Департамента неврологии университетаМиннесота Бесплатно скачать на http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html MATLAB инструментов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
  2. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
  3. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
  4. Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
  5. Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
  6. Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
  7. De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570(1998).
  8. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
  9. Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
  10. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725(2010).
  11. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489(2011).
  12. Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
  13. Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 Forthcoming.
  14. Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
  15. Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
  16. Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. , e3440(2011).
  17. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. , e1098(2009).
  18. Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. , e3282(2011).
  19. Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
  20. Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
  21. Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
  22. Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
  23. Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
  24. Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
  25. Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
  26. Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382(2011).
  27. Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Olfactory VolatilesGas ChromatographyMulti unit RecordingsInsect Antennal LobeBumblebee BrainNeural RecordingsFloral HeadspaceElectrodes InsertionGCMR TechniqueVolatile Detection

Похожие статьи