Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высокая эффективность, определенных сайтов Трансфекция прилипшие клетки с помощью миРНК Микроэлектродные массивы (MEA)

12.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4415

⸱

13 сентября 2012 г.

 , 
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University

В этой статье

Краткое содержание

В статье подробно протокол для сайт-специфической трансфекции яичницу последовательности миРНК в приверженцем культуры млекопитающих ячейки с помощью микроэлектродов массива (МПС).

Аннотация

Открытие пути РНК-интерференции (РНКи) у эукариот и последующая разработка агентов РНКи, таких как siRNA и shRNA, позволили создать эффективный метод сайленсинга специфических генов1-8 для функциональной геномики и терапии. Одной из основных проблем исследований на основе РНКи является доставка агентов РНКи в целевые клетки. Традиционные невирусные методы доставки, такие как массовая электропорация и химическая трансфекция, часто характеризуются отсутствием необходимого пространственного контроля доставки и низкой эффективностью трансфекции9-12. Современные достижения в области методов химической трансфекции, включая использование катионных липидов, катионных полимеров и наночастиц, привели к значительному повышению эффективности трансфекции13. Однако эти методы по-прежнему не обеспечивают точного пространственного контроля доставки, что могло бы принести огромную пользу миниатюрным высокопроизводительным технологиям, исследованиям единичных клеток и изучению межклеточных взаимодействий.

Последние технологические достижения в области доставки генов позволили осуществлять высокопроизводительную трансфекцию адгезивных клеток14-23, причем в большинстве случаев используется микромасштабная электропорация. Микромасштабная электропорация обеспечивает точный пространственно-временной контроль доставки (вплоть до отдельных клеток) и, как было показано, позволяет достичь высокой эффективности19, 24-26. Кроме того, подходы на основе электропорации не требуют длительного периода инкубации (обычно 4 часа) с комплексами siRNA и ДНК, что необходимо при использовании методов химической трансфекции, и приводят к прямому проникновению «голых» молекул siRNA и ДНК в цитоплазму клетки. В результате экспрессия генов может быть достигнута уже через шесть часов после трансфекции27. Ранее в нашей лаборатории была продемонстрирована возможность использования микроэлектродных матриц (MEA) для сайт-специфической трансфекции в адгезивных культурах клеток млекопитающих17-19. В подходе на основе MEA доставка генетического груза осуществляется посредством локализованной микромасштабной электропорации клеток. Подача электрического импульса на выбранные электроды создает локальное электрическое поле, которое приводит к электропорации клеток, находящихся в области стимулируемых электродов. Независимое управление микроэлектродами обеспечивает пространственный и временной контроль трансфекции, а также позволяет проводить несколько экспериментов по трансфекции на одной и той же культуре, что повышает производительность экспериментов и снижает вариабельность между разными культурами.

В данной работе мы описываем экспериментальную установку и протокол направленной трансфекции адгезивных клеток HeLa с помощью электропорации с использованием siRNA со скремблированной последовательностью, меченной флуоресцентной меткой. Этот же протокол может быть использован для трансфекции плазмидных векторов. Кроме того, описанный здесь протокол может быть легко адаптирован для различных линий клеток млекопитающих с внесением незначительных модификаций. Коммерческая доступность MEA как с предопределенными, так и с индивидуальными паттернами электродов делает этот метод доступным для большинства исследовательских лабораторий, оснащенных базовым оборудованием для культивирования клеток.

Протокол

1. МЭС подготовка

  1. МЭС для использования в экспериментах электропорации может либо быть изготовлены с использованием стандартной техники фотолитографии, как описано ранее 18 или приобрести непосредственно у поставщиков производителей MEA, такие как многопользовательская система Channel (http:/www.multichannelsystems.com/) и альфа-MED Scientific, Inc ( http://www.MED64.com) . МПС используются в наших экспериментах были изготовлены в доме на чистое средство номер в университете штата Аризона, который находится в ведении Центра по твердотельной электроники исследований (CSSER). МЭС использовали в наших экспериментах было 32 индия электродов оксида олова в 8 на 4 массива с электродами диаметром от размеров 50-200 мкм в пределах 1 см внутренний диаметр стекла хорошо. Стекла также были связаны с MEA Используя полидиметилсилоксана (PDMS).
  2. Стерилизовать MEA в автоклаве до клетки сeeding. Другие методы стерилизации, такие как замачивание в 70% этаноле, УФ-обработки и горячей обработки воды, как описано в другом месте также может быть использован как долго они не ставят под угрозу целостность МПС.
  3. Передача автоклавного МЭА ламинаре и поместить его в стандартный стерильную чашку Петри полистирола. До посева клеток на MEA, стерилизовать капотом ламинарного потока путем включения УФ-светом в течение 20 мин. Если MEA чувствителен к ультрафиолетовому излучению покрытие чашки Петри содержащие MEA стерильной алюминиевой фольги, в то время как поток капот под действием УФ-освещения.

2. Посев Ячейки MEA

  1. Урожай клетки работают клеточной линии приверженцем клетках млекопитающих, используя трипсин / ЭДТА и поднять их до концентрации 100-200 клеток / мкл в 1 мл клеточную среду для посева. В наших экспериментах мы добились успеха в культивировании NIH 3T3 клетки фибробласты линии, линия клеток HeLa и первичных корковых нейронов гиппокампа и на МПС.
  2. Подать 20-30 мкл каплю среды с клетками на МПС. Передача чашки Петри с МЭА в инкубаторе. Важно убедиться, что размер ячейки падение является достаточно большим, чтобы охватить все электроды на МПС.
  3. 2 ч после посева клеток переносить чашки Петри с MEA из инкубатора для ламинарного потока капот и аккуратно добавьте 400-500 мкл предварительно подогревается СМИ (37 ° C) в МЭС хорошо. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки все еще привязаны и равномерно распределить по поверхности МЭС. Передача назад МЭА в инкубаторе. 2 часа период ожидания перед добавлением средств массовой информации обеспечивает достаточно времени для клеток придерживаться с поверхностью МПС. Добавление ячейки СМИ вскоре после посева клеток может смыть клетки. Если клетки не придерживаются также на MEA, его поверхность можно лечить с помощью прикрепления клеток такие факторы, aspolylysine, фибронектина и ламинина для улучшения адгезии клеток. В наших экспериментах клетки HeLa мы обычно обработать поверхность MEA с fibronectiл (10 мкг / мл) в течение 1-2 часов.
  4. 8-12 ч после посева клеток, выполняют 1-2 промывок PBS для удаления мертвых клеток. Сотовые среда может менять каждые 24-48 часа по мере необходимости. В типичном эксперименте, клетки, как правило, готовы к трансфекции 24-48 ч после посева. Для обеспечения согласованности в электропорации эффективности рекомендуется подождать, пока культура не менее 80% вырожденная до электропорации.

3. Сайт-специфическая Трансфекция миРНК

  1. Подготовка нуклеиновые кислоты. Для миРНК трансфекции, готовить 1-2 мкм миРНК электропорации решение в ледяном буфере электропорации для достижения конечного объема 200-400 мкл. В этом видео статье мы покажем, трансфекции клеток HeLa с Alexa 488 сопряженной яичницу последовательности миРНК.
  2. Передача MEA с клетками из инкубатора к стерильным ламинаре. Удалить ячейки массовой информации в МПС и выполнить промывку PBS. После этого, добавьте 200-400 мкл яCE холодного 1 мкМ миРНК электропорации решение хорошо.
  3. Применить анодных квадратных электрических импульсов к целевым электродами (см. шаг 4 для определения оптимальных параметров электрического импульса). В наших экспериментах мы использовали прагматические инструменты 2414A Генератор сигналов для генерации электрических импульсов и двойной встроенный пакет (DIP) 16 контактный клип вступить в контакт с прокладками MEA связи. Генератор сигналов может быть подключен к DIP-клип с помощью демультиплексора печатной платы, чтобы обеспечить селективность отдельных электродов. Для электрода сравнения, поместить стального катода в ячейке СМИ. При опускании электродов сталь ссылки в СМИ крайне важно, чтобы убедиться, что он не имеет контакта с поверхностью МПС. При контакте, это может привести к повреждению клеток и МПС. Рекомендуется снизить электрод в положение 1 мм над клетками. Прокладка с высоты 1 мм могут быть размещены в хорошо для оказания помощи в размещении ссылокразностных электрода. Альтернативный подход к использованию внешних электрода сравнения заключается в использовании соседних электродов катод-анод пар.
  4. Сразу же после применения электрических импульсов к целевому электродов на MEA, передает назад МЭА в инкубаторе. После инкубации в течение 5 мин, аккуратно заменить 75% электропорации буфера с подогретого (37 ° C) средства массовой информации клетки. Позже, флуоресцентные изображения может быть сделано для подтверждения доставки флуоресцентно отмеченных миРНК в клетки.

4. Оптимизация параметров электропорации

  1. Для определения оптимальных параметров электрического импульса для электропорации, дизайн электропорации экспериментов для различных значений амплитуды импульсов, длительность импульса и количество импульсов. Как показывает наш опыт с клетками HeLa, мы обнаружили, что одного импульса напряжения амплитудой от 3 В до 9 В и длительностью от 1 мс до 10 мс для электродов размером 100 мкм привело к успешному электропорации мильНимал гибели клеток. Это наша рекомендация, что один параметр можно варьировать в то время, и другие остаются постоянными. Для количественной оценки эффективности электропорации для каждого из параметров импульса, мы используем пропидия йодида (PI), краситель клетки impermeant, что пятна нуклеиновых материалом, и живой анализа на основе методологии, как описано в пунктах 4.2-4.5.
  2. Создание клеточной культуры на МПС в соответствии с направлениями, указанными в пунктах 1 и 2.
  3. До электропорации подготовить 300-500 мкл 30 мкг / мл PI решение в ледяном буфере электропорации и 400 мкл 4 мкМ calcien AM решение в PBS.
  4. Передача MEA из инкубатора в ламинарном боксе. Удалить ячейки массовой информации в МПС и выполнить промывку PBS. После этого, добавьте 300-500 мкл ледяного буфера электропорации с PI.
  5. Применение электрических импульсов с заданной амплитудой и длительностью импульса к целевым электродов (оборудование, используемые в наших экспериментах для создания и применения электронныхэлектрического импульса на MEA описано в шаге 3,3). Для электрода либо снизить стали электрод в электропорации буфера в МЭС хорошо или использовать соседний электрод в качестве ссылки. По выборочного применения импульсов различной амплитуды и продолжительности различных электродов многочисленные эксперименты могут быть выполнены на том же устройстве. Например, на 32 электродов MEA, 8 эксперименты могут быть выполнены путем расщепления на 32 электродов в 8 групп, каждая из которых состоит из 4 электродов. Каждый из 8 групп может быть стимулировано одного прямоугольного импульса напряжения длительностью 5 мс с амплитудой в 3 различных V-6 Диапазон V с шагом 0,5 В и одну группу могут быть использованы в качестве контроля.
  6. Сразу после нанесения импульсов напряжения передать МЭА в инкубаторе в течение 5 мин. Затем аккуратно удалить 75% электропорации буфер из MEA хорошо, и заменить его теплой СМИ ячейки. Передача назад МЭА в инкубаторе.
  7. После инкубационного периода в 2-4 часазаменить ячейку средств массовой информации в МПС и в 300-500 мкл 4 мкМ Calcein AM решение в PBS. Передача назад МЭА в инкубаторе в течение еще 30 мин.
  8. После инкубации клеток с Calcein AM, заменить Calcein AM решения в МЭС хорошо с PBS после двух промывок PBS. Получить флуоресцентных изображений клеток с использованием с помощью оптического микроскопа с фильтрами для ПИ (возбуждение / излучение - 535 nm/617 нм) и Calcein AM (возбуждение / излучение - 490 nm/520 нм). Поглощение PI, в связи с электропорации, заставляет клетки светятся красным и Calcein AM заставляет клетки, которые живы светиться зеленым цветом. Три возможных сценария, которые могут наблюдаться: 1) клетка электропорации и живой (и будут светиться красный и зеленый), 2) клетки живых, но не электропорации (и будут светиться только зеленые) и 3) клетки мертвы из-за электропорации (и будут светиться только красным) . Жизнеспособность клеток рассчитывается как процент от общего числа клеток живого на электрод и электропорации эффiciency рассчитывается как процент от общего числа клетки, нагруженные PI / миРНК.

5. Представитель Результаты

На рисунке 1 показана сайт-специфической нагрузки клеток HeLa с PI. Это можно наблюдать, что только клетки на электроде продемонстрировать поглощение PI (рис. 1б). Онлайн-тест выполняется сообщению электропорации были использованы для оценки жизнеспособности клеток (рис. 1А). Эффективность электропорации и жизнеспособности клеток для примера, показанного на рисунке 1, 81,8% и 96,1% соответственно. Высокая жизнеспособность клеток и электропорации эффективность может быть достигнута путем оптимизации параметров электропорации импульса. Сайт-специфическая трансфекции клеток HeLa с флуоресцентной отмеченных миРНК для оптимизации импульса электропорации (8 В, 1 мс) показана на рисунке 2. Электропорации эффективности миРНК 8 В, 1 мс оказалось 74,4 ± 16,0% ижизнеспособность клеток было установлено, что 87,9 ± 8,4% (все данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, N = 5).

figure-protocol-1
Рисунок 1. Конкретных участков поставки PI в клетках HeLa на 200 мкм электрод (6 V, 5 мс). A) Calcien основе анализа живой выполнила 2 ч после электропорации. Живые клетки обозначены зеленой флуоресценции. B) красная флуоресценция показывает поглощение PI клетками на электроде. C) накладывается изображение А и В. белые стрелки указывают клетки, которые электропорации и живым. Черные стрелки указывают клетки, которые мертвы. Белый круг в A, B и C обозначает контуры электродов.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Трансфекция клеток HeLa с флуоресцентной отмеченных scramblэлектронной последовательности миРНК. A) изображения клеток HeLa на 100 Электрод мкм трансфицировали Alexa 488 отмеченных миРНК (8 В, 1 мс). Б) изображение клеточных ядер окрашивали DAPI. Белый круг знаменует края электрода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом видео статье мы демонстрации использования МПС для конкретных участков трансфекции клеток HeLa с яичницей последовательности миРНК. Одним из преимуществ данной технологии является ее применимость к различным клеточных линий, включая первичные клеточные линии. Наша лаборатория ранее продемонстрировали использование этой технологии для сайт-специфической трансфекции первичных нейронов гиппокампа культуры от E18 дневных крыс и NIH-3T3 с яичницей миРНК последовательности и GFP плазмиды 18, 19. Мы также име...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Материалы

Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
Сотовые СМИ:
Расширенный MEM
L-Glutamine 200 мМ
Пенициллина / стрептомицина
Эмбриональной бычьей сывороткой 		Gibco / Invitrogen
HIMEDIA Лаборатории / VWR
Lonza Group ООО
Gibco / Invitrogen 		12492-013
95057-448
09-757F
16000-044 		Клеточного состава сред:
2% FBS, 2% L-глутамина и 2% Pennstrep заранее MEM
Трипсин EDTA Mediatech, Inc 25-053-CL
PBS Mediatech, Inc 21-040-CV
Alexa 488 и родамина отмеченных яичницу SEQUENCE миРНК Qiagen, Inc 1027292
Electroporation буфер Biorad лабораторий 165-2677
Генератор сигналов Прагматический 2414A Любой сигнал / импульсный генератор, который может обеспечить желаемые импульсы могут быть использованы.

Ссылки

  1. Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742(2001).
  3. Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
  4. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550(2002).
  5. Lee, N. S. Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).
  6. Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
  7. Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
  8. Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo. Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).
  9. Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15, 1311(1987).
  10. Felgner, P. L. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413(1987).
  11. Raptis, L. H. applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide. Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).
  12. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).
  13. Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers. International Journal of Nanomedicine. 6, 1017(2011).
  14. Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411, 107-110 (2001).
  15. Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes. Nucleic Acids Res. 32, e187(2004).
  16. Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer. Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).
  17. Jain, T., Muthuswamy, J. Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells. Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).
  18. Jain, T., Muthuswamy, J. Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture. Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).
  19. Jain, T., Muthuswamy, J. Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording. Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).
  20. Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays. Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).
  21. Huang, H. An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery. Lab Chip. 11, 163-172 (2010).
  22. Efficient and high-throughput electroporation chips. Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference (TRANSDUCERS), 2011 16th International, , IEEE. (2011).
  23. Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays. Lab Chip. 12, 939-947 (2012).
  24. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
  25. Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region. J. Neurophysiol. 93, 594(2005).
  26. Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).
  27. Boukany, P. E. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

siRNAHeLaCalcein AM
Высокая эффективность, определенных сайтов Трансфекция прилипшие клетки с помощью миРНК Микроэлектродные массивы (MEA)
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.