Получение клеточных линий для условных нокдаун экспрессии генов и измерения нокдаун влияние на E4orf4-индуцированной гибелью клеток

Summary

Вклад ремоделирования хроматина ACF фактор E4orf4-индуцированной гибели клеток была измерена. Протокол включает в себя отбор клеточных клонов, в которых доксициклин Лечение вызывает условную нокдаун ACF подразделений Acf1 и SNF2h и использование анализа DAPI для измерения E4orf4-индуцированной гибели клеток в линии индуцибельной клетки.

Abstract

Функциональная инактивация экспрессии генов в клетках млекопитающих имеет решающее значение для изучения вклада белков, представляющих интерес для различных ^1,2 путями. Тем не менее, условное нокдаун экспрессии гена требуется в тех случаях, когда учредительные нокдаун не допускается клетками в течение длительного периода времени ^3-5. Здесь мы опишем протокол для приготовления клеточных линий, позволяющих условного нокдаун подразделений реконструкции фактора ACF хроматина. Эти клеточные линии облегчения определения вклада ACF к индукции клеточной смерти аденовирус E4orf4 белка ^6. Последовательности, кодирующие коротких РНК шпилькой для Acf1 и SNF2h подразделений ремоделирования хроматина фактора ACF были клонированы рядом с доксициклином индуцируемого промотора в плазмиды, содержащие также ген для гена устойчивости к неомицину. Неомицин-устойчивых клеточных клонов были отобраны в присутствии G418 и изолированным. В результате клеточных линий были вызваныдоксициклин лечение, и как только Acf1 или SNF2h уровни экспрессии были снижены, клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей E4orf4 или пустой вектор. Для подтверждения конкретного эффекта конструкций ShRNA, уровни Acf1 или SNF2h белка были восстановлены в WT уровней котрансфекции с плазмиды выражения Acf1 или SNF2h которые были оказаны устойчивы к ShRNA путем введения молчащих мутаций. Способность E4orf4, чтобы вызвать гибель клеток в различных образцах определяли с помощью анализа DAPI, в которых частота появления ядер с апоптоза морфологией в трансфицированных популяции клеток измеряли ^7-9.

Протокол, описанный здесь, может быть использована для определения функционального вклада различных белков в индукции клеточной смерти со стороны своих партнеров белка в случаях, когда учредительные нокдауна может быть клетка смертельным.

Protocol

1. Генерация линии Индуцибильные сотовых

1. До начала эксперимента нужно найти минимальную концентрацию препарата G418, который убивает все клетки используют для приготовления желаемых клеточных линий. Для этого, плиты клетки выбор в нескольких дублирующих пластин при 70% слияния в среде, которая будет использоваться в ходе эксперимента и добавить повышение концентрации G418 (0-1000 мкг на мл). Мониторинг клетки ежедневно, чтобы определить минимальную концентрацию G418, который убивает клетки эффективно. Гибель клеток наблюдается в течение 3-7 дней.
2. До поколению клеточных линий рекомендуется проверить, переходный анализы трансфекции, что плазмиды вы....

Discussion

Нокдаун конкретных экспрессии генов является важным подходом к изучению вклада белка регуляторные пути. С учредительных нокдаун выражение существенных генов негативно влияет на пролиферацию клеток, их изучение может потребовать либо переходного введение siRNAs или применения стабильных систем условного нокдаун. Генерация стабильных клеточных линий с мощностью лекарственно-индуцированной экспрессии shRNAs описанные здесь, обеспечивает преимущество по сравнению с переходной трансфекции, которая не может быть эффективным в.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Высокий уровень глюкозы в DMEM	Gibco	41965
Тет системы утвержденных FBS	Clontech	631106
L-глютамин	Gibco	25030
Pen Strep	Gibco	15140
0,25% трипсина-EDTA	Gibco	25200
T-Rex-293 клеток	Invitrogen	R710-07
G418	Сигма	A1720
бластицидин	InvitРоген	R210-01
pSuperior.neo + GFP плазмиды	OligoEngine	VEC-PBS-0007/0008
jetPIE	Polyplus трансфекции	101-40
доксициклин	Сигма	D9891
параформальдегид	Электрон наук микроскопии	15710
4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI)	Сигма	D9542
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01