Вклад ремоделирования хроматина ACF фактор E4orf4-индуцированной гибели клеток была измерена. Протокол включает в себя отбор клеточных клонов, в которых доксициклин Лечение вызывает условную нокдаун ACF подразделений Acf1 и SNF2h и использование анализа DAPI для измерения E4orf4-индуцированной гибели клеток в линии индуцибельной клетки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Получение клеточных линий для условных нокдаун экспрессии генов и измерения нокдаун влияние на E4orf4-индуцированной гибелью клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Функциональная инактивация экспрессии генов в клетках млекопитающих имеет решающее значение для изучения вклада белков, представляющих интерес для различных 1,2 путями. Тем не менее, условное нокдаун экспрессии гена требуется в тех случаях, когда учредительные нокдаун не допускается клетками в течение длительного периода времени 3-5. Здесь мы опишем протокол для приготовления клеточных линий, позволяющих условного нокдаун подразделений реконструкции фактора ACF хроматина. Эти клеточные линии облегчения определения вклада ACF к индукции клеточной смерти аденовирус E4orf4 белка 6. Последовательности, кодирующие коротких РНК шпилькой для Acf1 и SNF2h подразделений ремоделирования хроматина фактора ACF были клонированы рядом с доксициклином индуцируемого промотора в плазмиды, содержащие также ген для гена устойчивости к неомицину. Неомицин-устойчивых клеточных клонов были отобраны в присутствии G418 и изолированным. В результате клеточных линий были вызваныдоксициклин лечение, и как только Acf1 или SNF2h уровни экспрессии были снижены, клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей E4orf4 или пустой вектор. Для подтверждения конкретного эффекта конструкций ShRNA, уровни Acf1 или SNF2h белка были восстановлены в WT уровней котрансфекции с плазмиды выражения Acf1 или SNF2h которые были оказаны устойчивы к ShRNA путем введения молчащих мутаций. Способность E4orf4, чтобы вызвать гибель клеток в различных образцах определяли с помощью анализа DAPI, в которых частота появления ядер с апоптоза морфологией в трансфицированных популяции клеток измеряли 7-9.
Протокол, описанный здесь, может быть использована для определения функционального вклада различных белков в индукции клеточной смерти со стороны своих партнеров белка в случаях, когда учредительные нокдауна может быть клетка смертельным.
Протокол
1. Генерация линии Индуцибильные сотовых
- До начала эксперимента нужно найти минимальную концентрацию препарата G418, который убивает все клетки используют для приготовления желаемых клеточных линий. Для этого, плиты клетки выбор в нескольких дублирующих пластин при 70% слияния в среде, которая будет использоваться в ходе эксперимента и добавить повышение концентрации G418 (0-1000 мкг на мл). Мониторинг клетки ежедневно, чтобы определить минимальную концентрацию G418, который убивает клетки эффективно. Гибель клеток наблюдается в течение 3-7 дней.
- До поколению клеточных линий рекомендуется проверить, переходный анализы трансфекции, что плазмиды выражения ShRNA можете уменьшить до некоторой степени экспрессии гена в стадии изучения. Это может быть сделано в любой ячейке строки, которая может быть эффективно трансфекции.
- Пластина T-Rex-293 клеток при плотности около 5х10 6 клеток на 10 см пластины в 8 мл DMEM среде (содержащей 10% Tet систволовые утвержденных FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 единиц на мл пенициллина и 0,1 мг на мл стрептомицина, 5 мкг на мл бластицидин). Инкубируйте пластины течение ночи при 37 ° C, 5% CO 2.
- На следующий день, изменить среду до 8 мл свежей среды до трансфекции.
- Трансфекции клеток с использованием 10 мкг pSuperior.neo + GFP плазмиды (рис. 1) кодирование Acf1 или SNF2h ShRNA обусловлено тетрациклин-индуцируемых H1 промоутера, а также неомицин ген устойчивости, слитый с GFP и управляется конститутивный промотор PGK. Добавить ДНК в 500 мкл 150 мМ NaCl. Добавить jetPIE реагента в другой аликвоты 500 мкл 150 мМ NaCl в 2 мкл на мкг ДНК. Добавить jetPIE решение ДНК и хорошо перемешать встряхиванием. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре. Аккуратно пипетки комплексов ДНК на 10 см пластин, содержащих 70-80% вырожденная клеток. Вернуться пластин в инкубатор.
- На следующий день заменить среде с селективной среде (DMEM среде,описанные выше содержащий дополнительные 500 мкг на мл G418).
- В течение следующих двух недель следить за клетками и заменить селективной среде с аналогичным свежую среду каждые 3-4 дня до колонии появляются и могут быть визуализированы без микроскопа.
- До выделения колоний, подготовить 24-луночные планшеты с селективной средой.
- Определить колонии на глаз, и отметьте их расположение в нижней части панели с помощью цветных маркеров. Проверка под микроскопом, что колонии хорошо разделены.
- В стерильных капот, аспирации среды от плиты, аккуратно смойте теплой PBS и аспирации а все остальные жидкости. Добавить 3 мкл 0,25% трипсин / ЭДТА в одной колонии на тарелку. Внесите трипсина, пока клетки отделяются и добавить их в одной из скважин в 24-луночный планшет. Повторите это несколько других колоний на тарелку.
- Рост клеток при 37 ° C, 5% CO 2, пока они заполняют хорошо. Затем разделить клетки, полученные изКаждый из первых колоний в трех скважин, каждая в отдельном 12-луночный планшет, и инкубировать в течение ночи.
- На следующий день, замените носитель в одной пластине с среде, содержащей 1 мкг на мл доксициклина из маточного раствора, подготовленный в дважды дистиллированной воде (1-5 мг на мл). Замените среду в контрольной чашке со средними без доксициклина. Инкубируйте клетки в течение 72 ч при температуре 37 ° C, 5% CO 2.
- Урожай клеток от одного рассматривать и одного необработанного и каждой клетки клона для приготовления протеиновых экстрактов и Вестерн-блоттинга для определения эффективности Acf1 или SNF2h нокдаун. Использование антител к Acf1 или SNF2h, а также антител к альфа-тубулина, выступающей в качестве управления загрузкой. Используйте клеток в третьей скважины, лечить, для расширения выбранного клеточных клонов, в которых доксициклин Кроме привело, по меньшей мере, 50% снижение уровня белка в стадии изучения. Замораживание аликвоты этих клеток в 90% FBS, 10% DMSO для дальнейшего использования.
- Пластина клеток в селективной среде в 10 см пластин. Добавить доксициклин в дозе 1 мкг на мл до половины пластины и инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2 в течение 48-72 ч (см. Рисунок 4).
- Через 48-72 ч, trypsinize клеток из каждой группы клеток, сосчитать их, и пластины 1.5x10 6 клеток на 6 см пластины в той же среде, с или без доксициклина. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO 2 в течение ночи. План таким образом, чтобы каждая группа плит из раздела 2.1 обеспечит клетки в течение двенадцати 6 см пластины, в том числе двух экземплярах для анализа DAPI для каждой точки, а также одна пластина для вестерн-блот анализ каждого образца (см. рисунок 4).
- На следующий день трансфекции клеток в 6 пластин см со следующей комбинации плазмид: 1 мкг пустой плазмиды или одинаковое количество плазмиды, кодирующей E4orf4, вместе с 4 мкг векторавыражающий Acf1-GFP или SNF2h-GFP оказанных устойчивы к ShRNA в клеточных клонов путем введения молчащих мутаций, или 3 мкг соответствующий пустой вектор и 1 мкг плазмиды выражения GFP (рис. 4). Используйте jetPIE реагента, как описано выше (10 мкл на 5 мкг ДНК), чтобы подготовить трансфекции смесь. Для каждого образца, готовить смесь для трансфекции трех пластин.
- После 15 мин инкубации ДНК с jetPIE реагентов при комнатной температуре, осторожно пипеткой равное количество комплексов ДНК от каждой трансфекции смесь на три 6 пластин см и инкубируют при 37 ° C, 5% CO 2 в течение ночи.
3. DAPI анализа в трансфицированных клетках
- На следующий день, извлечения белков из одной пластины на пробы для анализа блот Западной определить, что Acf1 или SNF2h были эффективно сбили с ног и, что E4orf4 было выражено одинаково в разных образцов.
- Аспирируйте среды от плиты предназначены для DAPIАнализ, мыть пластины осторожно PBS и добавьте 1 мл 4% параформальдегида подготовлен в PBS, чтобы покрыть клеток. Приготовление раствора формальдегида и лечение клетки с этого химического вещества должна осуществляться в химической капот. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре без встряхивания.
- Аспирируйте параформальдегида и вымыть три раза с PBS, раскачиваясь при комнатной температуре в течение 5 минут каждый раз. Добавить 80% этанола храниться при температуре -20 ° C и инкубировать при температуре -20 ° C в течение не менее 1 часа. Пластины можно держать под этанола при -20 ° C в течение нескольких дней, пока они запечатаны также для предотвращения испарения этанола и сушки.
- Аспирируйте этанола и промыть клетки дважды с PBS и один раз PBS-BT (PBS, содержащем 0,5% БСА и 0,05% твин-20), раскачиваясь при комнатной температуре в течение 5 минут каждый раз.
- Для предотвращения неспецифического связывания антител, блокировать клеток в 1 мл PBS-BT буфера, содержащего 10% козьей сыворотки в течение 20 мин при качалки при комнатной температуре. Затем промыть тОн клетки дважды в PBS-BT, 5 мин каждого мытья.
- Инкубируйте клетки с первичными антителами (E4orf4-специфических антител в нашем случае) в 1 мл PBS-BT в течение 1 часа при качалки при комнатной температуре. Затем промыть дважды в PBS-BT и один раз в PBS, содержащем 0,1% БСА, 5 мин каждого мытья.
- Инкубируйте клеток в 1 мл PBS-0.1% BSA содержащий соответствующие вторичные флуоресцентно-меченые антитела и 0,5 мкг на мл конечная концентрация DAPI в течение 40 мин при качалки при комнатной температуре в темноте. Затем промыть водой с PBS в течение 5 мин, высушить и стремлением сохранить и пластины с ног на голову в течение дополнительного часа ночи, чтобы достичь полного высыхания. Затем установите крышку слайды на клетки, используя Fluoromount-G решений. Храните пластины при температуре 4 ° С в темноте до готовности рассчитывать апоптоза ядер.
- Попросите коллегу для идентификации различных пластин нового номера, поэтому подсчет апоптоза ядер в различных образцах может быть сделано в непредвзято.
- Визуализируйте клеток при Upright флуоресцентный микроскоп с увеличением 400X (в воздухе) или 630X (в иммерсионного масла). Определить трансфицированных клеток, которые окрашиваются в различные белки, выраженные в каждом образце, и подсчитать количество конденсированных или фрагментированных ядер визуализировали окрашиванием DAPI в трансфицированных клеточной популяции. Мониторинг нескольких полей и рассчитывать в общей сложности не менее 200 трансфицированных клеток.
- Рассчитать процент ядер с апоптоза морфологией в трансфицированных клеточной популяции. Повторите эксперимент с дубликатами, 2-3 раза для расчета статистической значимости различий между различными образцами.
4. Представитель Результаты
Эффективность получения колоний, в которых условные нокдаун экспрессии генов был успешным является переменной величиной, в зависимости от гена, вовлеченного. В наших руках, мы получили 7 успешных колоний из 12-тестирование на Acf1 и 6 из 18 для SNF2h. Рис. 2 шРМО представитель пластины отдельных клеточных клонов (рис. 2A), а также одной колонии (рис. 2В). рисунке 3 показана представитель пятно подготовлен с белками извлечены из клеток различных клонов, выращенных в присутствии или отсутствии доксициклина в течение 72 часов. Пятно окрашивали антителами к SNF2h и альфа-тубулина, выступающей в качестве управления загрузкой. Два из клонов (№ 4 и 5) показал сильное снижение уровня SNF2h на доксициклин индукции. Следует отметить, что, хотя pSuperior.neo + GFP плазмиды (рис. 1) используется для генерации клеточных линий, кодирующий GFP нео-гибридного белка, зеленая флуоресценция в стабильных клеточных линий была очень низкой и экспрессии других белков слияния GFP введены временно в эти клетки могут быть легко обнаружены над флуоресценции зеленом фоне.
Схематическое изображение экспериментов, проведенных в клеточных клонов для измеренияУбедитесь, что эффект Acf1 или SNF2h нокдаун на E4orf4-индуцированной гибели клеток показано на рис. 4. Время, необходимое для нокдаун экспрессии генов лечения доксициклином может варьироваться в зависимости от стабильности белков, уровни которых должна быть уменьшена. Для Acf1 и SNF2h, 72 часа лечение было необходимо для эффективной нокдаун на уровне белка.
Рисунок 5 показывает пример клеток, экспрессирующих GFP и E4orf4 и проходит гибели клеток проявляется в появлении DAPI-окрашенных ядер с конденсированной или фрагментарной морфологии. Рисунке 6 показан результат представителя эксперимент демонстрирует, что доксициклин вызванных Acf1 нокдаун привело к увеличение E4orf4-стимулированной клеточной гибели (рис. 6а). Это увеличение не в результате увеличения E4orf4 уровней (рис. 6В). Кроме того, восстановление Acf1 на доксициклин клетках в уменьшил увеличение E4orf4 токсичность по отношению к уровням наблюдался в неиндуцированных клетки (рис. 6).
Рисунок 1. Карта pSuperior.neo + GFP плазмиды. На карте показаны тетрациклин-индуцируемых H1 промоутер вождения ShRNA выражения и промотор PGK вождения выражением нео-гибридный белок GFP. Карта была адаптирована из руководства OligoEngine pSuperior.
Рисунок 2. Определение неомицин-устойчивых колоний. Изображения пластину, содержащую колонии (А) и одну колонию (B) показаны. В колониях были получены путем культивирования клеток в течение 14 дней в селективной среде, содержащей неомицин.
Рисунок 3. Экспертиза нокдаун эффективности в отдельных колониях. Клетки несколько колоний выбран в присутствии неомицин высевают в двух экземплярах скважин. Один хорошо каждого образца было вызвано доксициклин (+) и одна скважина осталась необработанной (-). Белки были извлечены 72 часа после индукции и хроматографируют на SDS-PAGE. Вестерн-блот был запятнан последовательно с антителами к SNF2h и альфа-тубулина (выступающей в качестве управления загрузкой) и показывает SNF2h уровней в индуцированной и контрольными клетками.
Рисунок 4. Планирование типичный нокдаун-DAPI анализа эксперимента. Последовательные этапы эксперимента показали, в том числе доксициклин лечение для достижения Acf1 или SNF2h нокдаун, трансфекции для восстановления Acf1 или SNF2h выражения или ввести EMPти вектора и ввести E4orf4 или его соответствующей пустого вектора в клетки, и анализ результатов. Доксициклин обработанные пластины показаны красным (DOX) и контроля пластин отмечены синим цветом. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 5. Обнаружение E4orf4-индуцированной гибели клеток с помощью анализа DAPI. Клетки, которые подверглись различные процедуры, описанные на рисунке 4 фиксировали и окрашивали с E4orf4-специфических антител и DAPI для визуализации ядер трансфицированных клеток. Данная картина была взята из образца, содержащего E4orf4 и белка GFP управления. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) объединенного изображения. Белые стрелки знак GFP-и E4orf4-трансфицированных клеток, содержащих ядра с апоптоза морфологией. Красные стрелкиотметить ядра неправильной формы, которые не учитываются в качестве апоптоза ядер. Звездочки знак ядер митотического или ядер, которые просто разделились.
Рисунок 6. Acf1 нокдаун повышает E4orf4-индуцированной гибели клеток. (А) Клетки из T-REX-293, полученных клеточных линий выразив Acf1-ShRNA от тетрациклина индуцируемый промотор был индуцирован с доксициклином (+ Dox) или не лечить (-Dox). Три дня спустя, клетки трансфицировали плазмидами, выразив E4orf4 (+ E4orf4) или пустой вектор (-E4orf4) вместе с пустого вектора или плазмиды выражения GFP с метками Acf1, которая была оказана устойчивы к ShRNA путем введения молчать мутации. Клетки были установлены двадцать четыре часа после трансфекции и окрашивали антителами к E4orf4 и с DAPI. Индукции гибели клеток измеряли с помощью анализа DAPI описано выше, и процент выводаF трансфицированных клеток со сгущенным или фрагментированных ядер была определена. Представитель эксперимент с трех повторов показано, и погрешности представляют собой стандартное отклонение. (B) Клетки из параллельных пластин были собраны для Вестерн-блоттинга. Пятно окрашивали антителами к E4orf4, GFP, и Acf1. Эндогенных Acf1 и Acf1-GFP показано в двух отдельных панелей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Нокдаун конкретных экспрессии генов является важным подходом к изучению вклада белка регуляторные пути. С учредительных нокдаун выражение существенных генов негативно влияет на пролиферацию клеток, их изучение может потребовать либо переходного введение siRNAs или применения стабильных систем условного нокдаун. Генерация стабильных клеточных линий с мощностью лекарственно-индуцированной экспрессии shRNAs описанные здесь, обеспечивает преимущество по сравнению с переходной трансфекции, которая не может быть эффективным в...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана (в части) ИЗРАИЛЬ научного фонда (грант 399/11), в Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) в рамках германо-израильских проектов сотрудничества (DIP), и Институтом Раппапорт семьи по исследованиям в области Медицинских Наук.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (по желанию) |
| Высокий уровень глюкозы в DMEM | Gibco | 41965 | |
| Тет системы утвержденных FBS | Clontech | 631106 | |
| L-глютамин | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0,25% трипсина-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-Rex-293 клеток | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Сигма | A1720 | |
| бластицидин | InvitРоген | R210-01 | |
| pSuperior.neo + GFP плазмиды | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus трансфекции | 101-40 | |
| доксициклин | Сигма | D9891 | |
| параформальдегид | Электрон наук микроскопии | 15710 | |
| 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) | Сигма | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
Ссылки
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer. 2, 243-247 (2002).
- Czauderna, F. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic acids research. 31, e127(2003).
- Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic acids research. 31, e77(2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Journal of. 77, 8957-8961 (2003).
- Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).
- Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway. J. Virol. 75, 789-798 (2001).
- Shtrichman, R., Kleinberger, T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).
- Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba. Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).
- Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).
- Li, S. The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells. Oncogene. 28, 390-400 (2009).
- Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -C., Robert, A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases. J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
