Внематочная выражение одна техника для выяснения роли микроРНК в развитии мозга. Тем не менее, ориентированные на конкретные области применения в ово электропорации является сложной задачей. Здесь мы покажем это эффективный способ выборочно электропорации брюшной и спинной среднего мозга регионы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В ово выражения микроРНК в Брюшной Chick мозга
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Некодирующих РНК дополнительные игроки в регуляции экспрессии генов. Целевые в ово электропорации конкретных областях предоставляет уникальный инструмент для пространственного и временного контроля эктопической экспрессии микроРНК. Тем не менее, брюшные структуры мозга, как брюшной мозга довольно трудно достичь за любые манипуляции. Здесь мы демонстрируем эффективный способ электропорации микроРНК в брюшной мозга с помощью тонких платиновых электродов. Этот метод предлагает надежный способ трансфекции конкретных областей мозга и полезный инструмент для естественных условиях исследования в.
Введение
Признание малых некодирующих РНК в качестве дополнительных игроков для экспрессии генов запустила новый сложность геномной регуляции программирования / генов. Различные виды некодирующих РНК имеют функциональное значение в нервных клетках, в том числе малого некодирующих РНК 1-4. Микро РНК (микроРНК или микроРНК), например отчетливые и меняющиеся профили экспрессии в развивающихся мозгах 5. Целевые в ово электропорации куриных эмбрионов обеспечивает уникальная возможность для временной и пространственной контроля экспрессии генов и молчания во время развития.
Это видео демонстрирует различные этапы выполнени....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Требования к In ово электропорации
- Подготовка векторную конструкцию: Мир смыслового и антисмыслового праймеров были разработаны после инструкциями Ambion, отжигают и лигируют в ApaI / EcoRI переваривается pSilencer U6.1 вектор. После успешной трансформации одной из полученных клонов выращивают и pSilencer плазмиду выделяли методом щелочного лизиса с использованием миди подготовка комплекта Quiagen.
- Электроды: Электроды могут быть куплены или легко быть построены 13. Мы используем самодельные электроды платиновой проволоки (Φ = 0,2, 0,25 или 0,5 мм в диаметре) или в некоторых случаях даже ме....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Степень среднего мозга области трансфицированных микроРНК виден через экспрессии GFP от репортерного вектора вводимого вместе с экспрессирующим вектором Mir (рис. 2). Использование платиновые электроды с диаметром 0,5 мм и расположены параллельно оси AP среднего мозга приводит обычно к трансфекции широкой области вдоль DV-и AP-оси заднего мозга, в том числе, среднего мозга и иногда промежуточного мозга (Фигуры 2А и В). Размер электродов приводит в широком электрическим полем, приложенны.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Это видео демонстрирует эффективный метод для трансфекции плазмиды в нейроэпителиальных клетках конкретных областях куриного мозга. Прямоугольные электрические импульсы низкого напряжения можно ввести ДНК в клетках кур нервной трубки в ово 6,16. Однако точность таргетинга ДНК часто затруднено из-за широкого электрического поля, которая поднимается через относительно больших электродов (Φ = 0,5 мм). Мы пытались решить эту проблему с помощью электродов меньшие в диаметре, следуя рекомендациям Momose
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы признаем, К. Mikic, кто внес вклад в начальной фазе этого фильма и М. Николеску для картины микроРНК. С. Хубер была поддержана общение в IZKF от Universtitätsklinikum Тюбинген, А. Alwin Прем Ананд по программе состоянием на Universtitätsklinikum Тюбингене.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Капилляры из боросилликатного стекла | Hartenstein | Модель: 0,9 мм | |
| Микрокапиллярный пуллер | WPI, Берлин | Модель: Электропоратор Pul1-E | |
| Intracel | Модель: Стереомикроскоп TSSIC | ||
| - флуоресцентный | LEICA | Модель: MZFLIII | |
| Стереомикроскоп | Zeiss | Модель: Stemi | |
| Фотоаппарат и программное обеспечение | Zeiss | : Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
Ссылки
- Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
- Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
