Внематочная выражение одна техника для выяснения роли микроРНК в развитии мозга. Тем не менее, ориентированные на конкретные области применения в ово электропорации является сложной задачей. Здесь мы покажем это эффективный способ выборочно электропорации брюшной и спинной среднего мозга регионы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В ово выражения микроРНК в Брюшной Chick мозга
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Некодирующих РНК дополнительные игроки в регуляции экспрессии генов. Целевые в ово электропорации конкретных областях предоставляет уникальный инструмент для пространственного и временного контроля эктопической экспрессии микроРНК. Тем не менее, брюшные структуры мозга, как брюшной мозга довольно трудно достичь за любые манипуляции. Здесь мы демонстрируем эффективный способ электропорации микроРНК в брюшной мозга с помощью тонких платиновых электродов. Этот метод предлагает надежный способ трансфекции конкретных областей мозга и полезный инструмент для естественных условиях исследования в.
Введение
Признание малых некодирующих РНК в качестве дополнительных игроков для экспрессии генов запустила новый сложность геномной регуляции программирования / генов. Различные виды некодирующих РНК имеют функциональное значение в нервных клетках, в том числе малого некодирующих РНК 1-4. Микро РНК (микроРНК или микроРНК), например отчетливые и меняющиеся профили экспрессии в развивающихся мозгах 5. Целевые в ово электропорации куриных эмбрионов обеспечивает уникальная возможность для временной и пространственной контроля экспрессии генов и молчания во время развития.
Это видео демонстрирует различные этапы выполнения эктопическая экспрессия Мирс в конкретных областях куриного мозга использования в ово электропорации 6-10. Для обеспечения длительный эффект этих маленьких некодирующих РНК в клетках, последовательность ДНК Мирс, были клонированы в моно-или би-cistronic векторов. Ибо в ово электропорации, микроРНК, содержащий VEctor вводят в среднего мозга нервной трубки, подвергая эмбрион после внесения небольшое окно в яичной скорлупы. Для трансфекции конкретных областей среднего мозга небольшом плюсе (анод) и минус (катод) платиновые электроды размещаются на определенных позициях. Для среднего мозга вентральной трансфекции, анод находится под левой вентральной мозга и катодом над правой половине мозга перед нанесением ток. Отверстие в скорлупе закрывают лентой и эмбрионы инкубировали в течение тех пор, пока требуется для любого анализа. Этот метод первоначально был описан Мурамацу соавт. 6 и улучшить Momose соавт. 8 для конкретной области трансфекции.
Принципиальная Обзор.
- Эмбрион в яйце подвергается путем разрезания небольшое окно в гоэ яичной скорлупы.
- Растворенный вектор (ы) вводят в мозге с помощью микро капилляр.
- Два электрода - размещенные параллельно или под и над эмбриона - генерировать импульсного электрического поля.
- Электрическое поле временно создает поры в клеточной мембране, которые облегчают вход в клетку отрицательно заряженным ДНК (или РНК) привлек к аноду 11,12.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Требования к In ово электропорации
- Подготовка векторную конструкцию: Мир смыслового и антисмыслового праймеров были разработаны после инструкциями Ambion, отжигают и лигируют в ApaI / EcoRI переваривается pSilencer U6.1 вектор. После успешной трансформации одной из полученных клонов выращивают и pSilencer плазмиду выделяли методом щелочного лизиса с использованием миди подготовка комплекта Quiagen.
- Электроды: Электроды могут быть куплены или легко быть построены 13. Мы используем самодельные электроды платиновой проволоки (Φ = 0,2, 0,25 или 0,5 мм в диаметре) или в некоторых случаях даже меньше вольфрамовой проволоки электрод (Φ = 0,1 мм) 8 в зависимости от области мы хотим электропорации. Чтобы избежать подгорания ткани мы используем, как правило, ближе к ткани тонкой электроды. Для широкого электропорации мозга мы используем 0,5 мм платиновые провода припаяны к латунь / нержавеющая сталь трубчатыевал и крепится к держателю электрода с расстоянием 3-5 мм (рис. 1). Для электропорации конкретные области, мы используем 0,25 мм платиновой проволоки аноды и 0,2 мм провод платины или 0,1 мм вольфрам для катода с расстоянии около 1 мм или менее.
- Решения: имеют следующие решения готовы:
- Автоклавного курица Рингер, рН 7,5 (9,0 г NaCl, 0,42 г KCl, 0,24 г CaCl2, растворить в 1 л дистиллированной воды).
- PBS (8 г NaCl, 0,2 г KCl, 0,24 г KH 2 PO 4, 1,44 г Na 2 HPO 4, растворяют в 1 л дистиллированной H 2 O).
- Быстрый зеленый: решение складе 10 мг / мл дистиллированной H 2 O
- Медленный высыхание чернил (менее шеллак и, следовательно, менее отравления для эмбриона). Примечание: синий дихроичный фильтр крепится к волоконно-оптической лампы, как описано в Canto-Солер и Адлера 14 усиливает контраст и может устранить необходимость придать чернил.
Рисунок 1. Принципиальная схема электродов и держателя электрода. (A, B, C) Платина провод припаян к одной стороне нержавеющей стали трубчатом валу. Отверстие было просверлено в другой стороне трубчатого вала таким образом, что штырьковые вилки может вместить в (A) Красные и синие цветные провода были соединены с контактными штекерами. На противоположном конце провода был установлен на банановых разъемов, которые работают с электрическими розетками из электропоратора. (А, С) платиновая проволока была согнута в ангела 90 °. Слой лака для ногтей изолировали над изгибом вала.
2. Подготовка Непосредственно до этого в ово электропорации
- Подготовьте следующие материалы:
- Развести Ink с куриным Ringer 1:06, добавить к антибиотикам противогрибкового раствора (100x от GIBCо) 1:100.
- Подготовка вектор решение: 1-2 мкг / мкл на специфической ДНК в H 2 O, дополненной Быстрый зеленый (1:20).
- Стерилизовать щипцов, ножницы, вольфрамовой иглы и электродов с 70% этанола.
- Потяните микропипетки для инъекций нуклеиновой кислоты из боросиликатного стекла капилляров (длина до наружного диаметра: 100 мм х 0,9 мм). Мы используем простой съемник ПУЛ-1 (WPI, Берлин) с настройками, показанными в таблице 1.
- Установка параметров электропоратора, как показано в таблице 2.
| Параметры | Величины |
| Тепло | 350 |
| Тянуть | 100 |
| Скорость | 50 |
| Задержка | 200 |
Таблица 1. Настройки для ПУЛ-1
| Параметры | Величины |
| Частота | 50 Гц |
| Задержка | 20 - 50 мс * |
| Ширина | 20 мс |
| Напряжение | 8-25 V * |
| Импульс | 3 - 5 раз |
| * В зависимости от диаметра электрода и расстояния. Пожалуйстапринять это во внимание при изменении одного из параметров. | |
Таблица 2. Установки для Pulse Стимулятор
- Подготовка куриного эмбриона для электропорации:
- Выдержите оплодотворенные куриные яйца на их длинной стороне при 37 ° С с 65%-ной влажности на 39 часа, чтобы приобрести эмбрионов между Гамбургер & Hamilton (HH) ступеней 15 9-11. Эмбрион оседает в самой верхней части яйца, так что вы должны пометить его с карандашом линии.
- Лечить яйца с 70% этанола.
- Пирс яйцо на его широкой стороне, где воздушная полость должна быть.
- Удалить 1-2 мл яичного белка. Это будет отделить зародыш от скорлупы.
- Виолончель-лента яичной скорлупы, чтобы избежать осколков снарядов, падающих на эмбриона. Используйте ножницы, чтобы вырезать небольшое окно в яичной скорлупы вокруг карандашом линию.
- Введите немного чернилпод площадью Opaca визуализации эмбриона.
- Сделайте надрез в желточной оболочки с заостренным вольфрамовой иглы достижения лучшего доступа к эмбриона для инъекций нуклеиновых кислот и электропорации.
3. Электропорация и Инкубационный
- Добавить несколько капель раствора теплый Рингера на эмбрионах. Это позволит снизить эмбрионов, предотвращения перегрева, торчащие из электродов в ткани и обеспечить среду для тока между двумя электродами.
- Введите вектор решение в просвет нервной трубки на уровне среднего мозга. Если ваш вектор экспрессии ДНК не содержит ген-репортер (например EGFP), добавить немного ниже концентрированный гена вектор репортера (1 мкг / мкл микроРНК, выразив вектор до 0,9 мкг / мкл гена вектора репортера) для раствора ДНК. Это будет гарантировать, что вы признаете трансфицированные клетки позже 8. Мы используем так называемый pCAX вектор, доброе подарок сюдам С. Круль 13.
- Для широкого трансфекции среднего мозга, поместите электроды слева и справа от эмбриона на высоте среднего мозга. Расстояние между электродами должно быть около 3-5 мм. Остальные настройки 15V, 20 мс импульсы и 50 мс задержка HH 10. Изменение положения двумя электродами немного вдоль спинно-вентральной (DV) оси среднего мозга обеспечивает более широкий трансфекцию клеток ось Д.В. трансфекции.
- Для вентральной трансфекции, добавьте немного Ringer поднять голову от желтка мембраны и установить анод под вентральной мозга. Если головка не поднимается нажать электрод под мембраной, которая отделяет желток и эмбрион, чтобы избежать подгорания нервной трубки. Катод должен быть помещен выше среднего мозга спинно-боковом направлении, противоположном анода. Не прикасайтесь к нервной трубки. Мы трансфекции левую вентральной половины мозга, чтобы избежать трудностей с развитием сердца. Расстояние между электродамисоставляет около 1-0,5 мм, остальные настроек 10В, 20 мсек ширина и 50 мс задержки.
- Применить еще одну каплю физиологического раствора на вершине эмбрионов, чтобы охладить его и удалить пузырьки воздуха.
- Уплотнение яйца с лентой и инкубировать в течение не менее 4 часов; минимальное время, необходимое для вектора экспрессии.
4. Фиксация куриных эмбрионах
- Удалить эмбрионов из яиц.
- Чистые эмбрионы под стереомикроскопом и оценки степени трансфекции с флуоресцентным стереомикроскопом.
- Fix эмбрионов в течение ночи в 4% PFA при 4 ° С. Продолжайте секционирования и / или окрашивание (в гибридизация, иммуногистохимии) для анализа изменений в трансфицированной области.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Степень среднего мозга области трансфицированных микроРНК виден через экспрессии GFP от репортерного вектора вводимого вместе с экспрессирующим вектором Mir (рис. 2). Использование платиновые электроды с диаметром 0,5 мм и расположены параллельно оси AP среднего мозга приводит обычно к трансфекции широкой области вдоль DV-и AP-оси заднего мозга, в том числе, среднего мозга и иногда промежуточного мозга (Фигуры 2А и В). Размер электродов приводит в широком электрическим полем, приложенны...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Это видео демонстрирует эффективный метод для трансфекции плазмиды в нейроэпителиальных клетках конкретных областях куриного мозга. Прямоугольные электрические импульсы низкого напряжения можно ввести ДНК в клетках кур нервной трубки в ово 6,16. Однако точность таргетинга ДНК часто затруднено из-за широкого электрического поля, которая поднимается через относительно больших электродов (Φ = 0,5 мм). Мы пытались решить эту проблему с помощью электродов меньшие в диаметре, следуя рекомендациям Momose
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы признаем, К. Mikic, кто внес вклад в начальной фазе этого фильма и М. Николеску для картины микроРНК. С. Хубер была поддержана общение в IZKF от Universtitätsklinikum Тюбинген, А. Alwin Прем Ананд по программе состоянием на Universtitätsklinikum Тюбингене.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Капилляры из боросилликатного стекла | Hartenstein | Модель: 0,9 мм | |
| Микрокапиллярный пуллер | WPI, Берлин | Модель: Электропоратор Pul1-E | |
| Intracel | Модель: Стереомикроскоп TSSIC | ||
| - флуоресцентный | LEICA | Модель: MZFLIII | |
| Стереомикроскоп | Zeiss | Модель: Stemi | |
| Фотоаппарат и программное обеспечение | Zeiss | : Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
Ссылки
- Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
- Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).
- Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).
- Riedmann, L. T., Schwentner, R. miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters. RNA Biol. 7, 133-139 (2010).
- Coolen, M., Bally-Cuif, L. MicroRNAs in brain development and physiology. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Nakamura, H., Watanabe, Y. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).
- Potter, H., Weir, L., Leder, P. Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Canto-Soler, M. V., Adler, R. Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window. Developmental biology. , 294-2119 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).
- Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review). Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).
- Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development. BMC Dev Biol. 12, 10(2012).
- De Pietri Tonelli, D., et al. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
