Анализ функций генов и визуализации реснички, созданного потока жидкости в Vesicle Купфера

Summary

Реснички генерируемых потоков жидкости в Vesicle Купфера (KV) управляет левой-правой паттерна рыбок данио эмбрионов. Здесь мы описываем технику, чтобы модулировать функции гена в частности в КВ клеток. Кроме того, мы показываем, как доставить флуоресцентные шарики в KV для визуализации потока жидкости.

Abstract

Внутренние органы, такие как сердце, мозг и кишечник, развивают лево-правую (LR) асимметрию, которая имеет решающее значение для их нормального функционирования¹. Подвижные реснички участвуют в установлении LR-асимметрии у эмбрионов позвоночных, включая мышь, лягушку и рыбок данио^2-6. Эти «реснички LR» генерируют асимметричный поток жидкости, который необходим для запуска консервативного асимметричного узлового (суперсемейство TGF-β) в мезодерме левой латеральной пластины, который, как полагают, обеспечивает информацию о паттерне LR для^{развивающихся органов.} Таким образом, чтобы понять механизмы, лежащие в основе структурирования LR, важно идентифицировать гены, которые регулируют организацию реснитчатых клеток LR, подвижность и длину ресничек LR, а также их способность генерировать устойчивый асимметричный поток.

В эмбрионе данио-рерио, реснички LR расположены в везикуле Купфера (KV)^2,4,5. KV состоит из одного слоя моноситилизованных эпителиальных клеток, которые окружают заполненный жидкостью просвет. Картирование судьбы показало, что KV происходит от группы из ~20-30 клеток, известных как дорсальные клетки-предшественники (DFC), которые мигрируют по дорсальному краю бластодермы во время стадии эпиболии^8,9. На ранних стадиях сомитов DFC кластеризуются и дифференцируются в реснитчатые эпителиальные клетки, образуя KV в хвостовой початке эмбриона^10,11. Возможность идентификации и отслеживания DFC в сочетании с оптической прозрачностью и быстрым развитием эмбриона данио-рерио делают рыбку данио-рерио KV отличной модельной системой для изучения реснитчатых клеток LR.

Интересно, что предшественники клеточной линии DFC/KV сохраняют цитоплазматические мостики между желточными клетками до 4 часов после оплодотворения (hpf), в то время как цитоплазматические мостики между желточной клеткой и другими эмбриональными клетками закрываются после 2 hpf⁸. Используя преимущества этих цитоплазматических мостиков, мы разработали стратегию поэтапной инъекции для доставки морфолигонуклеотидов (MO) исключительно в DFC и подавления функции целевого гена в^{этих клетках}. Этот метод создает химерные эмбрионы, у которых функция гена снижена в линии DFC/KV, развивающейся в контексте эмбриона дикого типа. Для анализа несимметричного течения жидкости в KV мы вводим флуоресцентные микрошарики в просвет KV и регистрируем движение шариков с помощью видеомикроскопии². Поток жидкости легко визуализируется и может быть количественно определен путем отслеживания смещения валика с течением времени.

Здесь, используя метод нокдауна генов, ориентированных на стадию, и введение флуоресцентных микрогранул в KV для визуализации потока, мы представляем протокол, который обеспечивает эффективный подход к характеристике роли конкретного гена во время развития и функционирования KV.

Protocol

Обзор этапа конкретным Инъекции эмбрионов данио рерио

Антисмысловые морфолино олигонуклеотидов (MO), которые связываются с целевой мРНК и нарушают экспрессию белка из этой стенограммы, которые широко используются в нокдаун гена (с потерей функции) исследования на рыбках данио ^13,14. Гена Tools, LLC предлагает МО, помеченные как карбоксифлуоресцеина (испускает зеленая флуоресценция) или lissamine (испускает красная флуоресценция) для обнаружения MO вводят в эмбрионы с помощью флуоресцентного микроскопа. Вводя MO в клетку желток на разных стадиях развития рыбок данио, можно поставить MO конкретные отделения зародыша (рис. 1А-F). MO вводят в желтке между 1-4 ячейки этапа (0-1 HPF) входит во все эмбриональные клетки (рис. 1А, D, D ') по связям с желтком, которые сохраняются до 32-клеточной стадии ^{от 15} до содействия глобальному нокдаун. MO вводят в желтке во время midblastула этапов (2.5-3 HPF) может войти в прародителями DFCs (рис. 1B, E, E '), вероятно, через цитоплазматические мостики ⁸ и функция нокдаун гена в частности, в DFC / KV клеточной линии ^12, без ввода большинства других эмбриональных клеточных поколений . В качестве важного контроля для проверки функции гена требуется DFC / KV или же в желтке ^12,16, это также можно ограничить MO к ячейке желток, вводя между куполом-30% эпиболии стадии (~ 4,5 HPF) после Все цитоплазматических мосты были закрыты (рис. 1С, F, F '). Эти инъекции были использованы в комбинации для анализа функции генов в DFC / KV клеток ^17-24. Для оценки течения жидкости в КВ, люминесцентные микрошарики вводят в просвет между KV 6-10 сомитов этапов (12-14 HPF), а затем сразу отображаемого использованием видеомикроскопии (рис. 1G-J). Микрошарики доступны, которые излучают красный или зеленый цвет флуоресценции (или оба), так что можно использовать различныеканалы изображений флуоресцентных микросфер и МО.

1. Стадия конкретных Инъекции Morpholinos (MO)

Инъекции МО в эмбрионы рыбок данио было продемонстрировано ранее ^25,26. Здесь мы кратко опишем стадию конкретных MO инъекций. После всех инъекций, эмбрионы переносят в чашку Петри и инкубировали при 28,5 ° C.

1. Глобальная инъекции MO: Сбор эмбрионов сразу после оплодотворения и загружать их в инъекции пластины. Загрузите флуоресцентные MO в капиллярных игл и установить иглу на микроинъектор (например, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-инжектор). Перерыв кончик иглы и настроить впрыск параметров (давления и / или времени), чтобы создать инъекции каплей, которая имеет объем 1 NL, как описано ^25,26. Использование рассекает стереомикроскопа, вводят 1 NL МО в желток (рис. 1А) ≥ 50 эмбрионов в эксперименте. Работают быстро завершить инъекций по 4-элементной оленяе.
2. DFC-целевых MO инъекций: Сбор эмбрионов сразу после оплодотворения и инкубировать при 28,5 ° C. Когда эмбрионы достигли 256-клеточной стадии (~ 2,5 HPF), быстро загружать их в инъекции пластины, а затем вводят 1 NL люминесцентных MO в желтке ≥ 100 эмбрионов между 256-ячейки и 1000-клеточной стадии (Рис. 1В).
3. Желток-целевых MO инъекций: Сбор эмбрионов сразу после оплодотворения и инкубируют при 28,5 ° C. На куполе этапе (~ 4 HPF), загрузить эмбрионов в инъекции пластины, а затем вводят 1 NL люминесцентных MO в желтке ≥ 100 эмбрионов между куполом и 30% эпиболии этапов (рис. 1С).

2. Выбор Injected эмбрионов для анализа

1. Когда MO вводят эмбрионы достигают 75%-эпиболии этапе (8 HPF), удалить неоплодотворенные и мертвые эмбрионы, а затем экран живых зародышах под флуоресцентным микроскопом рассечение для распределения флуоресцентного МО. Тогда аллоW выбран эмбрионы развиваются в 28,5 ° C.
   1. Для глобальных MO инъекций, выберите эмбрионов, которые флуоресценции равномерно распределены в течение всего эмбриональные клетки (рис. 1D; рис. 2А).
   2. Для DFC-целевых MO инъекций, выберите эмбрионы, в которых флуоресцентные MO была распространяется по всей желтком и, похоже, концентрируется на верхний край бластодерма (DFCs) (рис. 1E; рис. 2В). На данном этапе, это может быть трудно представить себе флуоресцентные DFCs из-за яркой флуоресценции в базовой желток. Позаботьтесь, чтобы исключить эмбрионов, в котором флуоресцентный MO включил в эмбриональных клетках, кроме DFCs или остается агрегируются в месте инъекции (рис. 2D).
   3. Для желтка целевых MO инъекций, выберите эмбрионы, в которых MO флуоресценции равномерно распределены по всей желток и не наблюдается ни в эмбриональные клетки (рис. 1F, рисунок 2С). Опять же, удаления эмбриона, в котором флуоресцентный MO остаетсяагрегируются в месте инъекции.
2. Между 2-4-сомитов стадии (~ 11 HPF), экран эмбрионов во второй раз под флуоресцентным микроскопом использованием большем увеличении. Тогда позвольте выбранные эмбрионы развиваются в 28,5 ° C.
   1. Для глобальных инъекции MO, обеспечить выбранный эмбрионы имеют MO флуоресценции равномерно распределены в КВ и все эмбриональные клетки (рис. 1D '; Рисунок 2E).
   2. Для DFC-целевых MO инъекции, тщательно выбрать эмбрионы, которые имеют MO флуоресценции только в КВ клетки и желток (рис. 1E). Трансгенные эмбрионы, которые выражают GFP в клетках КВ, таких как Tg (Dusp6: d2EGFP) ^27, может помочь в идентификации эмбрионов, в которых MO был успешно доставлен на КВ клеток (рис. 2F). Откажитесь эмбрионов с MO флуоресценции в эмбриональных клеток других, что клетки КВ.
   3. Для желтка целевых MO инъекций, выберите эмбрионы, которые имеют MO флуоресценции исключительно в желтке (рис. 1F ": Рисунок2G).

3. Монтаж эмбрионов для анализа жидкости в KV

1. Для анализа асимметричных потоков жидкости в KV глобального MO, DFC-целевых MO или желтком целевых MO вводят эмбрионы, тщательно dechorionate ~ 20 эмбрионов между 4-6 сомитов стадии (~ 11-12 HPF) с острыми щипцами.
2. Подготовка 50 мл 1% низкой температурой плавления агарозы и аликвоты в 5 мл трубы, чтобы быть сохранены в виде жидкости в сухой ванне при температуре 42 ° C.
3. Передача одного эмбриона на предметное стекло депрессии (United Научно Supplies, Inc) и удалить столько воды, сколько возможно. Остановите эмбриона, добавив достаточно теплым 1% низкой температурой плавления агарозы, чтобы только покрыть эмбриона (слишком много агарозы может помешать последующей визуализации). Как агарозном затвердевает, используйте щипцы для размещения эмбриона, что KV вверх (вид сверху) (рис. 1H). Установить 10 эмбрионов с одним эмбрионом на слайд. Работают быстро, чтобы убедиться, что все инъекции в следующем шаге, комплeted к 10 сомитов (14 HPF).

4. Инъекции Флуоресцентные микрошариков в KV

1. Развести Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 мкм диаметром микросфер (Polysciences, Inc) до 1:50 в стерильной воде в 1,5 мл трубки Эппендорф.
2. Смешать 1:50 разбавление микрошарики тщательно, нажав на трубке и загрузить в 3 мкл капиллярной иглы. Используя тот же микроинъектор используется для МО инъекции (например, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-инжектор), разбить кончик иглы пинцетом и настроить впрыск настройки для создания минимально возможным (<0,5 п) раствор для инъекций капли.
3. Под микроскопом рассечение, выровнять иглу с просветом KV первого установлены эмбриона. Вставьте иглу в просвет и вводить небольшого объема (<0,5 NL) из бисера (рис. 1Г). Небольшой совет иглы и небольшой объем впрыска имеют решающее значение для предотвращения повреждения КВ.
4. Вводят всех подключенных эмбрионов. После того, как эмбрион был injecteд, капли стерильной воды могут быть добавлены в верхней части агарозы, чтобы предотвратить его от высыхания. В ходе инъекций, бусины часто препятствуют иглой отверстие. Это требует повторного нарушения иглы и регулировки объема впрыска путем модуляции давления или времени установки микроинъекции аппарата. Замените иглу, если она становится тупой достаточно, чтобы вызвать значительные повреждения во время инъекции.
5. Экран вводят эмбрионы для успешной доставки из бисера под флуоресцентным микроскопом вертикальный соединения (например, Zeiss AxioImager M1) с использованием 20X цель. Во-первых, определить KV структура не повреждена использованием светлого освещения (рис. 1J), а затем с помощью флуоресценции для наблюдения за бусы. Выберите эмбрионы, в которых присутствуют бисером и перемещение внутри просвета кВ. Откажитесь эмбрионов с повреждением KV или нет плавающей бусины в КВ. Это легко упустить кВ и доставить бусины в близлежащие ткани или основной желток. В случае неудачи горе аноТам 10 эмбрионов и повторите процедуру инъекции.

5. Визуализация и анализ течения жидкости KV

1. Для каждого выбранного эмбриона с бисером внутри К.В., добавить каплю стерильной воды, чтобы покрыть агарозы и затем наблюдать KV под флуоресцентным микроскопом вертикальный соединения с использованием 63x воды погружения цели (рис. 1Е). Кроме того, покровное может быть применена для использования с не-вода погружение целей и / или инвертированных микроскопов.
2. Используйте высокоскоростные камеры, установленной на микроскоп (например, Zeiss AxioCamHSm) для записи 10 секунд фильма. Запишите как бусины помощью флуоресцентного канала (около 70 кадров / сек) и просвета KV использованием светлого или дифференциальный интерференционный контраст (DIC) канала.
3. Чтобы визуализировать все движения шарика с течением времени, импортировать фильм флуоресцентные шарики в ImageJ программного обеспечения (скачать бесплатно на http://rsb.info.nih.gov/ij/ )ой создать максимальные проекции всех флуоресцентные сигналы в кино. Для выполнения максимальной проекции в ImageJ, нажмите кнопку "Изображение → стеки → Z проект". В "Z проекта" окна, проект все ломтики с проекционного типа "Max интенсивности". Это изображение можно наложить на изображение DIC КВ, в которой были обследованы бисера (рис. 3А-B).
4. Движения отдельных бусин можно отслеживать с помощью ImageJ. Плагин ("Manual слежения") может быть загружен в http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . Откройте флуоресцентные фильм бусины в ImageJ и запустить функцию ручного слежения. В окне Руководство слежения, установите флажок "Показать параметры" и входных параметров для "временных интервалов" и "X / Y калибровки". Ручной выбор бусин, которые остаются в фокальной плоскости фильм для ≥ 50 кадров, а затем отслеживать ≥ 5 бусин в зародыше. Путь и скорость каждого шарика порождается йэлектронной программного обеспечения (рис. 3 CD).

Results

Стадия конкретных MO инъекции обеспечить полезный подход для анализа функции генов в конкретных отделениях эмбриона. Рисунке 1 представлена ​​блок-схема инъекций стратегии, используемые для тестирования функции генов в DFC / KV клеток и, как ввести флуоресцентных бусин для визуализации потока жидкости В КВ. Распределение флуоресцентных МО в успешном этапе конкретных вводят эмбрионы схематически показано на рис 1D-F и в живых эмбрионов на рисунке 2. Неуд...

Discussion

Использование стадии конкретных инъекций целевой MO к DFC / KV клеточной линии является полезным подходом к изучению клеточных автономии функции гена и избежать плейотропным фенотипа, вызванные глобальным нокдаун гена. Тем не менее, эти инъекции могут быть технически сложным. Инъекции MO между 256-ячейки и 1000-клеточной стадии может привести три возможных исхода: 1) МО остается агрегируются в месте инъекции, 2) МО диффундирует во всем желток и входит DFC / KV клеток или 3), MO диффундирует во всем желток и входит DFC /...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название Реагенты / Материал	Компания	Номер по каталогу
Стандартное управление олиго-Lissamine отмеченных	Гена Tools, LLC
Пользовательские Rock2b морфолино олиго	Гена Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0,5 мкм Микросферы	Polysciences, Inc	24054