$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Внутренние органы, такие как сердце, мозг и кишечник, развивают лево-правую (LR) асимметрию, которая имеет решающее значение для их нормального функционирования1. Подвижные реснички участвуют в установлении LR-асимметрии у эмбрионов позвоночных, включая мышь, лягушку и рыбок данио2-6. Эти «реснички LR» генерируют асимметричный поток жидкости, который необходим для запуска консервативного асимметричного узлового (суперсемейство TGF-β) в мезодерме левой латеральной пластины, который, как полагают, обеспечивает информацию о паттерне LR дляразвивающихся органов. Таким образом, чтобы понять механизмы, лежащие в основе структурирования LR, важно идентифицировать гены, которые регулируют организацию реснитчатых клеток LR, подвижность и длину ресничек LR, а также их способность генерировать устойчивый асимметричный поток.
В эмбрионе данио-рерио, реснички LR расположены в везикуле Купфера (KV)2,4,5. KV состоит из одного слоя моноситилизованных эпителиальных клеток, которые окружают заполненный жидкостью просвет. Картирование судьбы показало, что KV происходит от группы из ~20-30 клеток, известных как дорсальные клетки-предшественники (DFC), которые мигрируют по дорсальному краю бластодермы во время стадии эпиболии8,9. На ранних стадиях сомитов DFC кластеризуются и дифференцируются в реснитчатые эпителиальные клетки, образуя KV в хвостовой початке эмбриона10,11. Возможность идентификации и отслеживания DFC в сочетании с оптической прозрачностью и быстрым развитием эмбриона данио-рерио делают рыбку данио-рерио KV отличной модельной системой для изучения реснитчатых клеток LR.
Интересно, что предшественники клеточной линии DFC/KV сохраняют цитоплазматические мостики между желточными клетками до 4 часов после оплодотворения (hpf), в то время как цитоплазматические мостики между желточной клеткой и другими эмбриональными клетками закрываются после 2 hpf8. Используя преимущества этих цитоплазматических мостиков, мы разработали стратегию поэтапной инъекции для доставки морфолигонуклеотидов (MO) исключительно в DFC и подавления функции целевого гена вэтих клетках. Этот метод создает химерные эмбрионы, у которых функция гена снижена в линии DFC/KV, развивающейся в контексте эмбриона дикого типа. Для анализа несимметричного течения жидкости в KV мы вводим флуоресцентные микрошарики в просвет KV и регистрируем движение шариков с помощью видеомикроскопии2. Поток жидкости легко визуализируется и может быть количественно определен путем отслеживания смещения валика с течением времени.
Здесь, используя метод нокдауна генов, ориентированных на стадию, и введение флуоресцентных микрогранул в KV для визуализации потока, мы представляем протокол, который обеспечивает эффективный подход к характеристике роли конкретного гена во время развития и функционирования KV.