Капиллярная сила Литография для сердечной тканевой инженерии

Summary

В этом протоколе мы демонстрируем изготовление биомиметических субстратов культуры сердечных клеток, изготовленных из двух различных полимерных материалов, с использованием капиллярной силовой литографии. Описанные методы обеспечивают масштабируемую, экономически эффективную технику для проектирования структуры и функции макроскопических тканей сердца для применения in vitro и in vivo.

Abstract

Сердечно-сосудистые заболевания остаются основной причиной смертности во всем мире ^1. Сердечная тканевой инженерии является многообещающим для доставки новаторских медицинских открытий с целями развития функциональных тканей для регенерации сердца, а также в пробирке скрининга. Тем не менее, возможность создания весьма четких моделей ткани сердца оказалось трудно. Внеклеточный матрикс сердца (ECM) представляет собой сложную структуру, состоящую из двух биохимических и биомеханических сигналов, начиная от микро-к нанометровом масштабе ^2. Часовой условия механической нагрузки и клеточной ECM взаимодействия недавно был признан жизненно важных компонентов в тканевой инженерии ^3-5 сердечной.

Большая часть сердечной ECM состоит из выровненных волокон коллагена с нано-диаметров, что значительно влияет архитектуру ткани и электромеханической связи ^2. К сожалению, несколько методов ВГАэ смогли имитировать организацию ECM волокон до нанометровом масштабе. Последние достижения в области методов нанофабрикации, однако, позволили проектирование и изготовление масштабируемых лесов, которые имитируют в естественных условиях структурных и подложки жесткости репликами ЕСМ в центре ^6-9.

Здесь мы представляем развитие двух воспроизводимым, экономически эффективной, и масштабируемые процессы Nanopatterning для функционального выравнивания сердечных клеток с использованием биосовместимого полимера поли (лактид-гликолида) (PLGA) ⁸ и полиуретана (PU) на основе полимера. Эти анизотропно nanofabricated субстраты (ANFS) имитировать основной ECM хорошо организованных, выстроенных тканей и может быть использован для исследования роли nanotopography на морфологию и функцию ^10-14 клеток.

Использование наноструктурированных (НП) мастер кремния в качестве шаблона, полиуретан-акриловой кислоты (PUA) форма сфабрикованы. Это PUA плесень затем используется для годовыхttern гидрогель PU или PLGA через УФ-помощь или растворителя-опосредованной капиллярной силы литографии (CFL), соответственно ^15,16. Вкратце, PU или PLGA форполимер является падение обойтись на покровным стеклом и форма PUA помещают сверху. Для УФ-помощь CFL, ПУ затем подвергают воздействию УФ-излучения (λ = 250-400 нм) для лечения. Для растворителя-опосредованной CFL, PLGA тиснением с использованием тепла (120 ° C) и давлении (100 кПа). После отверждения, форма PUA отслаивается, оставляя позади ANFS для культивирования клеток. Первичные клетки, такие как новорожденных крыс желудочковых миоцитов, а также плюрипотентных клеток кардиомиоцитов, полученных стволовых человека, может поддерживаться на ANFS ^2.

Introduction

Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной заболеваемости и смертности в мире и представить весомый социально-экономическое бремя на уже напряженным глобальной системы здравоохранения ^1,17. Сердечная тканевая инженерия имеет два различных целей: (1) регенерировать поврежденную миокарда после ишемической болезни или кардиомиопатии или (2) для создания высокой точностью модель сердца для экстракорпорального скрининга лекарственных средств или моделирования заболевания.

Сердце представляет собой сложный орган, который должен работать постоянно поставлять кровь к телу. Плотно упакованные ламинарные структуры....

Protocol

Все процедуры проводили при комнатной температуре (~ 23 ° C), если не указано иное.

1. Изготовление Силиконовой Master

1. Чистый кремниевой пластины со 100% этанола или ксилол и сушат в O ₂ / N ₂ газа.
2. Наведите кремниевую пластину в спин-машины для нанесения покрытий на скоростях вращения 2000-4000 оборотов в минуту для получения пленки толщиной 0,3-0,5 мкм.
3. Шаблон фоторезиста фильм с правильными размерами с помощью системы фотолитографии
4. Полностью погрузить узорчатые фоторезиста покрытием кремниевых пластин в соответствующем объеме фоторезиста развития решения.
5. Промыть....

Results

Рисунок 1 схематически обзор производственного процесса для двух методов изготовления. Из-за дифракции света, вызванного наноразмерных топографии, Nanopatterning должно привести к радужной поверхности до ANFS. Рисунок 2 изображает эту радужную поверхность на хорошо узорной 25 мм NP-PU покровного (рис. 2а) с длиной волны 800 нм выступом и пазом ширина (фиг. 2В). Радужный появление ANFS будет незначительно отличаться в зависимости от ширины выступом и паз.......

Discussion

Функционально зрелые сердечные ткани не хватает для как в естественных условиях и в приложениях пробирке тканевой инженерии сердечной. Методы Nanofabrication CFL, описанные здесь, надежные методы для достижения сотовой выравнивание и влиять функцию макроскопического тканей из-за масштабируемости системы. Большие площади могут быть легко рисунком и используются для культивирования клеток. Макроскопическая сотовой выравнивание имеет важное значение в тканевой инженерии сердечной того, чтобы созд.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Фибронектин	BD Biosciences	354008
NOA 76	Norland Products, Inc.	7606B
Промотор поверхностной адгезии (стеклянная грунтовка)	Minuta Tech
PUA	Minuta Tech	MINS-311RM
Мягкий резиновый ролик	Speedball
Силиконовые пластины	NOVA Электронные материалы	FA01-9900
Фоторезист	Шипли	SPRT510
Проявитель фоторезиста	Shipley	MF320
Система электронно-лучевой литографии	JEOL	JBX-9300FS
Система травления	Системы поверхностных технологий	NP10 8UJ
Система плазменного асшера	BMR Technology Co.	DSF-200
Система отверждения озоном	Minuta Tech	MT-UV-O- 08
Система термоядерного отверждения	Minuta	Tech MT-UV-A 11
NOA 83H	Norland Products, Inc.	8301
Прядильная машина для нанесения покрытий	Laurel Technology	WS-400-6NPP
Skyrol PET Film	SKC Co., Ltd.	23038-59-9
25 мм Стеклянные слайды	Corning	2948
Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеров	Dow Corning	6/5/2553
Поли(D,L-лактид-ко-гликолид)	Sigma-Aldrich	P2191-1G
Хлороформ	Sigma-Aldrich	372978-1L
500 г Вес	Global Insustrial	T9FB503120
Изопропиловый спирт	EMD Millipore	PX1835-2
Нагревательная пластина	Corning	PC-420D
Sonicator		Branson B2510MTH