Методическая статья

Одиночных молекул изображений регуляции генов В естественных условиях Использование Cotranslational активацию путем расщепления (CoTrAC)

DOI:

10.3791/50042

⸱

15 марта 2013 г.

 ,  , 
1Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences , 3Department of Physics, Jilin University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем метод флуоресцентной микроскопии, Co-трансляционной активации путем расщепления (CoTrAC), чтобы изображение производстве белковых молекул в живых клетках с одной молекулой точности без возмущающей функции белка. Этот метод был использован следовать стохастической динамики экспрессии фактора транскрипции, λ-репрессор CI 1.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем метод флуоресцентной микроскопии, Co-трансляционной активации путем расщепления (CoTrAC), чтобы изображение производстве белковых молекул в живых клетках с одной молекулой точности без возмущающей функции белка. Этот метод позволяет подсчитать количество молекул белка производится в одной ячейке в течение последовательного, пять минут времени Windows. Это требует флуоресцентного микроскопа с лазерным возбуждением плотности мощности ~ 0,5 до 1 кВт / см 2, что является достаточно чувствительным, чтобы обнаружить одну флуоресцентных молекул белков в живых клетках. Флуоресцентные репортера, используемые в этом методе состоит из трех частей: мембранной ориентации последовательности, быстро созревания, желтый флуоресцентный белок и последовательность протеазы признание. Репортер трансляционно слитый с N-конца белка. Клетки, выращенные на контролируемой температурой столик микроскопа. Каждые пять минут, флуоресцентных молекул внутри клеток загружаются (а затем и сотрудничествоunted путем анализа флуоресцентных изображений), а затем photobleached так, что только недавно переведенных белков учитываются в следующее измерение.

Флуоресценция изображения в результате этого метода могут быть проанализированы путем обнаружения флуоресцентных мест в каждом изображении, назначая их на отдельные клетки, а затем присвоение клетки к клетке линий. Количество белков, продуцируемых в течение временного окна в данной ячейке рассчитывается путем деления интегрированной интенсивности флуоресценции пятен на среднюю интенсивность одного флуоресцентных молекул. Мы использовали этот метод для измерения уровня экспрессии в диапазоне 0-45 молекул в одном 5 окон мин времени. Этот метод позволил нам измерить шум в выражении λ-репрессор CI, и имеет много других потенциальных приложений в системной биологии.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Рабочий процесс деформации инженерных

  1. Вставьте последовательности, кодирующие (а) мембрана-последовательность локализации, (б) быстрого созревания флуоресцентного белка (в) последовательность протеазы признания N-терминал и в рамке с белком интерес (например, фактор транскрипции). Мы использовали мембраны целевых TSR-Венера репортера 2 и плавленого его в последовательность протеазы признание Убиквитин (Ub) для подсчета количества выразил бактериофага λ-репрессор белковых молекул CI. Подробнее о том, как мы построили гибридный белок TSR-Венера-Ub-CI, заменив дикого типа CI кодирующей области и включение в конструкцию E. хромо....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Типичные результаты эксперимента CoTrAC отслеживания производства λ-репрессор CI показаны на рисунках 4 и 5. В этом эксперименте, 12 колоний были обследованы на каждые 5 мин. В каждый момент времени, в колонии впервые autofocused и централизованное в рамках изображений регионе. Далее, центрированной / целенаправленной позиции были сохранены и образ светлого был приобретен. Сцена была затем перемещаются на ~ 0,5 мкм вдоль оси перехода от светлого фокальной плоскости в пл.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод CoTrAC может быть обобщен для измерения производства других белков, где обычные N-или С-концевых флуоресцентного белка слияния могут привести к нарушению активности белка. Стратегия CoTrAC имеет три уникальных преимуществ по сравнению с существующими методами. Во-первых, со-поступательные слияния гарантирует, что одной молекулы флуоресцентного репортер производится для каждой молекулы белка, позволяющие точный подсчет белков производство в режиме реального времени. Во-вторых, мембрана-целевого репортер TSR-Венера .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У нас нет никаких раскрытий.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Плазмиды pCG001 выражения Ubp1 была любезно предоставлена ​​Rohan Baker на Джон Кертин Школа медицинских исследований. Эта работа финансировалась по март Dimes грант 1-2011 финансового года, марте Dimes Василия О'Коннор Автор научный сотрудник Award # 5-FY20 и NSF КАРЬЕРА награду 0746796.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
Агарозы (низкая температура плавления) Lonza 50100
Milli-Q H 2 O
5 × M9 соли Следующий рецепт описан в 9
20% глюкозы
MgSO 4
CaCl 2
50 × MEM аминокислотный раствор Invitrogen 11130-051
Контролем температуры ростаКамера
Переходник между ступенями 		Bioptechs FCS-2
Цель нагревателя Bioptechs Модель зависит от объектива микроскопа
Презентация Microaqueduct Bioptechs 130119-5
Micro очки крышкой VWR 40CIR-1 Может быть трудно источников; также доступны Bioptechs
Крышка стекла / слайд прокладкой Bioptechs FCS2 0,75 мм
Флуоресцентного микроскопа Различный Пример настройки: Coherent Innova 308C аргон-ионный лазер, Olympus IX-81 Микроскоп, Olympus PlanApo 100X NA 1,45 цели, Metamorph программного обеспечения Должно быть лазерного возбуждения, автоматизированные XYZ этапе автоматизации программного обеспечения, способного сценарию изображения и автофокусом, оптикой способны Resolvinг одного флуоресцентных белков
EM-CCD камеры Различный Пример настройки: Андор IXON DU-898 Должно быть достаточно низким уровнем шума для детектирования единичных флуоресцентных белков выше фона

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
  2. Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CoTrACE coli

Похожие статьи