Одиночных молекул изображений регуляции генов<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Использование Cotranslational активацию путем расщепления (CoTrAC)

Краткое содержание

Мы описываем метод флуоресцентной микроскопии, Co-трансляционной активации путем расщепления (CoTrAC), чтобы изображение производстве белковых молекул в живых клетках с одной молекулой точности без возмущающей функции белка. Этот метод был использован следовать стохастической динамики экспрессии фактора транскрипции, λ-репрессор CI ¹.

Аннотация

Мы описываем метод флуоресцентной микроскопии, Co-трансляционной активации путем расщепления (CoTrAC), чтобы изображение производстве белковых молекул в живых клетках с одной молекулой точности без возмущающей функции белка. Этот метод позволяет подсчитать количество молекул белка производится в одной ячейке в течение последовательного, пять минут времени Windows. Это требует флуоресцентного микроскопа с лазерным возбуждением плотности мощности ~ 0,5 до 1 кВт / см ^2, что является достаточно чувствительным, чтобы обнаружить одну флуоресцентных молекул белков в живых клетках. Флуоресцентные репортера, используемые в этом методе состоит из трех частей: мембранной ориентации последовательности, быстро созревания, желтый флуоресцентный белок и последовательность протеазы признание. Репортер трансляционно слитый с N-конца белка. Клетки, выращенные на контролируемой температурой столик микроскопа. Каждые пять минут, флуоресцентных молекул внутри клеток загружаются (а затем и сотрудничествоunted путем анализа флуоресцентных изображений), а затем photobleached так, что только недавно переведенных белков учитываются в следующее измерение.

Флуоресценция изображения в результате этого метода могут быть проанализированы путем обнаружения флуоресцентных мест в каждом изображении, назначая их на отдельные клетки, а затем присвоение клетки к клетке линий. Количество белков, продуцируемых в течение временного окна в данной ячейке рассчитывается путем деления интегрированной интенсивности флуоресценции пятен на среднюю интенсивность одного флуоресцентных молекул. Мы использовали этот метод для измерения уровня экспрессии в диапазоне 0-45 молекул в одном 5 окон мин времени. Этот метод позволил нам измерить шум в выражении λ-репрессор CI, и имеет много других потенциальных приложений в системной биологии.

Протокол

1. Рабочий процесс деформации инженерных

1. Вставьте последовательности, кодирующие (а) мембрана-последовательность локализации, (б) быстрого созревания флуоресцентного белка (в) последовательность протеазы признания N-терминал и в рамке с белком интерес (например, фактор транскрипции). Мы использовали мембраны целевых TSR-Венера репортера ² и плавленого его в последовательность протеазы признание Убиквитин (Ub) для подсчета количества выразил бактериофага λ-репрессор белковых молекул CI. Подробнее о том, как мы построили гибридный белок TSR-Венера-Ub-CI, заменив дикого типа CI кодирующей области и включение в конструкцию E. хромосомы кишечной использованием λ Красной рекомбинации ^3, подробно описаны в работе. 1.
2. Убедитесь, что все модификации путем секвенирования.
3. Преобразование плазмиды, кодирующей протеазу, характерные для признания последовательности использовали выше в штамм, выразив флуоресцентные репортер и белокВ поступательного синтеза. Мы использовали Ubp1 протеазы, которая расщепляет сразу после С-концевой остаток Убиквитин ^4.

2. Культура клеток и подготовка образцов

1. Выберите один E. Колония кишечной интерес с прожилками свежей пластинке агара в 1 мл M9 минимальной СМИ ⁵ дополнен 1X MEM аминокислот и соответствующих антибиотиков. Инкубировать в шейкере на желаемую температуру достаточно долго, чтобы достичь OD _600> 1,0 (оптической плотности при 600 нм).
2. Развести культуры в 1 мл свежей среды M9 с соответствующими антибиотиками, чтобы OD ₆₀₀ = 0,02. Инкубировать в шейкере при соответствующей температуре. Начальная плотность сотовой может быть увеличен в случае необходимости для низкотемпературного роста.
3. Когда OD ₆₀₀ = 0,2-0,3 (при 37 ° C с начальной клеточной культуры при OD ₆₀₀ = 0,02, это займет 3-4 часа), начать подготовку агарозном геле панели (шаг 3).
4. Клетки готовы для работы с изображениями, когда OD _{600 = 0,3-0,4.}
5. Передача 1 мл инкубировали культуры в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, центрифуги при 10000 х г в течение 1 мин в настольной микроцентрифуге.
6. Удалите супернатант и добавляют 1 мл свежей среды M9 и ресуспендируют осадок осторожно.
7. Центрифуга при 10000 х г в течение 1 мин.
8. Повторите шаг 1,6 и 1,7. Удалите супернатант.
9. Аккуратно ресуспендируют в 1 мл M9 СМИ. Клетки могут быть непосредственно использованы для визуализации микроскопа или разбавленный 10 - 100-кратный для обеспечения низкой плотности клеток для интервальной съемки изображений. Обратите внимание, что низкая плотность клетки имеют важное значение для расширенной визуализации интервальной съемки. Камера изображений (этап 4) запечатан в ходе эксперимента. В связи с экспоненциальным ростом клеток, высокой начальной концентрации клеток могут в значительной степени истощить кислорода в камере после длительного роста в гель площадку, снижение флуоресцентного белка и созревание влияет рост клеток.

3. Приготовьте раствор агарозы

1. Взвешивание 10-20 мглегкоплавкие температуры агарозы в 1,5 мл микроцентрифужных трубку.
2. Добавить соответствующий объем M9 минимальной среде без антибиотиков, чтобы сделать 3% агарозном решение.
3. Нагрейте раствор агарозы в течение 30 мин при 70 ° С, чтобы расплавить, переворачивая трубку для того, чтобы решение полностью расплавляется и однородной. Гель площадку можно заливать в этот момент (этап 4) или температура может быть снижена до 50 ° С и выдерживают в течение нескольких часов для последующего использования.

4. Подготовка Gel Pad по палате

1. Около 50 минут до визуализации, промыть Microaqueduct слайд с водой.
2. Промыть не убрал покровного стекла (с помощью строгих методов очистки, таких как описано в ⁶⁾ и Microaqueduct слайд стерильной водой и сухим путем продувки сжатым воздухом.
3. Установите резиновую прокладку на Microaqueduct слайд так, чтобы она покрывала входы и выходы на стекле стороны Microaqueduct слайд (это может быть модифицирован для применения вКакой носитель перфузии через образец). Применяют 50 мкл раствора агарозы (шаг 3) в центре Microaqueduct слайд.
4. Топ решение агарозы с очищенную, сухую стеклянную крышку.
5. Пусть решение агарозном стоять при комнатной температуре в течение 30 мин.
6. Между тем, подготовка ячейки образца (шаг 2).
7. Аккуратно снимите крышку стекла от верхней площадки геля. Добавить 1,0 мкл промытых культуры клеток в верхней части геля площадку. Подождите ~ 2 мин для культуры, поглощаемой гель площадку. Важно не ждать так долго, что overdries гель площадку, но достаточно долго, что клетки должным образом соблюдать гель площадку. Идеальное время ожидания зависит от температуры и влажности.
8. Во время ожидания, высушите другую предварительно очищенные стеклянной крышкой.
9. Крышка образца с новой стеклянной крышкой обеспечения того, чтобы стеклянной крышкой и Microaqueduct слайде хорошо выровнен.
10. Установите камеру с контролируемой температурой роста в соответствии с инструкциями производителя.Теперь она может быть использована для работы с изображениями на микроскопе (шаг 5).

5. Изображений и приобретение Timelapse фильмы

1. Включите лазерный микроскоп и в соответствии с инструкциями завода-изготовителя (например, лазерное, возможно, потребуется разогревается в течение ~ 0,5 часа до начала эксперимента).
2. Блокировка собрал камеру на сцену вставки на микроскопе. Установите температуру роста камеры и цели нагревателя при температуре 37 ° C или другого желаемого роста температуры.
3. Если изображение выше комнатной температуры, в центре внимания или гель площадку, как правило, значительно дрейфовать в течение ~ 15 мин после первой смены температуры. На практике, использовать это время, чтобы найти регионах, представляющих интерес и изменять изображения скрипты, необходимые для эксперимента.
4. Найти клетки под микроскопом и сохранить положение каждой ячейки после центрирования его в течение предопределенного и приведены в соответствие изображений регионе. Более одной клетке может быть отображена в каждом окне захвата изображений. Для интервальной съемки изображений по тлюбого поколения, убедитесь, что отображаемого клеток изначально отделены от других клеток по меньшей мере, несколько сотен мкм, так что другие колонии не войдете в области визуализации во время роста.
5. Регулировка интенсивности лазерного возбуждения, так что почти все флуоресцентные молекулы photobleach в течение 6 экспозиций (рис. 5).
6. Использование автоматизированных сценариев изображения / журнала, приобретение Timelapse данных с помощью алгоритма, описанного в экспериментальном рабочий процесс на рисунке 3.

Результаты

Типичные результаты эксперимента CoTrAC отслеживания производства λ-репрессор CI показаны на рисунках 4 и 5. В этом эксперименте, 12 колоний были обследованы на каждые 5 мин. В каждый момент времени, в колонии впервые autofocused и централизованное в рамках изображений регионе. Далее, центрированной / целенаправленной позиции были сохранены и образ светлого был приобретен. Сцена была затем перемещаются на ~ 0,5 мкм вдоль оси перехода от светлого фокальной плоскости в пл...

Обсуждение

Метод CoTrAC может быть обобщен для измерения производства других белков, где обычные N-или С-концевых флуоресцентного белка слияния могут привести к нарушению активности белка. Стратегия CoTrAC имеет три уникальных преимуществ по сравнению с существующими методами. Во-первых, со-поступательные слияния гарантирует, что одной молекулы флуоресцентного репортер производится для каждой молекулы белка, позволяющие точный подсчет белков производство в режиме реального времени. Во-вторых, мембрана-целевого репортер TSR-Венера ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Агарозы (низкая температура плавления)	Lonza	50100
Milli-Q H 2 O
5 × M9 соли			Следующий рецепт описан в 9
20% глюкозы
MgSO 4
CaCl 2
50 × MEM аминокислотный раствор	Invitrogen	11130-051
Контролем температуры ростаКамера Переходник между ступенями	Bioptechs	FCS-2
Цель нагревателя	Bioptechs	Модель зависит от объектива микроскопа
Презентация Microaqueduct	Bioptechs	130119-5
Micro очки крышкой	VWR	40CIR-1	Может быть трудно источников; также доступны Bioptechs
Крышка стекла / слайд прокладкой	Bioptechs	FCS2 0,75 мм
Флуоресцентного микроскопа	Различный	Пример настройки: Coherent Innova 308C аргон-ионный лазер, Olympus IX-81 Микроскоп, Olympus PlanApo 100X NA 1,45 цели, Metamorph программного обеспечения	Должно быть лазерного возбуждения, автоматизированные XYZ этапе автоматизации программного обеспечения, способного сценарию изображения и автофокусом, оптикой способны Resolvinг одного флуоресцентных белков
EM-CCD камеры	Различный	Пример настройки: Андор IXON DU-898	Должно быть достаточно низким уровнем шума для детектирования единичных флуоресцентных белков выше фона