Мы описываем надежного метода иммунопреципитации хроматина с использованием первичных Т-клеток. Метод основан на стандартных подходов, но использует конкретный набор условий и реагентов, которые повышают эффективность для ограниченного количества клеток. Важно отметить, что подробное описание фазовый анализ Данные представлены.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Эффективное использование Иммунопреципитация хроматина Ограничение количество биомассы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Иммунопреципитации хроматина (чип) является широко используемый метод определения взаимодействия различных белков с ДНК в хроматин живых клеток. Примеры включают последовательности конкретных ДНК-связывающий факторы транскрипции, гистонов и их различные состояния модификации, ферменты, такие как РНК-полимеразы и вспомогательные факторы, а также компоненты репарации ДНК. Несмотря на свою вездесущность, есть отсутствие соответствующий современным требованиям, подробные методологии и скамейки подготовке материалов и для точного анализа позволяет количественным показателям взаимодействия. Из-за этого недостатка информации, а также потому, что, как и любой иммунопреципитации условия должны быть повторно оптимизирован для новых наборов экспериментальных условий, чип анализа является восприимчивым к неточной или плохо количественные результаты.
Наш протокол, в конечном счете, полученных из семенной работы по транскрипционный фактор: 1,2 взаимодействий ДНК, но включает в себя ряд улучшений сенсибилизацииВиты и воспроизводимость для трудных для получения типов клеток. Протокол успешно используется 3,4, как с помощью количественной ПЦР количественно ДНК обогащения, или с использованием полуколичественного варианта ниже протокола.
Этот количественный анализ ПЦР усиленный материал выполняется вычислительно, и представляет собой ограничивающий фактор в анализе. Важные элементы управления и другие соображения включают в себя использование изотипу антител, а также оценки контрольной области геномной ДНК, таких как межгенной области предсказал не быть связанными белка в исследовании (или ожидается не показать изменения под экспериментальных условий). Кроме того, стандартная кривая исходного материала для каждого образца чип используется для получения абсолютных уровнях обогащения экспериментального материала. Использование стандартных кривых помогает принимать во внимание различия между наборов праймеров, независимо от того, насколько тщательно они предназначены, а также эффективностью отличаютсяences во всем диапазоне концентраций шаблон для одного набора праймеров. Наш протокол отличается от других, которые доступны в 5-8, что мы широко охватывали спустя, фазовый анализ.
Протокол
1. Выделение мышью селезенки Наивные CD4 Т-клеток
- Жертвоприношение мышь гуманным образом согласуется с Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) протоколов. Проанализируйте селезенки и поместить его в чашку Петри, содержащую 10 мл DMEM с 10% FBS.
- Раздавить селезенки использованием матового концами двух предметных стекол, чтобы освободить спленоцитам. Передача клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку.
- Собирают клетки центрифугированием при 200 х г (~ 1200 оборотов в минуту на клинической центрифуге с типичным диаметром ротора) в течение 5 мин при 4 ° C.
- Ресуспендируют клеток в 2 мл ACK буфера для ли....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Иммунопреципитация хроматина (чип) Протокол, представленные здесь, позволяет обеспечить учет различий, если таковые имеются, в количестве ДНК, используемые в ПЦР за счет использования пара праймеров, которая усиливает несвязанные области генома, таким образом, выступающей в качестве "управления загрузкой". В примере, показанном на рисунке 3, мы использовали кодирующей области гена мыши ACTB как область несвязанный нашим интерес белка и NFAT связывания фактора транскрипции участок на м.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол выше, обеспечивает надежный метод точного количественного ДНК обогащения из первичных лимфоцитов использованием чипа. Одна из главных причин устойчивости в данном протоколе, является включение биологических повторяет. Приведенные выше протокол использует трех повторов, обогащение, для которых вычисляется независимо. Выходы затем усредняются, чтобы обеспечить степень обогащения и стандартные отклонения рассчитаны, чтобы обеспечить меру изменчивости. Для каждого образца, три технических воспроизводит также выполн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами NIH CA141009 и GM39067. Мы благодарим Е. Р. Парнелл и Yarrington замечания по письменной части.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Формальдегид | Sigma | F-8775 | хранить в RT |
| Фосфатный буферный физиологический раствор | Hyclone | SH30256.01 | Хранить при 4 ° C |
| Ингибитор протеазы таблетки | Рош | 04693116001 | хранить при 4 градусах; |
| C Protein G магнитные бусины | Active Motif | 101945 | хранить при 4 °deg; |
| С-РНКаза А (20 мг/мл) | EMD Millipore | 556746 | хранить при -20 °°; C |
| Proteinase K (20 мг/мл) | Roche | 03115879001 | растворить в 50 мМ Tris-HCl, 10 мМ CaCl2, pH 8,0 |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-034 | Хранить при -20 °°; C |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7567 | хранить при -20 °°; C |
| 1 М Глицин | Хранить в | ||
| буфере для лизиса RT Cell (5 мМ трубок, pH 8,0; 85 мМ KCl; 0,5% NP-40) | Хранить при 4 ° C | ||
| Буфер для ядерного лизиса (50 мМ Трис, pH 8,1; 10 мМ ЭДТА; 1% SDS) | Хранить в | ||
| буфере для разбавления RT ChIP (0,01% SDS; 1,1% Triton X-100; 1,2 мМ ЭДТА; 16,7 мМ Трис pH 8,1; 190 мМ NaCl) | Хранить при 4 &�; C | ||
| Буфер для промывки с низким содержанием солей (0,1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8,1; 150 mM NaCl) | Хранить при 4 ° C | ||
| Буфер для промывки с высоким содержанием солей (0,1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8,1; 600 mM NaCl) | Хранить при температуре 4 ° Буфер для | ||
| промывки C LiCl (0,25 М LiCl; 1% NP-40; 1% дезоксихолат натрия, 1 мМ ЭДТА; 10 мМ Tris pH 8,0) | Хранить при 4 °°; Буфер C | ||
| TE (10 мМ Трис, pH 7,4, 1 мМ ЭДТА) | Хранить при температуре 4 °°; C | ||
| Элюирующий буфер (1% SDS; 0,1 M NaHCO3) | Готовьте свежие | ||
| 5 M NaCl | Храните в RT | ||
| 0,5 M EDTA | Храните в RT | ||
| 1 M Tris-HCl, pH 6,5 | Храните в RT | ||
| Таблица специфических реагентов | |||
| Clay Adams Brand Nutator | Becton Dickinson | Модель: 421105 | |
| Магнитный стенд | Promega | Z5342 | |
| Qiaquick Набор для очистки ПЦР | Qiagen | 28106 | |
| Masonix Sonicator 3000 | QSonica | Модель: S3000 | |
| УФ-спектрофотометр | NanoDrop Technologies | ND-1000 | |
| Нагревательный блок | VWR | 13259-030 | |
| Rotator | VWR | 80085-692 | |
| Настольная центрифуга с охлаждением | Beckman Coulter | Модель: Allegra X-12R | |
| Микроцентрифуга | Eppendorf | 5415 D | |
| Таблица оборудования |
Ссылки
- Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).
- Weinmann, A. S., Farnham, P. J.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
