Методическая статья

Визуализация эндоплазматического ретикулума Локализованные мРНК в клетках млекопитающих

DOI:

10.3791/50066

17 декабря 2012 г.

В этой статье

Краткое содержание

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы опишем метод визуализации эндоплазматическая сеть связанных мРНК в клетках млекопитающих культуре ткани. Эта методика включает в себя селективный проницаемости плазмы мембраны с дигитонина удалить цитоплазматического содержимого последующим флуоресцентным На месте Гибридизации для выявления объемных или поли (А) мРНК или конкретных стенограммы.

Аннотация

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У эукариот, большинство из РНК, (мРНК), которая кодирует выделяется и мембранные белки локализованы на поверхности эндоплазматической сети (ER). Тем не менее, визуализации этих мРНК может быть сложной задачей. Это особенно верно, когда только часть мРНК ER-ассоциированных и их распределение этой органеллы затруднен нецелевой (т.е. "свободный") стенограмм. В целях контроля ER-связанных мРНК, мы разработали метод, при котором клетки обрабатывают с коротким воздействием решение дигитонина добычи, избирательно permeabilizes плазматической мембраны, и таким образом снимает цитоплазматического содержимого, при одновременном сохранении целостности ER . Когда этот метод в сочетании с флуоресцентной гибридизации (FISH), можно четко визуализировать ER-связанного мРНК методом флуоресцентной микроскопии. С помощью этого протокола степени ER-ассоциации либо объемных поли (А) транскриптов или конкретных мРНК может быть оцененаи даже количественно. В этом процессе можно использовать этот анализ для исследования природы мРНК-ER взаимодействия.

Введение

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У эукариот мРНК, кодирующей выделяется и мембранных белков могут быть направлены на ER совместно трансляционно частицей 1,2 признание сигнала и может быть сохранен на ER через прямое взаимодействие между рибосомами и translocons во время перевода 3,4. Однако, независимо от мРНК могут быть направлены и поддерживается на ER зависит ни от рибосомы или перевода была неясна до самого последнего времени. Предыдущие исследования пытаются решить, есть ли перевод независимой мРНК связи с использованием ER сотовой методы фракционирования. Из-за суровых условиях химического должны были отделиться от рибосомы ER, полученных пузырьков, которые могут нарушить....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка материалов для добычи

  1. Подготовка клетки
    1. Семенной культуре ткани клеток на обработанных кислотой покровные по крайней мере, за один день до эксперимента. Мы используем COS-7 или U2OS, так как эти две клеточные линии обладают надежной продукции секретируемых белков и имеют четко определенные ER. Обратите внимание, что для достижения высокой эффективности добычи, клетки не должны превышать 80% слияния на покровное в день эксперимента.
    2. Если конкретный экзогенных мРНК находится в стадии расследования, клетки трансфицируют один день после посева с плазмиды, содержащие ген, представляющий интерес, используя стандартные протоколы т....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для определения процентного содержания мРНК, которая является ER-связанные, COS-7 клетки, которые трансфицировали плазмидами, которые содержали плацентарной щелочной фосфатазы (ALPP) или цитохром P450-8B1 (CYP8B1) были либо экстрагируют дигитонина и затем фиксировали, или непосредственно зафиксирована (см. Рисунок 1, сравните "неэкстрагированных Ctrl" на "Извлеченные Ctrl"). Неядерной флуоресценции количественно в обеих выборках и доля ER-связанных мРНК была рассчитана (рис. 2).......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Локализация мРНК в различных субклеточных сайтов, через взаимодействие с белками стенограммы мРНК локализации, является широко распространенным явлением важна для правильной сортировки белков в конечный пункт назначения, а также для тонкой настройки экспрессии генов в местные требования субклеточных 19,20 регионе.

С помощью анализа, описанного здесь, мы вернулись к вопросу о том мРНК, кодирующих белки секреторных может быть сохранен на ER в присутствии или в отсутствии рибосомы ил.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами от Национального научного и инженерного исследовательского совета Канады XAC и AFP

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Ссылки

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).
  2. Walter, P., Blobel, G.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in situ

Похожие статьи