Методическая статья

Золотистый стафилококк рост использования человеческого гемоглобина в качестве источника железа

DOI:

10.3791/50072

⸱

7 февраля 2013 г.

 ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University Medical School

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы опишем тест для роста Золотистый стафилококк С помощью гемоглобина в качестве единственного источника доступных питательных железа. Этот анализ устанавливает роль бактериальных факторов, влияющих на гемоглобин полученных приобретения железа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Золотистого стафилококка является патогенная бактерия, которая требует железо для выполнения жизненно важных функций обмена веществ и вызывают болезнь. Наиболее распространенными водохранилища железа внутрь человеческого организма является гема, который является кофактором гемоглобина. Для получения железа из гемоглобина, С. золотистого использует сложные системы, известной как железо-регулируемых поверхности определителя (Isd) системы 1. Компоненты Isd системы в первую очередь связывают гемоглобин хоста, а затем извлечь и импортировать гема, и, наконец, освобождение железа из гема в бактериальной цитоплазме 2,3. Этот путь был расчлененный через многочисленные лабораторные исследования 4-9. Кроме того, вклад Isd системы инфекцию неоднократно продемонстрирована на мышах 8,10-14. Создание вклад Isd система гемоглобина, полученных железа приобретения и рост оказался более сложным. Рост анализов с использованием гемоглобина в качестве единственного источника железа сложно бУ нестабильность коммерчески доступных гемоглобина, загрязняя свободного железа в питательной среде, и токсичность, связанная с железом энтеросорбенты. Здесь мы представляем метод, который преодолевает эти ограничения. Высокий гемоглобин качества получается из свежей крови и хранится в жидком азоте. Очищенная гемоглобина дополняется в железо-разрушающих среднего имитируя железа плохих условиях, с которыми сталкивается патогенов внутри позвоночного хозяина. К голодающим С. золотистого свободного железа и дополнения с минимально манипулировать формой гемоглобина Мы вызвать рост в манере, которая полностью зависит от способности связывать гемоглобин, извлечь гема, проходит через гема бактериальной клетки конверт и ухудшить гема в цитоплазме. Этот анализ будет полезен для исследователей, стремящихся выяснения механизмов hemoglobin-/heme-derived приобретения железа в S. стафилококка и, возможно, других бактериальных патогенов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Очистка гемоглобина от Fresh Blood

  1. Получить свежую человеческую кровь дополнить антикоагулянта. Держите кровь на льду или при температуре 4 ° С в течение очистки.
  2. Центрифуга крови в течение 20 мин при 1500 х г. Красных кровяных клеток (эритроцитов) будет в нижней части трубы. Осторожно аспирации супернатант и осторожно ресуспендируют осадок в ледяной 0,9% (вес / объем) раствора NaCl. Повторите центрифугирования и промыть 3 раза.
  3. Ресуспендируют гранул в 1 объеме ледяного 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0). Это приведет к лизису эритроцитов вследствие осмотического давления. Добавить толуола до ~ 20% конечного объема.
  4. Инкубировать при температуре 4 ° С на вертеле в течение ночи.
  5. Центрифуга лизата при 20000 х г в течение 1 часа. Сбор средней фракции гемолизата оставив толуол (плавающая сверху) и гранул нетронутым. Используйте длинную шею-пипетка для сбора средней фракции.
  6. Пройдите через 0,44 мкм фильтр шприца. Если раствор содержит частицыматерия и не могут быть переданы через фильтр, повторите шаг 1,5.
  7. Очищают гемоглобина (Hb) с высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) анионообменную колонку (Varian, PL-SAX 1000 в 8 мкм, 150 мм х 4,6 мм). В качестве подвижной фазы составляет 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0) и подвижной фазы B является 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0) + 0,5 М NaCl. 0% -100% градиентом растворителя B выполняется в течение 2 мин при 2,0 мл / мин, скорость потока. Элюирования контролируется на основе поглощения (λ: 410 нм и 280 нм). Собирайте только фракция характеризуется ярко-красный цвет и видный пик поглощения (рис. 1).
  8. Диализировать элюирования против фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение ночи, а затем в течение нескольких часов снова. Стерилизовать при прохождении через фильтр 0,22 мкм шприц.
  9. Для измерения концентрации гемоглобина, готовят стандартные растворы гемоглобина известных концентраций в PBS. Определить концентрацию гемоглобина в образце путем смешивания стандартного решения (см. таблицу с реагентами насред) или раствор образца с реагентом 2x Драбкин (в приготовленный из порошка) в соотношении 1:1. Например, смешать 100 мкл раствора гемоглобина с реагентом 100 мкл 2x Драбкин в 96-луночных планшетах. Инкубировать в течение 15 мин и измеряют оптическую плотность при 540 нм. Постройте стандартную кривую и определить концентрацию гемоглобина в образце. От пяти до пятнадцати мг / мл дает являются типичными.
  10. Выполнить 15-20 мкг очищенного гемоглобина на 15% SDS-PAGE в двух экземплярах. Пятно одним из гелей, передает белки от другого геля на нитроцеллюлозные мембраны и иммуноблот для гемоглобина (рис. 2).
  11. Замораживание и хранение 1 мл аликвоты гемоглобина в жидком азоте.

2. Подготовка железной разрушающих Медиа роста

  1. Подготовка Roswell Park Memorial Institute (RPMI) бульона путем растворения порошка в RPMI воды, добавьте бикарбонат натрия в соответствии с рекомендациями производителя и 1% cassamino кислоты (CA) (вес / объем). Стерилизовать при прохождении через фильтр 0,2 мкм и магазин холодильниковускоренными.
  2. Подготовка металла обедненный RPMI (NRPMI), добавив 7% (вес / объем) Chelex 100 и перемешивания в течение ночи на магнитной мешалки. Удалить Chelex 100, проходя через фильтр 0,2 мкм и хранить в холодильнике. Дополнение сред с существенным цветных металлов: 25 мкМ ZnCl 2, 25 мкМ MnCl 2, 100 мМ CaCl 2 и 1 мМ MgCl 2, заранее подготовленных в виде стерильного 1000 х решение. Использование одноразовых пластиковых контейнеров для этого шага, чтобы избежать загрязнения железом из повторно используемых материалов.

3. Золотистый стафилококк рост использования Гемоглобин в качестве единственного источника Железная

  1. Подряд S. золотистый для изоляции на триптического соевый агар (TSA) из замороженного запаса. Инкубировать при 37 ° С в течение 20-24 часов.
  2. Ресуспендируют этилендиамин-N, N'-бис (2-гидроксифенилуксусной кислоты) (EDDHA) в безводном этаноле до 100 мМ. EDDHA не переходит в раствор, но стерилизуют этанолом.
  3. Добавить EDDHA в RPMI до конечной концентрации 0,5 мМ. ПозволятьEDDHA распустить в течение по крайней мере 30 минут, прежде чем переходить к следующему шагу. Благодаря партии к партии изменения, конечная концентрация EDDHA возможно, должны быть снижены до 0,25 мм, чтобы рост бактерий.
  4. Инокулировать одной колонии S. золотистый в 5 мл RPMI содержащие EDDHA в 15 мл завинчивающейся крышкой конических труб. Инкубировать при 37 ° C при встряхивании на 180 оборотов в минуту (RPM) в течение 16-20 часов.
  5. Центрифуга ночь культур в течение 5 мин при 7500 мкг и ресуспендируют осадок в NRPMI, содержащего 0,5 мМ EDDHA. Нормализация OD 600 до ~ 3.
  6. Подготовка NRPMI, содержащего 2,5 мкг на мл Hb и 0,1-1,0 мм EDDHA. Из-за различий между партиями, концентрация EDDHA, необходимых для хелатные свободного железа в NRPMI могут отличаться.
  7. Субкультура 10 мкл бактериальной суспензии с шагом 3,5 в 1 мл NRPMI + + EDDHA Hb в 15 мл завинчивающейся крышкой коническую трубку.
  8. Инкубируют культуры при 37 ° С в течение 48 ч при встряхивании при 180 оборотах в минуту или по скользящему барабан.
  9. каждые 6-12 часов принять OD 600 показаний путем удаления 50 мкл культуры и смешивая его с 150 мкл PBS в 96-луночных планшетах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы очищенного человеческого гемоглобина гемолизата с помощью ВЭЖХ (протокол шагом 1,7). Рисунке 1 показан записанный поглощение элюата при 280 и 410 нм длины волны. Доля 5 была собрана и другие фракции были отброшены. Доходность от пяти до пятнадцати миллиграммов на миллилитр гемоглобина элюата, как правило, приобрели. Очищенная гемоглобин был проанализирован SDS-PAGE в двух экземплярах и гели либо окрашивают в течение белков или переносили на нитроцеллюлозные и иммуноблоттинг (протокол шагом 1,10,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Железо является важнейшим питательным требуется организмов из всех царств жизни 15. У позвоночных, железо поглощенных чтобы избежать токсичности, вызванные этим элементом. Это поглощение таит в себе железо от вторжения микробов в процессе, известном как питание иммунитет 16. В ответ на патогенные развивались стратегии, которые обойти питания иммунитета. Одним из таких механизмов зависит от гемоглобина, который является наиболее распространенным источником железа в принимающем 17. Гемогло...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано США Public Health Service гранты AI69233 и AI073843 из Национального института аллергии и инфекционных заболеваний. EPS является членом Burroughs Wellcome в патогенезе инфекционных заболеваний. KPH был профинансирован клеточной и молекулярной микробиологии Обучение гранта Программы 5 T32 A107611-10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название Реагенты / Материал Компания Номер по каталогу Комментарии
ВЭЖХ анионообменной колонки Varian PL1551-3802
Драбкин Реактив Сигма D5941-6VL
Гемоглобин стандартных Pointe Научные H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 натриевой форме Сигма C7901
EDDHA LGC Standards GmbH АНК 001
Гемоглобин антител Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Триптический соевом агаре BD 236920

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535(2012).
  3. Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
  4. Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
  5. Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
  6. Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
  7. Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
  8. Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
  9. Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
  10. Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
  11. Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
  12. Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
  13. Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
  14. Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
  15. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  16. Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
  17. Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
  18. Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
  19. Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
  20. Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
  21. Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
  22. Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).
  23. Williams, R. C. Jr, Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
  24. Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
  25. Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
  26. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
  27. Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
  28. Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SDS PAGE

Похожие статьи