Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В режиме реального времени Живая съемка Т-клеточного сигнального комплекса Формирование

13.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50076

⸱

23 июня 2013 г.

 ,  , 
1The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Опишем живых клеток изображений методом, который дает представление динамики белков в процессе активации Т-клеток процесса. Мы демонстрируем комбинированное применение Т-клеточного анализа распространения, конфокальной микроскопии и анализа изображений для получения количественных результатов следовать сигнального комплекса формированием на протяжении активации Т-клеток.

Аннотация

Защита от инфекционных заболеваний обеспечивается иммунной системой 1,2. Т-лимфоциты являются главными координаторами иммунной системы, регулируя активацию и реакцию множественных иммунных клеток 3,4. Активация Т-клеток зависит от распознавания специфических антигенов, демонстрируемых антигенпрезентирующими клетками (АПК). Рецептор Т-клеточного антигена (TCR) специфичен для каждого клона Т-клеток и определяет специфичность антигена5. Связывание TCR с антигеном индуцирует фосфорилирование компонентов комплекса TCR. Для того, чтобы способствовать активации Т-клеток, этот сигнал должен быть передан от мембраны к цитоплазме и ядру, инициируя различные важные реакции, такие как рекрутирование сигнальных белков в TCR; Сайт АПК (иммунный синапс), их молекулярная активация, перестройка цитоскелета, повышение внутриклеточной концентрации кальция и изменения экспрессии генов 6,7. Правильная инициация и прекращение активирующих сигналов имеет решающее значение для адекватного ответа Т-клеток. Активность сигнальных белков зависит от образования и прекращения белок-белковых взаимодействий, посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование белков, образование белковых комплексов, убиквитилирование белков и рекрутирование белков в различные клеточные участки 8. Понимание внутренней работы процесса активации Т-клеток имеет решающее значение как для иммунологических исследований, так и для клинического применения.

Для изучения белок-белковых взаимодействий были разработаны различные анализы, однако биохимические анализы, такие как широко используемый метод совместной иммунопреципитации, не позволяют различить расположение белка, тем самым исключая наблюдение ценной информации о динамике клеточных механизмов. Кроме того, эти объемные анализы обычно объединяют белки из многих различных клеток, которые могут находиться на разных стадиях исследуемого клеточного процесса. Это может оказать пагубное влияние на временное разрешение. Использование визуализации живых клеток в режиме реального времени позволяет как пространственно отслеживать белки, так и иметь возможность временно различать сигнальные события, тем самым проливая свет на динамику процесса 9,10. Представлен метод визуализации формирования сигнальных комплексов при активации Т-клеток в режиме реального времени. Первичные Т-клетки или Т-клеточные линии, такие как Jurkat, трансфицируют плазмидами, кодирующими представляющие интерес белки, слитые с мономерными флуоресцентными белками, предотвращая нефизиологическую олигомеризацию. Живые Т-клетки капают на покровное стекло, предварительно покрытое антителом, активирующим Т-клетки 8,9, которое связывается с комплексом CD3/TCR, индуцируя активацию Т-клеток и преодолевая потребность в специфических активирующих антигенах. Активированные клетки постоянно визуализируются с помощью конфокальной микроскопии. Данные визуализации анализируются для получения количественных результатов, таких как коэффициент колокализации сигнальных белков.

Протокол

1. Т-клеточные Трансфекцию

  1. Подготовьте активированный Amaxa Nucleofector решение путем смешивания комплекта "Приложении" решение Nucleofector решения. Активированный раствор можно хранить при 4 ° С в течение трех месяцев.
  2. Grow Jurkat Т-клеток в культуральной среде [10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1% пенициллина-стрептомицина решение, и 2 мМ L-глутамина в среде RPMI]. Оптимально, клетки должны быть использованы через 1-2 недели после оттаивания. Использование культур клеток в логарифмической фазе роста имеет решающее значение для высокой эффективности трансфекции и выживание клеток. Кроме того, с незначительными изменениями, этот протокол может быть использован с первичным Т-клеток, как описано выше 8. Следует подчеркнуть, что, как продолжительность процесса активации первичных Т-клеток больше, чем у Jurkat Т-клеток (~ 30 мин), предметный столик микроскопа установлен инкубации система должна быть использована для поддержания CO 2, уровень влажности и температуры в течение Процесс активации.
  3. Соберите 5× 10 6 лог-фазы Т-клеток в трансфекции в 15-мл пробирку.
  4. Центрифуга клетки в течение 7 минут при 400 х г при комнатной температуре.
  5. Во время центрифугирования, готовят 6-луночный планшет. Заполните одну скважину для каждой трансфекции с 5 мл культуральной среды и предварительно инкубируют при 37 ° С.
  6. Собирать трубы из центрифуги и отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл среды RPMI.
  7. Центрифуга клетки в течение 7 минут при 400 х г при комнатной температуре.
  8. Во время центрифугирования, готовить раствор для трансфекции. В одну лунку 96-луночного планшета, смешивать активированный 100 мкл Amaxa Nucleofector раствор, полученный на стадии 1, с 5 мкг ДНК плазмиды интерес кодирующую флуоресцентно меченого белка. Оптимально концентрации ДНК должна быть больше, чем 1 мкг / мл, чтобы избежать разбавлением раствор для трансфекции.
  9. Хорошо перемешайте, осторожно пипеткой.
  10. После центрифугирования клеток, осторожно удалить все супернатанта а не гisturbing гранул.
  11. Внесите ДНК / трансфекции раствор дважды.
  12. Добавить ДНК / трансфекции решение гранул.
  13. Передача клетки Amaxa кюветы.
  14. Вставьте кювету в устройстве Amaxa Nucleofector.
  15. Используйте H-10 Amaxa трансфекции настройки для электропорации (для Jurkat) или Т-23 (для первичных Т-клеток).
  16. Удалить 6-луночный планшет из инкубатора.
  17. После электропорации, тщательно передачи супернатанта клеточной суспензии в 6-луночный планшет помощью пипетки Пастера. Осадок, состоящий из остатков клеток могут образовывать. Избегать передачи гранул.
  18. Клетки инкубируют в течение 24 ч при 37 ° С.
  19. Передача 2,5 мл суспензии клеток из каждой лунки в новой скважины. Добавить 2,5 мл теплой культуральной средой (описан на стадии 2) в каждую лунку.
  20. После 72 ч, перенос клеток в стерильную пробирку и центрифугировали 7 мин при 400 х г при комнатной температуре. Удалите супернатант и заменить его Wiй культуральной среде, содержащей антибиотик млекопитающих выбора ячейки подходит для плазмиды, использованной (применить концентрации, пригодной для антибиотиков, используемых, мы использовали G418 и / или гигромицину в концентрации 1,3 мг / мл и / или 0,2 мг / мл, соответственно). Культуры суспензию клеток в свежей хорошо. Кроме того, клетки могут быть трансфицированы временно и отображаемого 48 часов после трансфекции. Для подготовки временной трансфекции клетки, со-трансфекции клеток с двух плазмид одновременно на этапе 8, продолжается обычно на шаг 20, а затем перейдите непосредственно к шагу 23. Обратите внимание, что при таком сценарии, клетки следует использовать сразу, да и вообще их интенсивность флуоресценции гетерогенных и не обязательно высокой.
  21. Рост клеток в культуральной среде, содержащей соответствующий антибиотик выбора. Сплит клетки и дополнить их антибиотикам дополнен культуральной среде по мере необходимости.
  22. Через 2 недели проверки успешной трансфекции с использованием FACS (гриппценции активированный сортировки клеток) следующим образом:
  23. Собирают 10 6 трансфицированных клетках, 10 6 макет трансфицированных клеток (отрицательный контроль) и 10 6 клеток, которые, как известно, стабильно экспрессируют флуоресцентно меченого белка. Если клетки трансфицируют с более чем одним флуоресцентный белок (см. шаг 27), используют несколько, однократно помеченный клеточных линий в качестве положительного контроля.
  24. Центрифуга клетки в течение 7 минут при 400 х г при комнатной температуре.
  25. Удалите супернатант. Ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера FACS (PBS без Са 2 + и Mg 2 +, 5% FCS, 0,05% азида натрия).
  26. Использование аналитических FACS для проверки сотовые флуоресценции. Сравнение флуоресценции трансфицированных клеток, что и отрицательный и положительный контроли.
  27. Для трансфекции клеток с дополнительным флуоресцентно меченого белка, повторите шаги 3-26 использовании трансфецированных клеток.
  28. Клетки отображения высокие уровни флуоресценции должны быть использованы. Оптимально, по крайней мере, 50%клеток в культуре должны быть очень флуоресцентные. Сотовые флуоресценции может быть увеличена путем сортировки клеток с помощью FACS.

Любые дополнительные меченных белков должна быть слита с разными флуорофорами и быть закодированы на плазмиды, кодирующие различные антибиотики для выбора. Выбор среды для клеток, трансфицированных более одного плазмида должна быть дополнена все соответствующие антибиотики.

2. Т-клеточного анализа Подготовка Распространение

  1. Используйте Lab-Tek II немецкой системы покровного стекла 4 слайдов камеры. Убедитесь, что не случайно поцарапать внутреннюю поверхность камеры, например, с кончика пипетки, во время подготовки или использования.
  2. Подготовка 50 мл раствора препарата слайд: Возьмите 4,6 мл 12 м (37%) HCl, добавляют 38,5 мл 100% этанола и 6,9 мл дважды дистиллированной воды.
  3. Заполните каждую палату слайд с 500 мкл раствора подготовке слайдов.
  4. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
  5. Аспирируйте камерыс, сушки их полностью.
  6. Выдержите непокрытый слайды в течение 1 часа при 45 ° С до полного высыхания.
  7. Подготовьте 0,01% поли-L-лизина путем разбавления 0,1% поли-L-лизина (Sigma-Aldrich) в дважды дистиллированной воде.
  8. Применить 500 мкл в каждую камеру.
  9. Инкубируйте слайдов в течение 15 мин при комнатной температуре.
  10. Аспирируйте камер, сушки их полностью.
  11. Выдержите в течение 3 ч при 45 ° С до полного высыхания.
  12. Покрытием слайды можно хранить сухими в течение нескольких месяцев при комнатной температуре.
  13. Подготовьте решение активирующих антител. Используйте антитела против CD3: либо HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) или UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 мкг / мл в 400 мкл PBS, на камеру. Это решение должно быть подготовлено незадолго до слайд подготовки.
  14. Заполните каждую камеру с 400 мкл активирующий раствор антител.
  15. Инкубируйте слайдов в течение 2 часов при температуре 37 ° C или, предпочтительно, в течение ночи при 4 ° С.
  16. Снимите активирующих антител Solution и немедленно промойте камеру дважды 300 мкл PBS. С этой точки, убедитесь, что камера остается заполненным буфером.
  17. Храните PBS заполненный слайд при 4 ° C. Мы предлагаем использовать подготовленных камер слайд в течение 1 недели.

3. Активацию Т-клеток и обработка изображений

  1. Подготовка изображений буфер [1,25 HEPES мл (1 М), 10 мл FCS, 38,75 мл RPMI без фенола красного]. Изображений буфера можно хранить при температуре 4 ° С после фильтрации.
  2. Активируйте Zeiss LSM 510 Мета микроскопом. Теплый микроскопом обогреваемый монтажной рамы до 37 ° C. Выберите "Режим эксперта".
  3. Нажмите кнопку "Получить" на вкладке и открыть следующие вкладки: лазеров, микроскопия; конфигурации; сканирование; временных рядов.
  4. Активируйте необходимы лазеры. Для возбуждения и MCFP mYFP, установите аргон / 2-лазера на "ожидания" в течение 5 мин, затем в положение "ON".
  5. Если вы выполнили эту живых клеток до анализа изображений, используя те же флуорофорам, откройте полученный файл LSM, нажмите кнопку "повторное использование" яCon, и перейдите к шагу 9. В противном случае перейдите к шагу 6.
  6. Определение каналов с использованием фильтров подходящей для возбуждения и излучения флуоресцентного белка использовали.
  7. В "Scan управления", выберите опцию Z стека.
  8. Введите следующие параметры сканирования: Количество слоев: 5; Интервал: 0,5 мкм; текущий разрез: 3.
  9. Подготовка Твердотелый термостат AccuBlock (Labnet) при 37 ° С около микроскопом.
  10. Теплый изображений буфера до 37 ° C.
  11. Подготовьте хранятся слайды путем аспирации PBS, заменив ее 600 мкл буфера теплой изображений.
  12. Выдержите слайд при 37 ° С. Держите слайд в инкубаторе до шага 13, в течение 15 мин.
  13. Собирают 5 × 10 5 трансфицированных Т-клеток.
  14. Центрифуга клетки в течение 2 мин при 400 х г.
  15. Удалите супернатант.
  16. Ресуспендируют клеток в 1 мл теплой буфер изображений, и передавать их в 1,5 мл трубки Эппендорф.
  17. Поместите тПредполагаемое трубку на Твердотелый термостат AccuBlock.
  18. Возьмите нагретый слайд из инкубатора, и установите его на утепленной микроскопом монтажной раме.
  19. Нажмите кнопку "VIS" икону.
  20. Смешать клеточной суспензии и удалить 1-2 мкл.
  21. Вставьте кончик пипетки в буфер визуализации выше нижней части слайда. Избегайте царапин слайде.
  22. Семенной клеток в течение Диафрагма цель автора.
  23. Немедленно начать визуального отслеживания флуоресцентных клеток, как они спускаются. Выделите ячейку, которая отображает высокую флуоресценцию в обоих каналах.
  24. Перед клетка достигает поверхности ползуна, активируют LSM режиме.
  25. Переключить только один лазерного возбуждения. Выберите лазер для которого у вас есть DIC канала.
  26. Задайте зум до 1. Нажмите кнопку "Быстрая XY" икону. Нажмите кнопку "Стоп" икону. С помощью инструмента обрезки, выберите ROI по центру ячейки.
  27. Задайте зум до 3. Нажмите кнопку "Быстрая XY" значок, а затем вручную установить фокус для оптимального просмотра клетке. Нажмите кнопку "Стоп" ICON.
  28. Переключите все необходимые лазеров возбуждения.
  29. Начните запись, нажав кнопку "StartT" икону. Изображение ячейки для полноты распространение процесса (обычно 5 мин). Когда закончите, нажмите кнопку "Стоп" икону.
  30. Сохраните файл.
  31. Для приобретения дополнительных ячеек, нажмите кнопку "VIS" икону. Если есть клетки, которые еще не вступили в контакт с нижней слайда, перейдите к шагу 23. Избегайте изображений клеток, которые уже начали процесс распределения. В противном случае перейдите к шагу 32.
  32. Если наблюдаемая область слайда в основном без клеток, добавьте еще аликвоты клеток (далее с шагом 20). В противном случае перейдите к шагу 33.
  33. Для получения дополнительных ячеек, перемещение слайдов таким образом, что область над отверстием целью является лишенной клеток.
  34. Добавить другой аликвоты клеток (и перейдите к шагу 20).
  35. После выполнения всех нужных изображений, открыть сохраненный файл LSM.
  36. Нажмите кнопку "Галерея", "Время + Z" и "подмножество".
  37. Выберите relevanT диапазона времени и Z стека.
  38. Сохраните новый файл.
  39. Выполните шаги 35-38 для всех файлов изображений.

4. Анализ данных изображений

  1. Откройте файлы с помощью LSM Imaris программное обеспечение (Bitplane AG, Цюрих Швейцария).
  2. Нажмите кнопку "превзойти". Нажмите кнопку "Обработка изображений" меню и выберите "Поменять Время и Z". Это поможет в правильной обрезки изображения.
  3. Нажмите кнопку "Изменить" на панели инструментов и выберите "Урожай 3D" вариант в раскрывающемся меню. Обрезать изображение, чтобы включать только области, окружающей клетку. Мы предлагаем обрезки 300 × 300 пикселов сосредоточены на квадратные клетки. Обратите внимание, что форма и расположение клетке может меняться с течением времени. Наблюдая оси Т, убедитесь, что ячейка находится в обрезанную область во всех временных точках.
  4. Нажмите кнопку "Обработка изображений" меню и выберите "Поменять Время и Z", чтобы восстановить оригинальное временное разделение изображения.
  5. Нажмите кнопку "Coloc" кнопки на главной панели инструментов. Выберите "Разработка Deр. Coloc ". Imaris автоматически вычисляет интенсивность пороговые значения для каждого канала в каждый момент времени.
  6. Просмотр результатов анализа колокализации, выбрав "Channel Statistics". Экспорт данных, нажав кнопку "Экспорт".
  7. Повторите шаги с 1 по 6 для каждой отображаемой ячейки. Мы рекомендуем, чтобы по крайней мере 50 клеток быть проанализированы таким же образом.
  8. Вычислить средний коэффициент колокализации Пирсона и его стандартная ошибка или отклонения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Приведем пример живой Т-клеточной визуализации и анализа. До изображений эксперимент, SLP76 дефицитный Т-клеток (J14) анализировали с помощью FACS для определения экспрессии флуоресцентного белка (Рис. 1). Т-клетки трансфицировали отмеченных сигнальных белков MCFP-Nck и SLP76-mYFP наносились по активации слайдов и отображаемого во время Т-клеток с расширением спектра (рис. 2). Собранные изображения показывают динамику локализации белков в течение активации и распространения (рис...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Регулирование и функции нескольких клеточных процессов зависит от формирования и прекращения белок-белковых взаимодействий. Микроскопические изображения позволяет в реальном времени отслеживать флуоресцентно меченных белков в живых клетках. Колокализации меченных белков можно предположить прямое или косвенное взаимодействие между белками и могут быть использованы для укрепления данные, полученные биохимическими методами, такими как иммунопреципитации. В отличие от биохимических методов, живых клеток изображения позволяе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У нас нет конфликта интересов раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Софии Жареные за техническую помощь. MBS благодарит за учреждениям за их поддержку исследования: научный фонд Израиля на гранты no.1659/08, 971/08, 1503/08 и 491/10, Министерства здравоохранения и науки на гранты нет. 3-4114 и 3-6540, Израиль ассоциации рака через усадьбу покойного Александра Smidoda и Фонда Taubenblatt Семья для био-медицины совершенству гранта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Reagent/Material
Amaxa набор нуклеофекторов человеческих Т-клетокLonzaVCA-1002
Anti CD3 (клон UCHT1) BioLegend300432
Falcon FACS TubesBecton Dickinson352058
FCSHyCloneSV30160.03
G418Calbiochem345810
Немецкая система покровного стекла 4-камерные предметные стекла Lab-Tek II155382
HClBio Lab8410501
Hepes Biological Industries03-025-1B
ГигомицинEnzoALX-380-306
L-глутамин SigmaG7513
PBS (10X)SigmaD1408
Пенициллин-стрептомицин SigmaP0781
Поли-L-лизин 0,1 % (w/v) в H2OSigmaP8920
RPMISigmaR87589
Азид натрияSigmaS2002
Equipment
Accublock цифровая сухая ваннаLabnetD1105A
ЦентрифугаEppendorfCentrifuge 5810 R
Конфокальный микроскопZeissLSM 510 Meta
Нагреваемая монтажная рамка - нагревательная вставка P S PeCon130-800-031
TempModule S (требуется для нагреваемой монтажной рамы)Zeiss411860-9010-000
ЭлектропораторAmaxaNucleofector I
Флуоресцентно активированный сортировщик клетокBecton DickinsonFACSVantage SE
Программное обеспечение для анализа изображенийBitplane7.0.0

Ссылки

  1. Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
  2. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
  3. Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
  4. Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
  5. Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
  6. Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
  7. Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
  8. Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
  9. Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
  10. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
  11. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
  12. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
  13. Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
  14. Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
  15. Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
  16. Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
  17. Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
  18. Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Конфокальная микроскопиябелок-белковые взаимодействияфлуоресцентные белкиактивация Т-клетокиммунологический синапсанализ колокализацииклетки JurkatТКР-комплекс
В режиме реального времени Живая съемка Т-клеточного сигнального комплекса Формирование
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.