Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и культуры мышь кортикальной астроциты

94.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50079

⸱

19 января 2013 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg , 2Centre of Chronic Immunodeficiency (CCI), University Medical Centre Freiburg, University of Freiburg

В этой статье

Краткое содержание

Астроциты были признаны универсальными клетки, участвующие в фундаментальных биологических процессов, которые необходимы для нормального развития и функционирования мозга и центральной нервной системы ремонта. Здесь мы представляем быстрой процедуры получения чистых культур астроцитов мышь, чтобы изучать биологию этого важнейшего класса центральной нервной системы.

Аннотация

Астроциты являются обильные типа клеток в мозге млекопитающих, однако еще многое предстоит узнать о их молекулярных и функциональных характеристик. Экстракорпоральное астроцитов системы культуры клеток могут быть использованы для изучения биологических функций этих клеток глии в деталях. Это видео показывает, как протокол для получения чистого астроцитов путем выделения и культуры смешанных корковых клеток мыши щенков. Метод основан на отсутствии жизнеспособных нейронов и разделение астроцитов, олигодендроцитов и микроглии, три основных глиальных популяций клеток центральной нервной системы, в культуре. Представитель изображений в первые дни культуры демонстрируют наличие смешанной популяции клеток и указать временной точке, когда астроциты стать вырожденной и должны быть отделены от микроглии и олигодендроцитов. Кроме того, мы демонстрируем чистоту и астроцитов морфологии культурного астроциты использованием иммуноцитохимических для окрашивания хорошо организованной иВновь описанный астроцитов маркеров. Эта культура система может быть легко использован для получения чистого астроциты мыши и астроцитов-кондиционированной среды для изучения различных аспектов астроцитов биологии.

Введение

Астроциты являются очень обильные типа клеток в центральной нервной системе (ЦНС). Отношение астроцитов в нейроны составляет 1:3 в коре головного мозга мышей и крыс, тогда как в 1,4 астроциты на нейрон в коре человека 1. Интерес к функции астроцитов, резко возросло в последние годы. Ключевая функция астроцитов является их роль в обеспечении структурной и метаболической поддержки нейронов 2,3. Недавно обнаруженные роли астроцитов охватывает широкий спектр функций. Они включают в себя руководящие миграции развивающиеся аксоны и некоторых нейробластов в процессе разработки 4-6, функции в синаптической передачи, синапса сила и обработки информации с помощью нейронных цепей 7-9, роли в гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) формирование 10 и целостности 11-13 и регулирование цереброваскулярных 14 тон. Еще одна важная особенность астроцитов является их реакция на травму. При патологических условиях astrocytES стала реактивной и дальнейшее апрегулируются выражения промежуточных филаментов глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) и тормозных внеклеточного матрикса (ECM) белки 15,16. Реактивная астроциты демаркации места повреждения от здоровых тканей за счет формирования глиальных рубцов, которая состоит в основном из астроцитов секретируемых белков ECM из хондроитина сульфата протеогликанов (CSPG) семьи, основные факторы, которые препятствуют регенерации аксонов после травм ЦНС 15-17.

Астроциты исходят от радиальной глии (РГ) клеток во время позднего эмбриогенеза и раннего послеродового жизни. После астроцитов спецификации произошло, астроцитов предшественники мигрируют в своей окончательной позиции, где они начинают процесс терминальной дифференцировки. В естественных условиях, астроциты, по всей видимости, зрелые три-четыре недели после рождения, как указано в их типичной морфологией 18,19. Субпопуляции клеток RG конвертировать в субвентрикулярной астроциты зоны (тип В-клеток). Сидр., RG и клетки типа B функционировать как астроциты, как нервные стволовые клетки (НСК) во время разработки и во взрослой, соответственно. Как астроциты, RG и клетки типа B также выразить астроцитов конкретных глутамата транспортер (GLAST), мозг липид-связывающий белок (BLBP), и GFAP, указывая, что эти маркеры не могут быть использованы исключительно в специально маркировать взрослых астроцитов. В отличие от взрослых паренхиматозных астроцитов, которые не разделяют в здоровом мозге, RG и типа В-клетки выставки стволовых клеток потенциал таких как способность к самообновлению. Нарушение регуляции астроциты были замешаны в многочисленных патологий, в том числе болезни Альцгеймера 20,21, болезнь Хантингтона 22, болезнь Паркинсона 23, синдромом Ретта 24 и болезнь Александра 25. Кроме того, астроциты реагируют на все оскорбления со стороны ЦНС, что приводит к активации астроцитов и глиальных астроцитов формирование рубца 16,26. Астроцитарных глиальных рубцов, которая формирует следующие TR мозгаAUMA или повреждением спинного мозга считается главным барьер, препятствующий регенерации нейронов 15.

Разработка надежных методов, чтобы изолировать и поддерживать очищенной популяции клеток было важно для нашего понимания нервной системы. Пионерские работы по Маккарти и де Vellis позволяет исследователям до сих подготовить почти чистых культурах астроцитов из ткани новорожденных крыс 27. Многое узнал о астроцитов биологии с использованием этого метода, который представлен здесь в несколько измененной форме выделения мышью корковых астроцитов. В дополнение в естественных условиях исследования, астроциты, а также кондиционированной среды, полученные с использованием описанного в культуре пробирке, являются ценными инструментами для дальнейшего получить представление астроцитов функций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Изоляция и покрытия смешанных корковых клеток

Смешанная корковая изолятор для астроцитов культуры могут быть выполнены с использованием P1 до P4 мышь щенков. Для того чтобы добиться надлежащего астроцитов плотности необходимо использовать 4 мышью щенка коры в колбе T75 культуре ткани. Таким образом, объемы в следующих протоколов рассчитаны на клеточный препарат с использованием 4 щенков мыши.

  1. Перед началом процедуры вскрытия, prewarm 30 мл астроцитов медиакультуры (DMEM, высокий уровень глюкозы + 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки + 1% пенициллина / стрептомицина, см. таблицу) до 37 ° C. Пальто один T75 колбу с 20 мл поли-D-лизин (PDL) в концентрации 50 мкг / мл в культуре клеток классе воде в течение 1 часа при 37 ° C в CO 2 инкубаторе.
  2. Для вскрытия процедуры, подготовить все необходимые реактивы и материалы. Вам понадобится: хирургические ножницы, гладкой тонкой щипцы, телевизор с плоским наконечником щипцы, бумажные полотенца, пакет для отходов, 70% этанолаD 2 рассекает блюд (3,5 см в диаметре) на льду заполнен с 2 HBSS мл.
  3. Придерживая и опрыскивать головы и шеи мыши щенка с 70% этанола. Животное приносится в жертву путем обезглавливания помощью ножниц.
  4. Выполните срединный разрез, задней к передней, вдоль головы, чтобы показать череп.
  5. Вырезать черепа тщательно от шеи до носа. Две дополнительные разрезы выполняются для дальнейшей доступ к мозгу: первый надрез передней обонятельной луковицы, другой уступает мозжечка отключить черепа от основания черепа.
  6. С помощью плоских щипцов наконечник, черепно закрылки аккуратно перевернуть на бок и мозг вынимают и помещают в первом рассекает блюдо заполнено HBSS. Поместите блюдо обратно на лед и продолжить сбор всех 4 мозги.
  7. Остальная часть диссекции процедура проводится под стереомикроскопа. Во-первых, обонятельные луковицы и мозжечка удаляются с помощью тонкойдиссекции (рис. 1б).
  8. Для того, чтобы получить коры, захватить заднему концу мозга с тонким пинцетом, выполняют срединный разрез между полушариями, вставьте второй набор щипцов для созданного рощу и удаляйте пластинчатые структуры коры с мозге.
  9. Тщательно анализировать мозговые оболочки из коры полушарий, потянув с тонким пинцетом (рис. 1D). Этот шаг позволяет избежать загрязнения конечного астроцитов культуры менингеальные клеток и фибробластов. Передача подготовленных полушарий коры на второе блюдо заполнено HBSS и вернуть его на лед. Продолжить соответственно со всеми 4 коры.
  10. Наконец, сократить каждого полушария коры на мелкие кусочки с помощью острых лезвий (приблизительно от 4 до 8 раз).
  11. В стерильных условиях, передачи части коры в один 50 мл трубки сокола и добавить HBSS в общем объеме 22,5 мл.
  12. Добавить 2,5 мл 2,5% трипсина, перемешать и инкубироватьткань в ванну с водой при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Смешать время от времени встряхивая каждые 10 мин.
  13. Центрифуга в течение 5 мин при 300 х г в гранулах части коры ткани.
  14. Осторожно удалите супернатант декантации. Для того, чтобы избежать потери ткани гранулы можно механически удерживать его с помощью пипетки. Диссоциируют ткани в суспензии отдельных клеток путем добавления 10 мл астроцитов среднего покрытия и энергичного пипетирования с использованием 10 мл пластиковые пипетки, пока ткань куски распадается на отдельные клетки (20 до 30 раз). Регулировка громкости до 20 мл, используя астроцитов среднего покрытия. Вы можете доказательство диссоциации ткани коры в отдельных клеток путем подсчета использованием гемоцитометр. Один получения 4 мышью щенка коры должна дать 10-15 x10 6 диссоциированных отдельных клеток.
  15. Аспирируйте PDL от культуры колбы T75, плиты диссоциированных суспензии отдельных клеток и инкубировать при 37 ° C в CO 2 инкубаторе.

2. Получение Enriched Astrocyte культуры

  1. Изменение среды 2 дней после посева смешанной корковых клеток, и все 3 дней после этого.
  2. После 7 до 8 дней, когда астроциты вырожденная и наплавки микроглии сидеть выставлены на астроциты слой или уже отделен от астроцитов слой (рис. 2), встряхните T75 колбу на 180 оборотов в минуту в течение 30 мин на орбитальном шейкере, чтобы удалить микроглии. Удалите супернатант, содержащий микроглии или, если хотите, чтобы изучить культуру и микроглии, спина его и пластины для культуры 28,29.
  3. Добавить 20 мл свежей питательной среды астроцитов и продолжать, встряхивая колбу на 240 оборотов в минуту в течение 6 часов, чтобы удалить олигодендроцитов клеток-предшественников (OPC). Так как некоторые OPCs не будет полностью отделяться от астроцитов слоя, продолжают энергично встряхивают вручную в течение 1 мин в целях предотвращения загрязнения OPC. Откажитесь от супернатанта или вращать его вниз и пластины, если вы хотите культуре OPCs 29.
  4. Промойте оставшиеся conflueNT астроцитов слоем в два раза с PBS, аспирации PBS, добавляют 5 мл трипсина-EDTA и инкубировать в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C. Проверьте отряд астроциты каждые 5 мин и обеспечивать отряд астроцитов, нажав колбу с ладони (2-3 раз).
  5. После астроциты отделены от культуры колбу, добавляют 5 мл астроцитов культуральной среде, спин клетки при 180 мкг в течение 5 мин, супернатант и добавить 40 мл свежего астроцитов среднего покрытия. Один T75 культуре ткани колбу должно дать около 1х10 6 клеток после первого разделения клетки. Плита клетки в двух T75 колбы с культурой и инкубировать при 37 ° C в CO 2 инкубаторе. Изменение средних каждые 2 до 3 дней.
  6. 12-14 дней после первой астроциты раскол высевают в соответствующую ячейку концентрации 24-48 часа до проведения эксперимента. Один T75 культуре ткани колбу должно дать около 1.5-2 x10 6 клеток после второго разделения клетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После выделения полного мозга мыши (рис. 1А), мозжечка и обонятельные луковицы должны быть удалены (рис. 1б). Коры очистить от кожуры стебля мозга мыши (рис. 1С) и мозговых оболочек отдельных коры (рис. 1D) тщательно удалены (рис. 1E). Мозговых оболочек очевидным менингеальные системе артерий и неполные результаты удаления загрязнений в конечной астроцитов культуры менингеальные клеток и фибробластов.

После ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методом, описанным здесь, основаны на астроциты подготовки культуру от грызунов новорожденных мозг, первоначально описанный Маккарти и де-Vellis в 1980 27. Модифицированный метод выделения и культуры корковых астроциты от послеродовой P1 до P4 мозга мыши, представленные здесь, быстро, дает чистую первичную астроциты и высокую воспроизводимость. Этот метод может быть легко перенесена, чтобы изолировать астроциты от других видов, таких как крысы или свиньи и из других областей мозга, таких как спинной мозг. В т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Поддерживается Fazit Foundation Graduate Fellowship СС, Федерального министерства образования и научных исследований (BMBF 01 ЭО 0803) в КБ и Европейской комиссией FP7 Грант PIRG08-GA-2010-276989, Neurex и Немецкого научно-исследовательского гранта Фонда Ща 1442 / 3-1 в CS авторы не имеют противоречивые финансовые интересы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Имя рабочего раствора Компания Номер в каталоге Конечная концентрация
Astrocyte медиакультуры
DMEM, высокий уровень глюкозы Life Technologies 31966-021
FBS, инактивированной Life Technologies 10082-147 Конечная концентрация: 10%
Пенициллина-стрептомицина Life Technologies 15140-122 Конечная концентрация: 1%
Решение для мозга копать тканиestion
HBSS Life Technologies 14170-088
2,5% трипсина Life Technologies 15090-046 Конечная концентрация: 0,25%
Другой
70% (объем / объем) этанола Рот 9065,2
Поли-D-лизин Millipore -003-E 50 мкг / мл
Воды PAA S15-012 класс клеточных культур
PBS PAA H15-002 класс клеточных культур
Попробуйте 0,05%psin-EDTA Life Technologies 25300-062
0,45 мкм стерильный фильтр Портняжная мышца 16555
3,5 см чашки Петри BD Falcon 353001
15 мл трубки сокола BD Falcon 352096
50 мл трубки сокола BD Falcon 352070
75 см 2 колбы культуры ткани BD Falcon 353136
Щипцы, тонкие Дюмон 2-1032, 2-1033 # 3с, № 5
Щипцы, телевизор с плоским наконечником KLS Martin 12-120-11
13 см хирургические ножницы Aesculap До н.э.-140-R
Стереомикроскоп Leica MZ7.5
Стереомикроскоп + камера Leica MZ16F; DFC320
Микроскоп + камера Zeiss, Canon Primo Vert; PowerShot A650 IS
Центрифугировать Eppendorf 5805000.017 Centrifuge5804R
Орбитальный Шейкер Thermo Scientific Шке 4450-1ce MaxQ 4450
Водяная баня Julabo SW20; 37 ° C

Ссылки

  1. Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
  2. Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation. Cell Metab. 14, 724-738 (2011).
  3. Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia - more than just brain glue. Nature. 457, 675-677 (2009).
  4. Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology. Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).
  5. Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression. BMC Neurosci. 11, 132(2010).
  6. Kaneko, N., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
  7. Min, R., Nevian, T. Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses. Nat. Neurosci. , (2012).
  8. Eroglu, C., Barres, B. A. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 468, 223-231 (2010).
  9. Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Action-potential modulation during axonal conduction. Science. 331, 599-601 (2011).
  10. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 Forthcoming.
  11. Alvarez, J. I., et al. The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence. Science. 334, 1727-1731 (2011).
  12. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  13. Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).
  14. Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles. Nature. 456, 745-749 (2008).
  15. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).
  16. Schachtrup, C., Moan, N. L. e, Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).
  17. Schachtrup, C., et al. Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage. J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).
  18. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).
  19. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113, 221-233 (2002).
  20. Dabir, D. V., et al. Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes. J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).
  21. Wisniewski, H. M., Wegiel, J. Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components. Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).
  22. Shin, J. Y., et al. Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity. J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).
  23. Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson's disease brains. Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).
  24. Lioy, D. T., et al. A role for glia in the progression of Rett's syndrome. Nature. 475, 497-500 (2011).
  25. Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. GFAP and its role in Alexander disease. Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).
  26. Beck, K., Schachtrup, C. Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta. Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).
  27. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  28. Siao, C. J., Tsirka, S. E. Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II. J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).
  29. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
  30. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).
  31. Anthony, T. E., Heintz, N. The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects. J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).
  32. Skoff, R. P., Knapp, P. E. Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages. Glia. 4, 165-174 (1991).
  33. Molofsky, A. V., et al. Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective. Genes Dev. 26, 891-907 (2012).
  34. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
  35. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, 799-811 (2011).
  36. Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60, 894-907 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Изоляция астроцитовкультура клетокдиссоциация тканейорбитальное встряхиваниеиммуноцитохимическое окрашиваниемаркеры астроцитовсмешанные кортикальные клеткипервичная культура клетокотделение глиальных клеток
Выделение и культуры мышь кортикальной астроциты
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.