Трансгенные мыши или вирусные векторы были использованы для увеличения экспрессии белка в легких. Однако, эти методы требуют больших затрат времени, технически сложных и есть вне целевой эффекты, которые может поставить в тупик результаты. Наша белка трансфекции протокол использует на основе липидов реагента трансфекции и microsprayer ультрадисперсных равномерно доставки активных белков в клетках легких.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Увеличение экспрессии белка позволяет исследователям лучше понять функциональную роль этого белка в регулировании ключевых биологических процессов1. В легких это обычно достигается с помощью генетических подходов, в которых используются трансгенные мыши2,3 или вирусные или невирусные векторы, повышающие уровень белка за счетувеличения экспрессии генов. Создание трансгенных мышей является дорогостоящим и трудоемким процессом, а случайная вставка трансгена или экспрессия хронического гена может изменить нормальное развитие легких и, таким образом, ограничить полезность модели5. В то время как условные трансгены предотвращаютпроблемы, связанные с хронической экспрессией генов6, мыши с реверсивным тетрациклин-управляемым трансактиватором (rtTA), которые используются для генерации условной экспрессии, развивают спонтанное расширение воздушного пространства7. Как и в случае с трансгенными препаратами, использование вирусных и невирусных векторовявляется дорогостоящим и может спровоцировать дозозависимые воспалительные реакции, которые искажают результаты9 и препятствуютэкспрессии10. Более того, эффективность повторных доз ограничена усилением иммунного ответа на вектор11,12. Исследователи разрабатывают аденоассоциированные вирусные векторы (AAV), которые вызывают меньше воспаления и имеют более длительную экспрессию в легких.
Используя β-галактозидазу, мы представляем метод быстрого и эффективного увеличения экспрессии белка в легких с использованием метода прямой трансфекции белка. Этот протокол смешивает фиксированное количество очищенного белка с 20 μл реагента для трансфекции на основе липидов (Pro-Ject, Pierce Bio) для обеспечения проникновения в саму легочную ткань. Затем смесь липосомальных белков вводится в легкие мышей через трахею с помощью микрораспылителя (Penn Century, Philadelphia, PA). Микрораспылитель создает мелкий шлейф жидкого аэрозоля по всем легким. С помощью этой методики мы продемонстрировали равномерное отложение введенного белка по всем дыхательным путям и альвеолам мышей14. Методика липидной трансфекции позволяет использовать небольшое количество белка для достижения эффекта. Это ограничивает воспалительную реакцию, которая в противном случае была бы спровоцирована введением большого количества белка. Действительно, используя эту методику, мы опубликовали, что нам удалось значительно увеличить активность PP2A в легких, не влияя на клеточную емкость промываниялегких15. Клеточная клетка промывания легких, взятая через 24 ч после провокационной провокации, была сопоставима с контрольной группой (контроль 27±4 против 31±5 трансфицированного альбумина; N=6 в группе). Более того, он повышает уровень белка, не вызывая изменений в развитии легких или архитектурных изменений, которые могут произойти в трансгенных моделях. Тем не менее, необходимость повторного введения может сделать этот метод менее благоприятным для исследований, изучающих эффекты долгосрочного увеличения экспрессии белка. Это особенно верно для белков с коротким периодом полураспада.
Протокол
1. Подготовка реагентов трансфекции белков
- Растворить Pro-Ject Реагент добавлением 250 мкл метанола и хлороформа в пробирку, содержащую сухой пленки.
- Vortex в течение 10-20 сек при максимальной скорости.
- Внесите 20 мкл Pro-Ject реагента в отдельные пробирки микроцентрифужные.
- Выпаривают растворитель путем размещения микроцентрифужных пробирках, содержащих Pro-Ject реагента при ламинарном потоке в течение не менее 6 часов при комнатной температуре. Она должна быть абсолютно сухой. Кроме того, сухой Pro-Ject реагента использованием вакуум-эксикаторе.
- Хранить трубы при -20 ° C. Они действительны в течение одного года при этой температуре.
2. Добавление белка Pro-Ject Реагент
- 50 мкл PBS, содержащего 2,0 мкг белка, представляющего интерес, в пробирку, содержащую 20 мкл сухого Pro-Ject реагента для трансфекции.
- После добавления белков, перемешать раствор при интенсивном перемешивании при низкой скорости Fили 3-5 с последующей инкубацией в течение 30 мин при комнатной температуре.
3. Интратрахеального введение белковых
- Обезболить мышей путем внутрибрюшинной инъекции кетамина / ксилазина (100 мг / кг и 10 мг / кг).
- После седативный эффект достигается, мыши подвешены на их верхних резцов с помощью специально разработанного платформе (Рис. 1).
- Использование щипцов и скрепкой как ларингоскоп, ротоглотки открывается таким образом, что катетер может быть введен (рис. 2). Голосовые связки визуализируются путем размещения источника света против трахеи мыши.
- Белок / проекта реагент смеси (50 мкл) вводили через трахею использованием Microsprayer Penn веке.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы продемонстрировать эффективность нашей методики мы использовали microsprayer (Penn Century) для введения в трахею мышей с 2 мкг мышь альбумин (Sigma), растворенного в 50 мкл PBS, содержащий 20 мкл Pro-Ject реагента для трансфекции. Альбумин обработанных мышей по сравнению с мышами, которых обрабатывали идентичным образом с 2 мкг бета-галактозидазы белка (Pierce Bio). Через двадцать четыре часа, мышей умерщвляли и легких были обработаны для гистологического анализа. Иммуногистохимическое для бета-галактозид...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Преимущество этого метода по сравнению с другими методами является то, что он производит увеличение уровня белка и активность в легочной ткани непосредственно. Кроме того, он проникает в наиболее дистальных отделах легких в отличие от отдыха только в дыхательные пути. Мы измерили повышение активности белка в рационе наших инъектата даже после lavaging Airways физиологическим раствором 15. Анализ тканей активности показывают, что белок в клетки и не только остаются в воздушные полости мыши. Это было дополнител...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья (7R01HL098528-03) и клинической премии Новатор FAMRI автора.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Микрораспылитель | Penn Century | FMJ-250 | |
| Бета-галактозидаза | Pierce Bio | 89850 | |
| Антитело бета-галактозидазы | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Сывороточный альбумин | мыши Sigma Aldrich | A3139 | |
| Кетамин/ксилазин | Sigma Aldrich | К113 |
Ссылки
- Glasser, S. W., Korfhagen, T. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Transgenic models for study of pulmonary development and disease. Am. J. Physiol. 267, 489-497 (1994).
- D'Armiento, J., Dalal, S. S., Okada, Y., Berg, R. A., Chada, K. Collagenase expression in the lungs of transgenic mice causes pulmonary emphysema. Cell. 71, 955-961 (1992).
- Foronjy, R. F., et al. Superoxide dismutase expression attenuates cigarette smoke- or elastase-generated emphysema in mice. Am. J. Respir Crit. Care Med. 173, 623-631 (2006).
- Foronjy, R., et al. The divergent roles of secreted frizzled related protein-1 (SFRP1) in lung morphogenesis and emphysema. Am. J. Pathol. 177, 598-607 (2010).
- Costa, R. H., Kalinichenko, V. V., Lim, L. Transcription factors in mouse lung development and function. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280, 823-838 (2001).
- Perl, A. K., Tichelaar, J. W., Whitsett, J. A. Conditional gene expression in the respiratory epithelium of the mouse. Transgenic Research. 11, 21-29 (2002).
- Morimoto, M., Kopan, R. rtTA toxicity limits the usefulness of the SP-C-rtTA transgenic mouse. Dev. Biol. 325, 171-178 (2009).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nature reviews. Genetics. 8, 573-587 (2007).
- Crystal, R. G., et al. Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis. Nat. Genet. 8, 42-51 (1994).
- Merkel, O. M., Zheng, M., Debus, H., Kissel, T. Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors. Bioconjugate Chemistry. 23, 3-20 (2012).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. J. Virol. 69, 2004-2015 (1995).
- Liu, Q., Muruve, D. A. Molecular basis of the inflammatory response to adenovirus vectors. Gene Ther. 10, 935-940 (2003).
- Pfeifer, C., Aneja, M. K., Hasenpusch, G., Rudolph, C. Adeno-associated virus serotype 9-mediated pulmonary transgene expression: effect of mouse strain, animal gender and lung inflammation. Gene Ther. 18, 1034-1042 (2011).
- Wallace, A. M. Protein phosphatase 2A regulates innate immune and proteolytic responses to cigarette smoke exposure in the lung. Toxicol. Sci. 126, 589-599 (2012).
- Wallace, A. M. Protein Phosphatase 2a (Pp2a) Regulates Innate Immune and Proteolytic Responses to Cigarette Smoke Exposure in the Lung. Toxicol. Sci. , (2012).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
