Cryosectioning дрожжи Сообщества для экспертизы флуоресценции Patterns

Краткое содержание

Мы представляем протокол для замораживания и cryosectioning дрожжей общин соблюдать внутренние модели флуоресцентные клетки. Метод основан на фиксации метанолом и октябре-вложение сохранить пространственное распределение клеток без инактивации флуоресцентных белков внутри сообщества.

Аннотация

Микробы, как правило, живут в общинах. Пространственной организации клеток внутри сообщества, как полагают, влияют на выживание и функционирование сообщества ^1. Оптические методы секционирования, в том числе конфокальной и двухфотонной микроскопии, доказали свою полезность для наблюдения пространственной организации бактерий и архей общинами ^2,3. Сочетание конфокальной микроскопии и физического срезов дрожжевых колоний показало, внутренней организации клеток ^4. Тем не менее, прямых оптических срезов с помощью конфокальной или двух-фотонного микроскопа были только способны достигать нескольких слоев клеток дрожжей в глубь колонии. Это ограничение, скорее всего, из-за сильного рассеяния света из дрожжевых клеток ^4.

Здесь мы представляем метод, основанный на установлении и cryosectioning получить пространственное распределение флуоресцентных клеток внутри общины Saccharomyces CEREVISIAE. Мы используем метанол в качестве закрепителясохранить пространственное распределение клеток. Исправлена ​​общины проникли с октября соединение, замороженные и cryosectioned в криостат. Флуоресценции из разделов раскрывает внутреннюю организацию флуоресцентные клетки внутри сообщества.

Примеры дрожжей общины, состоящей из штаммов выразив красного и зеленого флуоресцентного белка продемонстрировать потенциал cryosectioning метод выявления пространственного распределения флуоресцентные клетки, а также, что экспрессии генов в дрожжевых колоний ^2,3. Хотя наш акцент был сделан на общины Saccharomyces CEREVISIAE тот же метод потенциально может быть применен для изучения других микробных сообществ.

Протокол

1. Крепление дрожжи Сообщества

1. Рост дрожжей сообщества на мембранный фильтр (например, Millipore MF мембранный фильтр; рис. 2А). Этот протокол соответствует типичным сообщество менее 2х10 ^{8 ячеек} на 6 мм в диаметре мембранный фильтр.
2. Используйте кусок ватмана 541 фильтровальной бумаги, чтобы покрыть дно 1 см диаметра скважины (рис. 2В). Это ватмана будет использоваться в качестве носителя для передачи сообщества на более поздних стадиях. Добавить 1 мл на 100% метанола в скважины, и оставить хорошо в -20 ° C для температуры, чтобы уравновесить.
3. Положите жидкий N ₂ в сосуд Дьюара. Замораживание сообщества в жидкий азот путем погружения сообщества, по крайней мере 15 секунд в жидком N _{2 с помощью} пинцета (рис. 2С).
4. Передача замороженных сообщества и от -20 ° C метанола (рис. 2D). Убедитесь, что община держится горизонтально, когда погружая его в метанол.Подождите 20 мин. MF мембранный фильтр начинает распадаться на метанол.
5. Передача сообщества, используя носитель Whatman 541 фильтровальная бумага из метанола, а в холодную чашку Петри выдерживали при -20 ° C для испарения метанола (рис. 2E). При передаче, держать сообщество в верхней части носителя Whatman фильтр и отвлечь дополнительные капель метанола с использованием другой кусок плотного ватмана, прежде чем положить в холодную чашку Петри. Это будет гарантировать, что время испарения соответствует от образца к образцу.
6. Подождите 4-6 часа для испарения, пока перевозчик Whatman фильтр выглядит сухой. Вашем испарения оставляет остаточного метанола, который мешает секционирования. За сушки причины трещин и деформаций в общинах.
7. Возьмем пример из морозильной камере -20 ° C. Срежьте Whatman 541 фильтровальной бумаги не распространяется сообщества.
8. Сделайте прямоугольное кубических алюминиевой фольги контейнер, который является достаточно большим, что образец имеет по крайней мере ~ 2 мм от краякаждую сторону (рис. 2F). Поместите сообщества на нижней поверхности алюминиевой фольги контейнер; сразу покрытия образца с октября по 3 ~ 4 мм выше сообщество высоте. Если важно, ориентации образца может быть скорректирована на этом этапе с учетом сторон контейнера. Подождите 10 мин.
9. Поместите октября встраиваемый образца на металлической пластине на сухом льду, чтобы заморозить. Хранить замороженные общинах при температуре -20 ° C или -80 ° C морозильнике.

2. Секционирование Frozen Сообщества для флуоресцентной микроскопии

1. Установить температуру cryosection камере до -25 ° С и оставляют образцы в камере, пока ее температура не достигнет температуры в камере.
2. Установить образец на крио-гора после нанесения капли октября на горе. Распространение октября равномерно на стороне образца с открытыми Whatman фильтровальной бумаги (в нижней части контейнера), так что октябрь толщиной 2-3 мм. Пусть октября замораживание внутри криостата камеры перед SEctioning. Обеспечение рентабельности по октябрь 2-3 мм со всех сторон образца помогает сохранить целостность разделов.
3. Стороны блока образца октября могут быть использованы для выравнивания образца. Если образец не выровнен по отношению к лезвию, секционирования начнется с угла или стороны образца. Опора регулируется для того, чтобы лезвие режет строго вертикально (или горизонтально) поверхность образца блока.
4. Типичные разделы для дрожжей сообщества ~ 14 мкм толщины. После резки раздела, используйте стекло микроскопа храниться при комнатной температуре, чтобы собрать разделе, медленно приближаясь к слайд разреза разделе. В этом разделе будет таять и передать в стекле микроскопа. До 18 разделов могут быть перенесены на один слайд.
5. Хранить слайды при низких температурах, предпочтительно от -20 ° C до визуализации. Потеря сигнала минимальна при хранении в течение одной недели при 4 ° C. Для максимального сигнала флуоресценции, изображения предпочтительно сделано сразу же после секционирования.

Результаты

Флуоресцентные изображения вертикального сечения дрожжей общин содержащие красный и зеленый, помеченные конкурентной населения ⁶ показаны на рисунке 3. Эти общины состоят из двух прототрофный штаммов дрожжей и их конкуренции за общие ресурсы, в том числе пространстве, приводит к столбчатым моделей ^7, как показано на их вертикальных сечений. Резолюции вниз на одну ячейку может быть решен в поперечном сечении. Рисунок 3 сравнивает сечения повторных общин, полученные ...

Обсуждение

Процедура представленные здесь предлагается способ проверить внутреннюю структуру дрожжей общин. Шаг метанола крепления делает дрожжей колонии жесткого ⁸ и сохраняет целостность колонии, однако, это также приводит к усадке ^8, которые должны быть приняты во внимание при интерпретации результатов. Как правило, мы видим около 30% усадки в высоту колонии дрожжей, по сравнению с колониями непосредственно встроенные в октябре без фиксации ^9.

Чтобы избежать усадки, ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
100% метанола	JT Baker	9070-01
Tissue-Tek октября соединение	Andwin Научные	4583
Ватман Grade № 541 Количественные фильтровальной бумаги	Ватман	1541-047
Millipore-MF мембранных фильтров	Millipore	HAWP04700
Криостат	Leica	CM 1510 S